HPLC法同時測定大鼠血漿中3種CYP 450探針?biāo)幬锏臐舛?/h1>
2017-08-09 01:28:55李思聰袁定勝楊銳王斌李金良李旭廷
中國獸藥雜志 2017年7期
李思聰，袁定勝，楊銳，王斌，李金良，李旭廷*
(1.四川省畜牧科學(xué)研究院獸藥研究所，成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都610066)
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HPLC法同時測定大鼠血漿中3種CYP 450探針?biāo)幬锏臐舛?/p>
李思聰1,2，袁定勝1,2，楊銳1,2，王斌1,2，李金良1,2，李旭廷1,2*
(1.四川省畜牧科學(xué)研究院獸藥研究所，成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都610066)
建立了同時測定大鼠血漿中3種細胞色素P450(CYP450)亞型酶( CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4)活性的Cocktail探針?biāo)幬锏母咝б合嗌V(HPLC)檢測方法。分別取非那西丁，咪達唑侖和甲苯磺丁脲三種探針?biāo)幬?，制成混合探針溶液，用一種提取溶劑系統(tǒng)對3種探針?biāo)幬锿瑫r提取，并用高效液相色譜法同時測定3種探針?biāo)幬锏难帩舛?，并對其進行專屬性、線性范圍及檢測限、精密度、回收率、穩(wěn)定性的驗證。色譜條件選用Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-50 mM磷酸鹽緩沖對(45∶55，pH 3.2)；檢測波長230 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃。結(jié)果表明：非那西丁、咪達唑侖、甲苯磺丁脲的線性范圍分別為0.10～10.0 μg/mL(r=0.9993)，0.05～5.0 μg/mL(r=0.9999)，0.10～50.0 μg/mL(r=0.9991)；方法回收率分別為79.28%～87.91%，76.43%～85.36%，82.79%～90.61%。該HPLC檢測方法快捷，準(zhǔn)確，靈敏度高，可以在同一次試驗中，同時測定大鼠血漿中3種CYP450亞酶探針?biāo)幬?非那西丁，甲苯磺丁脲，咪達唑侖)的濃度，各探針?biāo)幬锏奈辗宸蛛x完全，無干擾，可用于開展某些受試藥物對大鼠CYP450的3個主要亞型酶(CYP1A2，CYP2C9，CYP3A4)調(diào)控作用的相關(guān)研究，從而為相關(guān)肝藥酶代謝研究提供方法學(xué)參考。
細胞色素P450；高效液相色譜法；非那西??；甲苯磺丁脲；咪達唑侖
細胞色素P450(CYP450)是藥物代謝過程中的關(guān)鍵酶，是一個具有大量底物特異性的同工酶大家族，負責(zé)生物體內(nèi)絕大多數(shù)外源性化合物的生物轉(zhuǎn)化[1-2]，可代謝大約25萬種外源性物質(zhì)[3]。CYP450涉及100余種亞型，其中最主要亞型是CYP3A4(代謝的藥物占全部藥物的50%)，CYP2C9(代謝藥物約占10%)和CYP1A2(代謝藥物約占4%)，是藥物代謝和毒理學(xué)研究的重要指標(biāo)[1]。鑒于CYP450在藥物代謝過程中的重要性，國內(nèi)外均把藥物對CYP450的影響作為藥物聯(lián)用、食藥合用、草藥合用的重要依據(jù)[4-6]。Cocktail探針?biāo)幬锓ㄊ茄芯克幬飳YP450酶活性影響及藥物相互作用的主要手段，通過測定特異性探針?biāo)幬锏难帩舛却笮￠g接反映CYP450各亞型的活性情況[7-10]。本研究采用Cocktail探針?biāo)幬锓ǎ琀PLC同時測定大鼠血漿中CYP1A2，CYP2C9，CYP3A4的探針?biāo)幬锓悄俏鞫 ⒓妆交嵌‰搴瓦溥_唑侖的濃度，并對該HPLC法進行了方法學(xué)研究，以期為開展某些藥物對大鼠CYP1A2，CYP2C9和CYP3A4的調(diào)控作用和相關(guān)藥物相互作用研究等提供方法學(xué)參考。
1 材 料
1.1 儀器 UltiMate 3000型高效液相色譜儀，美國戴安公司；WH-3微型漩渦混合儀，上海瀘西分析儀器廠；Eppendorf MiniSpin plus離心機，德國Eppendorf公司；CQ250超聲洗滌器，上海超聲儀器廠；MD200-1氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司。
1.2 藥物與試劑 非那西丁(批號100095-201205；含量98.0%)，甲苯磺丁脲(批號100500-200801；含量98.5%)，卡馬西平(批號100142-201105；含量99.7%)，咪達唑侖對照品(批號171265-201402；含量99.8%)，以上對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。
1.3 實驗動物 健康清潔級SD雄性大鼠，體重200±20 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK(川)2013-24。整個試驗期間，于室溫20～24 ℃下飼養(yǎng)，每天采食供給飼料及純化水，采血前12 h限飼。
2 方 法
2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-50 mM磷酸鹽緩沖對(45∶55，pH 3.2)；紫外檢測波長230 nm；流速1.0 mL /min；柱溫35 ℃。
2.2 溶液配制
2.2.1 對照品儲備液的制備 分別取干燥至恒重的非那西丁，咪達唑侖，甲苯磺丁脲和卡馬西平(內(nèi)標(biāo))對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含4 μg的儲備液，4 ℃避光冷藏備用。
2.2.2 Cocktail混合探針液的制備 精密稱取非那西丁40 mg，甲苯磺丁脲20 mg，咪達唑侖10 mg至同一EP管中，加入0.2% CMC-Na水溶液10 mL，渦旋混勻，超聲10 min， 即配制成Cocktail混合探針液。該混合探針液于大鼠給藥前新鮮配制，配好后立即使用。
2.3 大鼠血漿樣品處理 取大鼠血漿100 μL，加入含內(nèi)標(biāo)卡馬西平的甲醇溶液(4 μg/mL)100 μL，渦旋30 s，超聲10 min后，13000 r/min離心5 min，棄沉淀，取上清液，0.45 μm濾膜過濾，取20 μL進樣測定。
2.4 方法學(xué)驗證
2.4.1 專屬性試驗 分別取大鼠空白血漿；含有卡馬西平，非那西丁，咪達唑侖及甲苯磺丁脲對照品的大鼠空白血漿樣品；大鼠灌胃Cocktail混合探針液后0.5 h尾靜脈采集的血漿樣品，按照2.3項進行血漿樣品處理；另外取卡馬西平，非那西丁，咪達唑侖及甲苯磺丁脲混合對照品。上述4個待測樣品，參照2.1項色譜條件，分別取20 μL進樣，記錄色譜圖。
2.4.2 線性范圍和檢測限 取6只試管并分別精確加入一定量的非那西丁，甲苯磺丁脲，咪達唑侖對照品儲備液，40 ℃氮氣流下?lián)]干甲醇溶液，殘留物中再分別精密加入含內(nèi)標(biāo)卡馬西平的甲醇儲備液(4 μg/mL)100 μL和大鼠空白血漿100 μL，使各組分中藥物濃度分別為非那西丁0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.0 μg/mL；甲苯磺丁脲0.10，1.00，2.00，5.00， 25.0，50.0 μg/mL；咪達唑侖0.05，0.10，0.50，1.00，2.50，5.00 μg/mL，渦旋30 s，超聲10 min后，13000 r/min離心5 min，棄沉淀，取上清液，0.45 μm濾膜過濾，按2.1項下條件進樣20 μL，測定分析，以各組分探針?biāo)幬锏臐舛葹闄M坐標(biāo)，探針?biāo)幬锖蛢?nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得非那西丁、甲苯磺丁脲、咪達唑侖的回歸方程。
2.4.3 精密度試驗 分別取非那西丁0.50，5.00，10.0 μg/mL，咪達唑侖0.10，0.50，1.00 μg/mL，甲苯磺丁脲5.0，25.0，50.0 μg/mL 3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，各取5份，按2.3項下方法進行血漿樣品處理，按2.1項下條件測定，于同1 d內(nèi)進樣5次測定，求得日內(nèi)RSD；連續(xù)測定5 d，求得日間RSD。
2.4.4 回收率試驗 分別取非那西丁0.50，5.00，10.0 μg/mL，甲苯磺丁脲5.0，25.0，50.0 μg/mL，咪達唑侖0.10，0.50，1.00 μg/mL 3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，各5份，按2.3項下方法進行血漿樣品處理，按2.1項下條件測定，用已求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算濃度，并以測定值的平均值與配制的理論濃度比較，計算相對回收率。
2.4.5 穩(wěn)定性試驗 分別配制含3個探針?biāo)幬锏牡汀⒅?、高濃度的?biāo)準(zhǔn)血漿樣品，于室溫放置24 h，-20 ℃凍存30 d，反復(fù)凍融3次。按2.3項下方法處理，按2.1項下條件測定，記錄探針?biāo)幏迕娣e和內(nèi)標(biāo)峰面積，計算樣品濃度及RSD。
2.5 應(yīng)用 選取SD雄性大鼠8只(體重200±20 g)，按照10 mL/kg B.W.灌胃給藥Cocktail混合探針液，灌胃后0.083，0.25，0.50，0.75，1，2，4，24 h尾靜脈取血，每次取血量0.2 mL。血樣采集后置于肝素抗凝的試管中，4000 r/min離心5 min分離得到血漿，按照2.3項下方法進行血漿處理，按2.1項色譜條件，各取20 μL進樣，記錄色譜圖和峰面積。
3 結(jié)果與分析
3.1 專屬性試驗 在上述色譜條件下測得色譜圖如圖1所示，分別為空白血漿(圖1-A)，卡馬西平、非那西丁、咪達唑侖及甲苯磺丁脲混合對照品(圖1-B)，含卡馬西平、非那西丁、咪達唑侖及甲苯磺丁脲對照品的大鼠空白血漿(圖1-C)，大鼠灌胃Cocktail混合探針液后0.5 h血漿樣品(圖1-D)。從圖1可見，非那西丁，咪達唑侖及甲苯磺丁脲與內(nèi)標(biāo)卡馬西平，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)分離良好。
3.2 線性范圍和檢測限 探針?biāo)幬镏?，非那西丁的回歸方程為：Y=0.7878X-0.0306，r=0.9993；甲苯磺丁脲的線性方程為：Y=0.6372X+0.0751，r=0.9991；咪達唑侖的線性方程為：Y=0.975X-0.0087，r=0.9999。線性范圍分別為：非那西丁0.10～10.0 μg/mL；甲苯磺丁脲0.10～50.0 μg/mL；咪達唑侖0.05～5.0 μg/mL，最低定量限(S/N=10)非那西丁、甲苯磺丁脲均為0.10 μg/mL，咪達唑侖為0.05 μg/mL。
1-A：空白血漿(blank plasma)；1-B：探針?biāo)幬?卡馬西平(probe drugs+carbamazepine)；1-C：空白血漿+探針?biāo)幬?卡馬西平(blank plasma +probe drugs+carbamazepine)；1-D：大鼠給予探針?biāo)幬锖?.5 h血漿+卡馬西平(plasma after rat administration of probe drugs +carbamazepine)1. 非那西丁(phenacetin)；2. 咪達唑侖(midazolam)；3. 卡馬西平(carbamazepine)；4.甲苯磺丁脲(tolbutamide)圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms
3.3 精密度試驗 表1精密度試驗結(jié)果表明，不同濃度非那西丁、咪達唑侖、甲苯磺丁脲日內(nèi)、日間精密度RSD均小于7%，精密度良好。
3.4 回收率試驗 表1回收率試驗結(jié)果表明，不同濃度非那西丁、咪達唑侖、甲苯磺丁脲回收率均值均在75%以上，回收率穩(wěn)定。
3.5 穩(wěn)定性試驗 表2穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，含3種探針?biāo)幬锏?、中、高濃度的?biāo)準(zhǔn)血漿樣品經(jīng)室溫存放24 h，-20 ℃凍存30 d，反復(fù)凍融3次后，非那西丁、甲苯磺丁脲、咪達唑侖的低、中、高濃度RSD均小于9%，血漿樣品穩(wěn)定性良好。
表1 探針?biāo)幬锏木芏群突厥章式Y(jié)果Tab 1 The precisions and recoveries of probes
表2 探針?biāo)幬锏姆€(wěn)定性考察Tab 2 Stabilization determination of probes
3.6 應(yīng)用 由圖2所得均值藥-時曲線所示，本測試方法可用于同時測定大鼠體內(nèi)非那西丁、甲苯磺丁脲、咪達唑侖的血藥濃度，可用來評價藥物對CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4的影響。
2-A：非那西丁(phenacetin)；2-B：甲苯磺丁脲(tolbutamide)；2-C：咪達唑侖(midazolam)圖2 大鼠灌胃3種探針?biāo)幬锖蟮难獫{濃度均值-時間曲線圖Fig 2 Concentration-time curves of the 3 probe drugs in rat plasma after administration
4 討論與小結(jié)
在CYP450探針?biāo)幬镞x擇中，CYP1A2主要的探針?biāo)幬镉锌Х纫騕11-12]、茶堿[13]和非那西丁[14-16]，本研究CYP1A2探針?biāo)幬锖Y選時發(fā)現(xiàn)茶堿與血漿內(nèi)源性物質(zhì)有干擾，咖啡因?qū)儆趪夜苤祁愃幬铮徺I不便，故選用非那西丁作為CYP1A2探針底物；CYP2C9探針?biāo)幬镏饕屑妆交嵌‰錥14,16]和華法林[17]，然而Holbrook AM等[18]報道華法林容易和多種食物及藥物相互作用而導(dǎo)致嚴重不良反應(yīng)，因此選用甲苯磺丁脲作為CYP2C9探針底物；咪達唑侖是評價CYP3A4代謝活性的常用探針?biāo)幬?，其既可靜脈用藥，也可口服給藥，吸收快速且完全，不良反應(yīng)輕微，滿足安全、快速、特異性強等檢測要求，而且與眾多的CYP3A4底物有著良好的相關(guān)性[19]。綜上所述，本實驗選擇非那西丁、甲苯磺丁脲、咪達唑侖作為大鼠CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4的探針?biāo)幬铩?/p>
本研究曾對3種探針?biāo)幬锛皟?nèi)標(biāo)卡馬西平進行全波長掃描，各藥物在230 nm均有較大紫外吸收；采用甲醇-50 mM磷酸鹽緩沖對(65∶35)作為流動相[20]，結(jié)果咪達唑侖與非那西丁出峰時間重疊，將甲醇濃度逐步降低，咪達唑侖與非那西丁逐漸分離，但甲苯磺丁脲保留時間也隨之延后，降至35%時，其保留時間超過60 min，最終確定甲醇濃度在45%時，可有效縮短檢測時間；當(dāng)流動相pH大于3.5時，甲苯磺丁脲具有明顯的拖尾現(xiàn)象，pH3.0時，咪達唑侖也出現(xiàn)拖尾，通過優(yōu)化，流動相pH調(diào)為3.2。故最終確定流動相為甲醇-50 mM磷酸鹽緩沖對(45∶55；pH3.2)，檢測波長230 nm，在該條件下3種探針?biāo)幬锛皟?nèi)標(biāo)分離完全，峰形良好，無雜質(zhì)峰干擾，血漿內(nèi)源性物質(zhì)對3種探針?biāo)幬锛皟?nèi)標(biāo)的分離測定均無干擾。通過方法學(xué)考察表明該HPLC檢測方法靈敏度高，專屬性好，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定可靠，可用于生物樣本分析研究。動物實驗表明，用該HPLC檢測法研究藥物在體內(nèi)代謝具有較好的靈敏度，可以滿足動物實驗的要求。
本研究建立的方法，可在同一色譜條件下測定3種CYP450亞型酶探針?biāo)幬锏臐舛龋蚨蓪Ω鱽喰兔傅幕钚赃M行同時測定，可同時獲取經(jīng)多個代謝途徑的信息，且操作簡便，快捷，成本較低。為研究藥物對CYP450活性的影響，本方法對于評價藥物的安全性、預(yù)測代謝性藥物相互作用以及指導(dǎo)臨床合理用藥具有積極的意義。
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(編輯：侯向輝)
Simultaneous Determination of Three Probe Drugs of CYP450 in Rat Plasma by HPLC
LI Si-cong1,2, YUAN Ding-sheng1,2, YANG Rui1,2, WANG Bin1,2, LI Jin-liang1,2, LI Xu-ting1,2*
(1.InstituteofVeterinaryPhamacology,SichuanAnimalScienceAcademy,Chengdu610066,China; 2.AnimalBreedingandGeneticsKeyLaboratoryofSichuanProvince,Chengdu610066,China)
LIXu-ting,E-mail: 676049640@qq.com
To provide a methodological reference for the study of metabolism of liver enzymes, an HPLC method for simultaneously determining three cytochrome P450(CYP) (CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4) probe drugs in rat plasma was established. Cocktail probe solution was prepared by mixing three specific probe drugs of CYP1A2, 2C9 and 3A4(phenacetin, tolbutamide and midazolam, respectively). The three drugs were extracted with one solvent system, determined in rat plasma by HPLC, and verified the specificity, linear range, detection limit, precision, recovery and stability. The isolation was performed on a Diamonsil C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with mobile phase consisting of methanol -50 mM phosphate buffer (45∶55; pH3.2); the detection wavelength was 230 nm; the flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 35 ℃. Results showed that there were good linearity of phenacetin, midazolam and tolbutamide in the ranges of 0.10～10.0 μg/mL(r=0.9993), 0.05～5.0 μg/mL(r=0.9999), 0.10～50.0 μg/mL(r=0.9991). The recoveries were 79.28%～87.91%, 76.43%～85.36%, 82.79%～90.61%, respectively. The method is rapid, accurate, sensitive and suitable for simultaneously determining the concentrations of three CYP450 probe drugs(phenacetin, tolbutamide and midazolam) in rat plasma, the three drugs and the internal standard(carbamazepine) were separated well under the above HPLC conditions, which could be employed in evaluating the effects of drugs on rat’s CYP450 subtype enzymes(CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4) activities and in relatived studies.
CYP450; HPLC; phenacetin; tolbutamide; midazolam
四川省公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目(SASA2014A13)；四川省財政運行專項(SASA2014CZYX010) 作者簡介： 李思聰，碩士，從事獸藥基礎(chǔ)研究與開發(fā)工作。
李旭廷。E-mail：676049640@qq.com
10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.05
2017-02-07
A
1002-1280 (2017) 07-0021-07
S859.2
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李思聰，袁定勝，楊銳，王斌，李金良，李旭廷*
(1.四川省畜牧科學(xué)研究院獸藥研究所，成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都610066)
?
HPLC法同時測定大鼠血漿中3種CYP 450探針?biāo)幬锏臐舛?/p>
李思聰1,2，袁定勝1,2，楊銳1,2，王斌1,2，李金良1,2，李旭廷1,2*
(1.四川省畜牧科學(xué)研究院獸藥研究所，成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都610066)
建立了同時測定大鼠血漿中3種細胞色素P450(CYP450)亞型酶( CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4)活性的Cocktail探針?biāo)幬锏母咝б合嗌V(HPLC)檢測方法。分別取非那西丁，咪達唑侖和甲苯磺丁脲三種探針?biāo)幬?，制成混合探針溶液，用一種提取溶劑系統(tǒng)對3種探針?biāo)幬锿瑫r提取，并用高效液相色譜法同時測定3種探針?biāo)幬锏难帩舛?，并對其進行專屬性、線性范圍及檢測限、精密度、回收率、穩(wěn)定性的驗證。色譜條件選用Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-50 mM磷酸鹽緩沖對(45∶55，pH 3.2)；檢測波長230 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃。結(jié)果表明：非那西丁、咪達唑侖、甲苯磺丁脲的線性范圍分別為0.10～10.0 μg/mL(r=0.9993)，0.05～5.0 μg/mL(r=0.9999)，0.10～50.0 μg/mL(r=0.9991)；方法回收率分別為79.28%～87.91%，76.43%～85.36%，82.79%～90.61%。該HPLC檢測方法快捷，準(zhǔn)確，靈敏度高，可以在同一次試驗中，同時測定大鼠血漿中3種CYP450亞酶探針?biāo)幬?非那西丁，甲苯磺丁脲，咪達唑侖)的濃度，各探針?biāo)幬锏奈辗宸蛛x完全，無干擾，可用于開展某些受試藥物對大鼠CYP450的3個主要亞型酶(CYP1A2，CYP2C9，CYP3A4)調(diào)控作用的相關(guān)研究，從而為相關(guān)肝藥酶代謝研究提供方法學(xué)參考。
細胞色素P450；高效液相色譜法；非那西??；甲苯磺丁脲；咪達唑侖
細胞色素P450(CYP450)是藥物代謝過程中的關(guān)鍵酶，是一個具有大量底物特異性的同工酶大家族，負責(zé)生物體內(nèi)絕大多數(shù)外源性化合物的生物轉(zhuǎn)化[1-2]，可代謝大約25萬種外源性物質(zhì)[3]。CYP450涉及100余種亞型，其中最主要亞型是CYP3A4(代謝的藥物占全部藥物的50%)，CYP2C9(代謝藥物約占10%)和CYP1A2(代謝藥物約占4%)，是藥物代謝和毒理學(xué)研究的重要指標(biāo)[1]。鑒于CYP450在藥物代謝過程中的重要性，國內(nèi)外均把藥物對CYP450的影響作為藥物聯(lián)用、食藥合用、草藥合用的重要依據(jù)[4-6]。Cocktail探針?biāo)幬锓ㄊ茄芯克幬飳YP450酶活性影響及藥物相互作用的主要手段，通過測定特異性探針?biāo)幬锏难帩舛却笮￠g接反映CYP450各亞型的活性情況[7-10]。本研究采用Cocktail探針?biāo)幬锓ǎ琀PLC同時測定大鼠血漿中CYP1A2，CYP2C9，CYP3A4的探針?biāo)幬锓悄俏鞫 ⒓妆交嵌‰搴瓦溥_唑侖的濃度，并對該HPLC法進行了方法學(xué)研究，以期為開展某些藥物對大鼠CYP1A2，CYP2C9和CYP3A4的調(diào)控作用和相關(guān)藥物相互作用研究等提供方法學(xué)參考。
1 材 料
1.1 儀器 UltiMate 3000型高效液相色譜儀，美國戴安公司；WH-3微型漩渦混合儀，上海瀘西分析儀器廠；Eppendorf MiniSpin plus離心機，德國Eppendorf公司；CQ250超聲洗滌器，上海超聲儀器廠；MD200-1氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司。
1.2 藥物與試劑 非那西丁(批號100095-201205；含量98.0%)，甲苯磺丁脲(批號100500-200801；含量98.5%)，卡馬西平(批號100142-201105；含量99.7%)，咪達唑侖對照品(批號171265-201402；含量99.8%)，以上對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。
1.3 實驗動物 健康清潔級SD雄性大鼠，體重200±20 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK(川)2013-24。整個試驗期間，于室溫20～24 ℃下飼養(yǎng)，每天采食供給飼料及純化水，采血前12 h限飼。
2 方 法
2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-50 mM磷酸鹽緩沖對(45∶55，pH 3.2)；紫外檢測波長230 nm；流速1.0 mL /min；柱溫35 ℃。
2.2 溶液配制
2.2.1 對照品儲備液的制備 分別取干燥至恒重的非那西丁，咪達唑侖，甲苯磺丁脲和卡馬西平(內(nèi)標(biāo))對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含4 μg的儲備液，4 ℃避光冷藏備用。
2.2.2 Cocktail混合探針液的制備 精密稱取非那西丁40 mg，甲苯磺丁脲20 mg，咪達唑侖10 mg至同一EP管中，加入0.2% CMC-Na水溶液10 mL，渦旋混勻，超聲10 min， 即配制成Cocktail混合探針液。該混合探針液于大鼠給藥前新鮮配制，配好后立即使用。
2.3 大鼠血漿樣品處理 取大鼠血漿100 μL，加入含內(nèi)標(biāo)卡馬西平的甲醇溶液(4 μg/mL)100 μL，渦旋30 s，超聲10 min后，13000 r/min離心5 min，棄沉淀，取上清液，0.45 μm濾膜過濾，取20 μL進樣測定。
2.4 方法學(xué)驗證
2.4.1 專屬性試驗 分別取大鼠空白血漿；含有卡馬西平，非那西丁，咪達唑侖及甲苯磺丁脲對照品的大鼠空白血漿樣品；大鼠灌胃Cocktail混合探針液后0.5 h尾靜脈采集的血漿樣品，按照2.3項進行血漿樣品處理；另外取卡馬西平，非那西丁，咪達唑侖及甲苯磺丁脲混合對照品。上述4個待測樣品，參照2.1項色譜條件，分別取20 μL進樣，記錄色譜圖。
2.4.2 線性范圍和檢測限 取6只試管并分別精確加入一定量的非那西丁，甲苯磺丁脲，咪達唑侖對照品儲備液，40 ℃氮氣流下?lián)]干甲醇溶液，殘留物中再分別精密加入含內(nèi)標(biāo)卡馬西平的甲醇儲備液(4 μg/mL)100 μL和大鼠空白血漿100 μL，使各組分中藥物濃度分別為非那西丁0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.0 μg/mL；甲苯磺丁脲0.10，1.00，2.00，5.00， 25.0，50.0 μg/mL；咪達唑侖0.05，0.10，0.50，1.00，2.50，5.00 μg/mL，渦旋30 s，超聲10 min后，13000 r/min離心5 min，棄沉淀，取上清液，0.45 μm濾膜過濾，按2.1項下條件進樣20 μL，測定分析，以各組分探針?biāo)幬锏臐舛葹闄M坐標(biāo)，探針?biāo)幬锖蛢?nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得非那西丁、甲苯磺丁脲、咪達唑侖的回歸方程。
2.4.3 精密度試驗 分別取非那西丁0.50，5.00，10.0 μg/mL，咪達唑侖0.10，0.50，1.00 μg/mL，甲苯磺丁脲5.0，25.0，50.0 μg/mL 3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，各取5份，按2.3項下方法進行血漿樣品處理，按2.1項下條件測定，于同1 d內(nèi)進樣5次測定，求得日內(nèi)RSD；連續(xù)測定5 d，求得日間RSD。
2.4.4 回收率試驗 分別取非那西丁0.50，5.00，10.0 μg/mL，甲苯磺丁脲5.0，25.0，50.0 μg/mL，咪達唑侖0.10，0.50，1.00 μg/mL 3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，各5份，按2.3項下方法進行血漿樣品處理，按2.1項下條件測定，用已求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算濃度，并以測定值的平均值與配制的理論濃度比較，計算相對回收率。
2.4.5 穩(wěn)定性試驗 分別配制含3個探針?biāo)幬锏牡汀⒅?、高濃度的?biāo)準(zhǔn)血漿樣品，于室溫放置24 h，-20 ℃凍存30 d，反復(fù)凍融3次。按2.3項下方法處理，按2.1項下條件測定，記錄探針?biāo)幏迕娣e和內(nèi)標(biāo)峰面積，計算樣品濃度及RSD。
2.5 應(yīng)用 選取SD雄性大鼠8只(體重200±20 g)，按照10 mL/kg B.W.灌胃給藥Cocktail混合探針液，灌胃后0.083，0.25，0.50，0.75，1，2，4，24 h尾靜脈取血，每次取血量0.2 mL。血樣采集后置于肝素抗凝的試管中，4000 r/min離心5 min分離得到血漿，按照2.3項下方法進行血漿處理，按2.1項色譜條件，各取20 μL進樣，記錄色譜圖和峰面積。
3 結(jié)果與分析
3.1 專屬性試驗 在上述色譜條件下測得色譜圖如圖1所示，分別為空白血漿(圖1-A)，卡馬西平、非那西丁、咪達唑侖及甲苯磺丁脲混合對照品(圖1-B)，含卡馬西平、非那西丁、咪達唑侖及甲苯磺丁脲對照品的大鼠空白血漿(圖1-C)，大鼠灌胃Cocktail混合探針液后0.5 h血漿樣品(圖1-D)。從圖1可見，非那西丁，咪達唑侖及甲苯磺丁脲與內(nèi)標(biāo)卡馬西平，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)分離良好。
3.2 線性范圍和檢測限 探針?biāo)幬镏?，非那西丁的回歸方程為：Y=0.7878X-0.0306，r=0.9993；甲苯磺丁脲的線性方程為：Y=0.6372X+0.0751，r=0.9991；咪達唑侖的線性方程為：Y=0.975X-0.0087，r=0.9999。線性范圍分別為：非那西丁0.10～10.0 μg/mL；甲苯磺丁脲0.10～50.0 μg/mL；咪達唑侖0.05～5.0 μg/mL，最低定量限(S/N=10)非那西丁、甲苯磺丁脲均為0.10 μg/mL，咪達唑侖為0.05 μg/mL。
1-A：空白血漿(blank plasma)；1-B：探針?biāo)幬?卡馬西平(probe drugs+carbamazepine)；1-C：空白血漿+探針?biāo)幬?卡馬西平(blank plasma +probe drugs+carbamazepine)；1-D：大鼠給予探針?biāo)幬锖?.5 h血漿+卡馬西平(plasma after rat administration of probe drugs +carbamazepine)1. 非那西丁(phenacetin)；2. 咪達唑侖(midazolam)；3. 卡馬西平(carbamazepine)；4.甲苯磺丁脲(tolbutamide)圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms
3.3 精密度試驗 表1精密度試驗結(jié)果表明，不同濃度非那西丁、咪達唑侖、甲苯磺丁脲日內(nèi)、日間精密度RSD均小于7%，精密度良好。
3.4 回收率試驗 表1回收率試驗結(jié)果表明，不同濃度非那西丁、咪達唑侖、甲苯磺丁脲回收率均值均在75%以上，回收率穩(wěn)定。
3.5 穩(wěn)定性試驗 表2穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，含3種探針?biāo)幬锏?、中、高濃度的?biāo)準(zhǔn)血漿樣品經(jīng)室溫存放24 h，-20 ℃凍存30 d，反復(fù)凍融3次后，非那西丁、甲苯磺丁脲、咪達唑侖的低、中、高濃度RSD均小于9%，血漿樣品穩(wěn)定性良好。
表1 探針?biāo)幬锏木芏群突厥章式Y(jié)果Tab 1 The precisions and recoveries of probes
表2 探針?biāo)幬锏姆€(wěn)定性考察Tab 2 Stabilization determination of probes
3.6 應(yīng)用 由圖2所得均值藥-時曲線所示，本測試方法可用于同時測定大鼠體內(nèi)非那西丁、甲苯磺丁脲、咪達唑侖的血藥濃度，可用來評價藥物對CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4的影響。
2-A：非那西丁(phenacetin)；2-B：甲苯磺丁脲(tolbutamide)；2-C：咪達唑侖(midazolam)圖2 大鼠灌胃3種探針?biāo)幬锖蟮难獫{濃度均值-時間曲線圖Fig 2 Concentration-time curves of the 3 probe drugs in rat plasma after administration
4 討論與小結(jié)
在CYP450探針?biāo)幬镞x擇中，CYP1A2主要的探針?biāo)幬镉锌Х纫騕11-12]、茶堿[13]和非那西丁[14-16]，本研究CYP1A2探針?biāo)幬锖Y選時發(fā)現(xiàn)茶堿與血漿內(nèi)源性物質(zhì)有干擾，咖啡因?qū)儆趪夜苤祁愃幬铮徺I不便，故選用非那西丁作為CYP1A2探針底物；CYP2C9探針?biāo)幬镏饕屑妆交嵌‰錥14,16]和華法林[17]，然而Holbrook AM等[18]報道華法林容易和多種食物及藥物相互作用而導(dǎo)致嚴重不良反應(yīng)，因此選用甲苯磺丁脲作為CYP2C9探針底物；咪達唑侖是評價CYP3A4代謝活性的常用探針?biāo)幬?，其既可靜脈用藥，也可口服給藥，吸收快速且完全，不良反應(yīng)輕微，滿足安全、快速、特異性強等檢測要求，而且與眾多的CYP3A4底物有著良好的相關(guān)性[19]。綜上所述，本實驗選擇非那西丁、甲苯磺丁脲、咪達唑侖作為大鼠CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4的探針?biāo)幬铩?/p>
本研究曾對3種探針?biāo)幬锛皟?nèi)標(biāo)卡馬西平進行全波長掃描，各藥物在230 nm均有較大紫外吸收；采用甲醇-50 mM磷酸鹽緩沖對(65∶35)作為流動相[20]，結(jié)果咪達唑侖與非那西丁出峰時間重疊，將甲醇濃度逐步降低，咪達唑侖與非那西丁逐漸分離，但甲苯磺丁脲保留時間也隨之延后，降至35%時，其保留時間超過60 min，最終確定甲醇濃度在45%時，可有效縮短檢測時間；當(dāng)流動相pH大于3.5時，甲苯磺丁脲具有明顯的拖尾現(xiàn)象，pH3.0時，咪達唑侖也出現(xiàn)拖尾，通過優(yōu)化，流動相pH調(diào)為3.2。故最終確定流動相為甲醇-50 mM磷酸鹽緩沖對(45∶55；pH3.2)，檢測波長230 nm，在該條件下3種探針?biāo)幬锛皟?nèi)標(biāo)分離完全，峰形良好，無雜質(zhì)峰干擾，血漿內(nèi)源性物質(zhì)對3種探針?biāo)幬锛皟?nèi)標(biāo)的分離測定均無干擾。通過方法學(xué)考察表明該HPLC檢測方法靈敏度高，專屬性好，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定可靠，可用于生物樣本分析研究。動物實驗表明，用該HPLC檢測法研究藥物在體內(nèi)代謝具有較好的靈敏度，可以滿足動物實驗的要求。
本研究建立的方法，可在同一色譜條件下測定3種CYP450亞型酶探針?biāo)幬锏臐舛龋蚨蓪Ω鱽喰兔傅幕钚赃M行同時測定，可同時獲取經(jīng)多個代謝途徑的信息，且操作簡便，快捷，成本較低。為研究藥物對CYP450活性的影響，本方法對于評價藥物的安全性、預(yù)測代謝性藥物相互作用以及指導(dǎo)臨床合理用藥具有積極的意義。
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(編輯：侯向輝)
Simultaneous Determination of Three Probe Drugs of CYP450 in Rat Plasma by HPLC
LI Si-cong1,2, YUAN Ding-sheng1,2, YANG Rui1,2, WANG Bin1,2, LI Jin-liang1,2, LI Xu-ting1,2*
(1.InstituteofVeterinaryPhamacology,SichuanAnimalScienceAcademy,Chengdu610066,China; 2.AnimalBreedingandGeneticsKeyLaboratoryofSichuanProvince,Chengdu610066,China)
LIXu-ting,E-mail: 676049640@qq.com
To provide a methodological reference for the study of metabolism of liver enzymes, an HPLC method for simultaneously determining three cytochrome P450(CYP) (CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4) probe drugs in rat plasma was established. Cocktail probe solution was prepared by mixing three specific probe drugs of CYP1A2, 2C9 and 3A4(phenacetin, tolbutamide and midazolam, respectively). The three drugs were extracted with one solvent system, determined in rat plasma by HPLC, and verified the specificity, linear range, detection limit, precision, recovery and stability. The isolation was performed on a Diamonsil C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with mobile phase consisting of methanol -50 mM phosphate buffer (45∶55; pH3.2); the detection wavelength was 230 nm; the flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 35 ℃. Results showed that there were good linearity of phenacetin, midazolam and tolbutamide in the ranges of 0.10～10.0 μg/mL(r=0.9993), 0.05～5.0 μg/mL(r=0.9999), 0.10～50.0 μg/mL(r=0.9991). The recoveries were 79.28%～87.91%, 76.43%～85.36%, 82.79%～90.61%, respectively. The method is rapid, accurate, sensitive and suitable for simultaneously determining the concentrations of three CYP450 probe drugs(phenacetin, tolbutamide and midazolam) in rat plasma, the three drugs and the internal standard(carbamazepine) were separated well under the above HPLC conditions, which could be employed in evaluating the effects of drugs on rat’s CYP450 subtype enzymes(CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4) activities and in relatived studies.
CYP450; HPLC; phenacetin; tolbutamide; midazolam
四川省公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目(SASA2014A13)；四川省財政運行專項(SASA2014CZYX010) 作者簡介： 李思聰，碩士，從事獸藥基礎(chǔ)研究與開發(fā)工作。
李旭廷。E-mail：676049640@qq.com
10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.05
2017-02-07
A
1002-1280 (2017) 07-0021-07
S859.2
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