劉 暢,應(yīng)譯嫻,邱 岳,崔勝云(延邊大學(xué),長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室,吉林延吉 133002)

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HPLC法測定四種食用堅果種子中還原型谷胱甘肽(GSH)和蛋白巰基(P-SH)含量

劉 暢,應(yīng)譯嫻,邱 岳,崔勝云*
(延邊大學(xué),長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室,吉林延吉 133002)

用5,5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)為柱前衍生化試劑,采用細胞破壁、衍生化為一體的同步衍生化提取,HPLC梯度洗脫,測定了市售開心果、巴旦木、澳洲堅果、腰果干品中谷胱甘肽(GSH)和含半胱氨酸殘基的蛋白巰基(P-SH)含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種堅果均含較豐富的GSH和P-SH巰基,其含量分別為,開心果:GSH(1.2303±0.01126) μmol/g,P-SH(3.5414±0.0531) μmol/g;巴旦木:GSH(0.3069±0.0185) μmol/g,P-SH(1.9001±0.0194) μmol/g;澳洲堅果:GSH(1.5708±0.0216) μmol/g,P-SH(0.5905±0.0238) μmol/g;腰果:GSH(0.3373±0.0047) μmol/g,P-SH(2.2458±0.0225) μmol/g。在優(yōu)化的選定條件下,測定方法的回收率為99.37%～101.45%,GSH和P-SH測定檢測限分別為0.1386 μmol/g和0.2184 μmol/g。本研究對堅果活性成分的構(gòu)成及其巰基化合物在保健防病作用研究及其功能性食品開發(fā)均提供了有用的參考數(shù)據(jù)。

高效液相色譜法,堅果,谷胱甘肽,巰基化合物

堅果為被子植物成熟后的子房,通常把成熟后裹著堅硬外殼的種子作為食用部分,習(xí)慣上稱為堅果。堅果含有豐富的脂肪酸、蛋白質(zhì)、氨基酸及各類維生素及礦物質(zhì)等,長期食用堅果、對心血管疾病、糖尿病具有良好的預(yù)防作用,是備受人們青睞的功能性食品[1-2]。據(jù)文獻報道,堅果中除了上述的主成分之外,特定堅果中還含有其它具有重要活性功能的多酚類及其他揮發(fā)性微量成分[3-4],但迄今對具有重要生物活性功能的含半胱氨酸殘基的巰基肽和蛋白質(zhì)(P-SH),如還原型谷胱甘肽(GSH)等含量測定鮮見報道。

GSH和P-SH等含巰基化合物在生物體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能,是構(gòu)成抗氧化及抵御各類外源性脅迫的重要防御性物質(zhì)、具有清除過量活性氧自由基、促氨基酸吸收、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、維持胞內(nèi)氧化還原平衡等多種生物學(xué)功能[5-9]。研究表明:機體也攝入外源性的GSH等含巰基化合物,可有效抵抗各類脅迫、防止像心血管疾病、肝病、免疫系統(tǒng)紊亂、糖尿病及各種衰老有關(guān)的疾病[10-13]。因此,篩選富含GSH及P-SH等含巰基化合物的食材,對防病、治病及食品中活性成分及其功效關(guān)系的研究均具有實際意義。

本研究采用5,5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)巰基衍生化試劑,采用細胞破壁衍生化為一體的前處理方法,并篩選測定開心果、巴旦木、腰果、澳洲堅果中GSH和P-SH的巰基含量,為堅果的活性成分構(gòu)成及其功效的研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

開心果、巴旦木、澳洲堅果、腰果 均為市售;還原型谷胱甘肽(GSH) 沃凱牌，國藥試劑;半胱氨酸(Cys) Applichem,99%;5,5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸(DTNB) 沃凱牌，國藥試劑;三乙胺 色譜純，光復(fù)牌,98%;乙腈 色譜純，F(xiàn)isher;甲酸 色譜純，滬試牌,98%;實驗用水 三次蒸餾水。

圖1 巰基化合物的衍生化反應(yīng)Fig.1 Derivatizing reactions注:R-SH為小分子化合物,P-SH為巰基蛋白質(zhì)。

HP1100高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器(DAD) 美國安捷倫公司;色譜柱為Inertsil ODS-SP(5 μm,4.6 mm×150 mm) 日本GL Science公司;SCIENT-IID 超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器 江蘇昆山超聲儀器有限公司;Mini-10K微型離心機 珠海黑白醫(yī)學(xué)儀器有限公司;pHS-3C型實驗室酸度計 上海精密儀器有限公司;SZ-97全自動三重純水蒸餾器 上海亞榮公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 巰基化合物的衍生化反應(yīng) DTNB與半胱氨酸及含半胱氨酸殘基的化合物中的巰基在一定條件下(pH=7的磷酸鹽緩沖液,PBS)發(fā)生選擇性衍生化反應(yīng),見圖1。

如圖1所示,衍生化產(chǎn)物包括小分子巰基化合物,像半胱氨酸、還原型谷胱甘肽的水溶性衍生化產(chǎn)物(RS-TNB)和非水溶性的蛋白質(zhì)巰基衍生化產(chǎn)物(P-S-TNB),同時定量釋放出離子態(tài)的水溶性衍生化產(chǎn)物1-硫-5-硝基苯甲酸(TNB)或2-硝基-4-巰基-苯甲酸(NTB)。由于定量釋放出的TNB或NTB的含量提供包括蛋白巰基在內(nèi)的總巰基含量信息,因此HPLC法分別測定去蛋白后的RS-TNB和TNB或NTB的含量,可分別測定小分子巰基化合物和蛋白巰基含量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與樣品的制備 準(zhǔn)確稱取還原型谷胱甘肽(GSH)標(biāo)準(zhǔn)品0.0307 g和半胱氨酸(Cys)標(biāo)準(zhǔn)品0.0121 g,移入10 mL比色管中,加入三次蒸餾水稀釋定容,分別制備1.0×10-2mol/L GSH和Cys貯備液。稱取衍生化試劑DTNB 0.0792 g,向其中加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS,0.2 mol/L,pH=7)20 mL,制備DTNB最終濃度為1.0×10-2mol/L的緩沖溶液。

取一定量的堅果仁干品,用研缽將其研磨粉碎至粉末狀。稱量已經(jīng)粉碎好的樣品2.0 g移入50 mL具塞錐瓶中,加入20 mL含過量一定濃度DTNB(1.0×10-2mol/L)衍生化試劑的磷酸鹽緩沖溶液(PBS),用超聲細胞粉碎機破壁5 min、超聲波清洗儀振蕩30 min,離心,取上清液加入2倍體積的乙醇,靜置30 min除蛋白,抽濾,最后用8000 r/min離心機離心10 min,將離心后的上清液用針孔過濾器過濾,濾液作為待測樣品。

1.2.3 色譜條件 用紫外檢測器的HPLC測定水溶性衍生化產(chǎn)物RS-TNB及定量釋放出的TNB及NTB,其中TNB在可見區(qū)有較強的吸收,而半胱氨酸或谷胱甘肽等小分子衍生化產(chǎn)物(RS-TNB)和NTB在λmax=327 nm處均有較強的吸收[14]。為了消除TNB與NTB光譜特性差異導(dǎo)致的色譜測定的干擾,通過增加色譜洗脫液的酸度,使得在洗脫過程中TNB轉(zhuǎn)化成NTB,并采用二元流動相程序化洗脫方法消除干擾。所選用的二元流動相組成為:A相為含1%甲酸、0.07%三乙胺的水相;B相為含1%甲酸、0.07%三乙胺的乙腈有機相。梯度洗脫程序:90% A+10% B(0 min)；86% A+14% B(10 min)；72% A+28% B(15 min)；10% A+90% B(40 min)；10% A+90% B(45 min)；90% A+10% B(50 min)。其它色譜條件:流動相流速為0.8 mL/min,柱溫為25 ℃,進樣量為10 μL,檢測波長為327 nm。

1.2.4 衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性實驗 由于衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性與測定的準(zhǔn)確度密切相關(guān),故利用GSH(1.0×10-4mol/L)和DTNB(1.0×10-2mol/L)的PBS標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,通過測定混合溶液衍生化反應(yīng)后放置不同時間后的衍生化產(chǎn)物的色譜峰強度變化,探討工作時間內(nèi)衍生化產(chǎn)物中的巰基及其它可能的副反應(yīng)對測定準(zhǔn)確度的影響。

表1 衍生化產(chǎn)物的色譜峰強度Table 1 Chromatograms for the derivatized products

注：A代表色譜峰面積。

1.2.5 GSH和P-SH含量分析 由于在過量衍生化試劑(DTNB)的PBS緩沖溶液中,GSH和含半胱氨酸殘基的巰基化合物分別定量釋放出水溶性衍生化產(chǎn)物RS-TNB和NTB，且其色譜峰強度與巰基的濃度間呈良好的線性關(guān)系,其中NTB的色譜峰強度提供總的半胱氨酸殘基量的信息。因此,利用GSH作為基準(zhǔn)物質(zhì),利用外標(biāo)法分別測定水溶性小分子巰基化合物GSH含量和包括蛋白巰基在內(nèi)的總巰基含量。由于本實驗所測得樣品中,水溶性小分子巰基化合物只含有GSH,因此總巰基含量中扣去GSH含量即為P-SH的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

色譜數(shù)據(jù)處理是利用安捷倫公司HP-1100工作站軟件驅(qū)動,數(shù)據(jù)處理利用Origin 6.0畫圖和數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜測定

為了探討本實驗條件下,Cys及GSH中的巰基與DTNB衍生化反應(yīng)及色譜特性,用Cys和GSH標(biāo)準(zhǔn)品,在過量DTNB(1.0×10-4mol/L)的pH=7的PBS混合溶液中,分別測定了GSH(2.5×10-4mol/L)+DTNB混合溶液、GSH(1.0×10-4mol/L)+Cys(1.0×10-4mol/L)+DTNB混合溶液的色譜圖,結(jié)果見圖2。

圖2 GSH(A)、GSH+Cys(B)與DTNB混合PBS緩沖溶液的色譜圖Fig.2 Chromatograms for the mixture solutions of DTNB and GSH(A),GSH+Cys(B)in PBS buffer

圖3 開心果提取液(A)及該提取液加標(biāo)GSH和Cys后的色譜圖(B)Fig.3 Chromatograms for pistachio extract(A) and for the extract spiked with GSH and Cys(B)

如圖2所示,一定濃度的GSH和過量DTNB衍生化反應(yīng)后,分別觀察到衍生化產(chǎn)物GS-TNB、Cys-TNB、NTB及剩余DTNB的色譜峰。從所測定的衍生化產(chǎn)物的色譜峰強度分析(見表1)發(fā)現(xiàn):a.在等量的GSH和Cys混合溶液中,對應(yīng)的衍生化產(chǎn)物GS-TNB和Cys-TNB的色譜峰強度相近(色譜峰面積分別為356.4和373.2),說明在選定檢測器波長下,兩種衍生化產(chǎn)物的光譜特性相近;b.衍生化產(chǎn)物NTB色譜峰強度分別與GS-TNB及GS-TNB和Cys-TNB之和的色譜峰強度之比為0.8294(ANTB/AGS-TNB)和0.8355[ANTB/(AGS-TNB+ACys-TNB)],因兩者比值非常接近,說明定量釋放的NTB的色譜峰強度只與巰基的量有關(guān),而與GSH和Cys的碳骨架結(jié)構(gòu)無關(guān),即定量釋放的NTB的量只與半胱氨酸殘基中巰基數(shù)目有關(guān)。

圖3～圖6分別為四種堅果提取液樣品及該樣品中加標(biāo)GSH(1.0×10-4mol/L)和Cys(1.0×10-4mol/L)之后的色譜測定結(jié)果。

圖4 巴旦木提取液(A)及該提取液加標(biāo)GSH和Cys后的色譜圖(B)Fig.4 Chromatograms for prenus duleis extract(A) and for the extract spiked with GSH and Cys(B)

圖5 澳洲堅果提取液(A)及該提取液加標(biāo)GSH和Cys后的色譜圖(B)Fig.5 Chromatograms for macadamias extract(A) and for the extract spiked with GSH and Cys(B)

圖6 腰果提取液(A)及該提取液加標(biāo)GSH和Gys后的色譜圖(B)Fig.6 Chromatograms for cashew nut extract(A) and for the extract spiked with GSH and Cys

如圖3～圖6所示,四種堅果提取液中觀察到GS-TNB和NTB的色譜峰而觀察不到Cys-TNB的色譜峰,而對此樣品加標(biāo)Cys和GSH后明顯觀察到Cys-TNB和增加的GS-TNB的色譜峰,即樣品中檢測不到Cys含量,說明樣品中水溶性小分子巰基化合物只含有能檢測到的GSH。對樣品中衍生化產(chǎn)物的色譜峰強度進行了比較分析,結(jié)果見表2。

從表2的結(jié)果發(fā)現(xiàn):樣品中除了澳洲堅果NTB色譜峰面積略大于GS-TNB的色譜峰面積之外,其它的堅果樣品前者的色譜峰面積遠大于后者的色譜峰面積,其對應(yīng)的NTB的色譜峰面積和GS-TNB峰面積之比(ANTB/AGS-TNB)分別為:開心果3.34,巴旦木4.84,澳洲堅果1.14,腰果6.46,且該比值均較圖2B中的兩者峰面積之比0.8355大,說明樣品中含有較多的含半胱氨酸殘基的蛋白巰基且該蛋白巰基導(dǎo)致與DTNB反應(yīng)并釋放出額外的NTB,使其色譜峰面積增大。

表2 堅果提取液中衍生化產(chǎn)物色譜峰強度比較Table 2 Chromatograms of derivatized products obtained from nut extracts

2.2 衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性

由于樣品測定中色譜流出時間較長,樣品制備后需放置較長時間,這就需要樣品衍生化產(chǎn)物在工作時間內(nèi)必須要穩(wěn)定。表3為GSH、Cys及開心果提取液衍生化反應(yīng)后,放置不同時間后測得的各目標(biāo)衍生化產(chǎn)物的色譜峰面積和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表3 不同反應(yīng)時間后衍生化產(chǎn)物色譜峰強度變化及RSDTable 3 Deviations of chromatograms for the derivatized products with different time durations

表3的結(jié)果表明:無論在標(biāo)準(zhǔn)混合溶液或樣品提取液中,衍生化產(chǎn)物的色譜峰面積在6 h之內(nèi)變化并不明顯,其色譜峰面積變化的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.68%～1.62%范圍,說明衍生化產(chǎn)物在測定工作時間范圍內(nèi)基本穩(wěn)定,滿足準(zhǔn)確測定的要求。

2.3 回收率和檢測限

檢測限:配制5.0×10-4mol/L的GSH溶液,用PBS緩沖溶液逐級稀釋后在本實驗確定的最佳衍生化條件下與DTNB進行衍生化反應(yīng)后進樣分析,記錄色譜圖,以S/N=3時的相應(yīng)對照品進樣量為檢測限,GSH和-SH的檢測限分別為0.1386 μmol/g和0.2184 μmol/g。采用加標(biāo)回收率來進一步驗證測定方法的準(zhǔn)確度,分別量取一定量的堅果樣品提取液,然后再分別加入一定體積不同濃度的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液,根據(jù)上文中所述的GSH和總-SH的HPLC測定結(jié)果分別對加標(biāo)回收率進行計算,方法的回收率介于99.37%～101.45%之間,滿足準(zhǔn)確測定的要求。

表4 四種堅果中GSH、總巰基(-SH)、蛋白巰基P-SH測定結(jié)果Table 4 The amouts of GSH and total thiol as well as protein thiols detected in four different nuts

2.4 堅果中還原型谷胱甘肽與總巰基的含量

利用新配制的含有過量衍生化試劑DTNB(1.0×10-2mol/L)的PBS緩沖液分別配制不同濃度的GSH的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進行HPLC測定。實驗結(jié)果表明:GSH的衍生化產(chǎn)物(GS-TNB)及總巰基(-SH)的衍生化產(chǎn)物(NTB)的色譜峰面積均與標(biāo)準(zhǔn)品GSH的濃度呈良好線性關(guān)系。圖7為利用該線性關(guān)系制作的校正曲線和線性回歸方程。

圖7 GSH(A)和總巰基(B)含量測定的校正曲線Fig.7 Calibration pots for the detection of GSH(A)and total thiols(B)

如圖7所示,利用此線性關(guān)系平行測定三次,線性回歸方程分別為A=-5.01222+35.20443C和A=-51.87237+32.34489C,相關(guān)系數(shù)r分別為0.99996和0.99994。利用此校正曲線平行測定堅果樣品中的GSH和總-SH含量,結(jié)果見表4。

從表4中結(jié)果發(fā)現(xiàn):四種堅果中均含有豐富的GSH和P-SH,其中開心果中蛋白巰基含量最高,達3.5414 μmol/g,澳洲堅果中GSH含量最高,達1.5708 μmol/g。

3 結(jié)論

利用DTNB衍生化試劑,采用細胞破壁、衍生化為一體的同步前處理方法,避免了提取過程中胞外氧化性環(huán)境對巰基氧化變性導(dǎo)致的衍生化效率降低引起的靈敏度降低或漏檢,并用HPLC法首次測定了四種堅果中GSH和P-SH中的巰基含量,其含量分別為,開心果:GSH(1.2303±0.01126) μmol/g,P-SH(3.5414±0.0531) μmol/g;巴旦木:GSH(0.3069±0.0185) μmol/g,P-SH(1.9001±0.0194) μmol/g;澳洲堅果:GSH(1.5708±0.0216) μmol/g,P-SH(0.5905±0.0238) μmol/g;腰果:GSH(0.3373±0.0047) μmol/g,P-SH(2.2458±0.0225) μmol/g。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn):開心果中GSH和P-SH的含量均較高,澳洲堅果中GSH的含量較高,但P-SH含量相對較少,巴旦木和腰果中含有較低的GSH,但均含有較高的P-SH。本測定結(jié)果說明,上述堅果中的GSH含量均比目前所測定的大部分食材中的GSH含量高[15],而且也提供了堅果中游離蛋白巰基含量的信息,說明堅果的防病治病的活性功能也可能與其含較豐富的活性巰基化合物有關(guān),這也為功能性食材與巰基化合物的功效關(guān)系的研究提供了重要的參考數(shù)據(jù)。

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Dertermination of reduced glutathione(GSH)and thiols in proteins(P-SH) in 4 kinds of nuts by high performance liquid chromatography(HPLC)

LIU Chang,YING Yi-xian,QIU Yue,CUI Sheng-yun*

(Key Laboratory of Natural Resources & Functional Molecules of
Changbai Mountain of Ministry of Education,Yanbian University,Yanji 133002,China)

The contents of reduced glutathione(GSH)and protein thiols in prunus duleis,cashew nut,pistachio nut,macadamia nut were detected by pre-column derivatization HPLC method using 5,5′-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid(DTNB)as derivatizing agent with concomitant cell rupture sample pretreatments. The results showed that detected nuts contained relatively abundant GSH and thiols in P-SH. The amounts detected were GSH(1.2303±0.01126) μmol/g,P-SH(3.5414±0.0531) μmol/g for pistachio nut,GSH(0.3069±0.0185) μmol/g,P-SH(1.9001±0.0194) μmol/g for prenus duleis,GSH(1.5708±0.0216) μmol/g,P-SH(0.5905±0.0238) μmol/g for macadamia nut,GSH(0.3373±0.0047) μmol/g,P-SH(2.2458±0.0225) μmol/g for cashew nut respectively. The recoveries of the methods were 99.37%～101.45%,and detection limits were 0.1386 μmol/g for GSH and 0.2184 μmol/g for protein thiols. The results provided a useful data for the application of these nuts for the healthcare.

HPLC;nuts;glutathione;thiol compounds

2016-12-20

劉暢(1991-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：植物活性成分分析，E-mail：1007687550@qq.com。

*通訊作者:崔勝云(1957-)，男，博士，教授，研究方向：植物活性成分分析，E-mail：huaxuexi@ybu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金資助項目(21165021)。

TS255.6

A

1002-0306(2017)14-0001-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.001