肖華春，王成業(yè)，陸有飛， 張曉明，鐘志敏，馮育寧，陳麗麗，李媛媚

(1.云南生物制藥有限公司，昆明 650503；2.廣西農業(yè)職業(yè)技術學院，南寧 530007；3.廣西麗原生物股份有限公司，南寧530001；4.安徽東方帝維生物制品股份有限公司，安徽亳州236800)

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分段補料法生產豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(EO630株)的試驗研究

肖華春1，王成業(yè)1，陸有飛2， 張曉明3，鐘志敏3，馮育寧4，陳麗麗4，李媛媚4

(1.云南生物制藥有限公司，昆明 650503；2.廣西農業(yè)職業(yè)技術學院，南寧 530007；3.廣西麗原生物股份有限公司，南寧530001；4.安徽東方帝維生物制品股份有限公司，安徽亳州236800)

為改進豬多殺性巴氏桿菌病(亦稱豬肺疫)活疫苗抗原制備工藝，提高生產效率和產品質量，采用分段補料發(fā)酵工藝制備豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(EO630株)抗原，培養(yǎng)12～13 h，EO630株的活菌數達到高峰期，最高活菌數可達1.31×1010CFU/mL。按分段補料法共生產抗原5批，培養(yǎng)12 h后收獲抗原，平均活菌數為1.17×1010CFU/mL，進行配苗和凍干疫苗5批，凍干后的平均存活率為69%。安全和效力檢驗均合格，達到預期效果。與傳統(tǒng)方法相比，該方法培養(yǎng)的活菌數有大幅度的增長，優(yōu)勢明顯。

豬多殺性巴氏桿菌EO630株；傳統(tǒng)發(fā)酵工藝；分段補料發(fā)酵工藝；活菌數；生長曲線；凍干存活率

豬多殺性巴氏桿菌病(豬肺疫)是由豬多殺性巴氏桿菌引起的一種常見的細菌性傳染病。多年來，EO630株被廣泛用作豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗及其聯苗的生產菌株，EO630株是用豬源B型多殺性巴氏桿菌強毒菌株經在含有海鷗牌洗衣粉的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代選育而得[1]。利用多殺性巴氏桿菌EO630株生產的弱毒活疫苗對豬肺疫有較好的預防效果。根據傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝，采用逐步增大通氣量培養(yǎng)15 h，測定細菌生長曲線，發(fā)現EO630株在培養(yǎng)的第10～11小時時活菌數達到高峰期，活菌數大約在6.8×109CFU/mL。為了提高抗原活菌數，采用分段補料法進行EO630株抗原的生產試驗，即在培養(yǎng)的第8小時和第10小時分別添加10%的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 h后收獲，并測定細菌的生長曲線。從該生長曲線中能看出，在培養(yǎng)第12～13小時時，EO630株的活菌數達到高峰期，最高活菌數可達1.31×1010CFU/mL。按分段補料法共生產抗原5批，培養(yǎng)12 h后收獲抗原，平均活菌數為1.17×1010CFU/mL，凍干后的平均存活率為69%。按《中華人民共和國獸藥典2010版三部(簡稱《獸藥典》)[2]進行安全和效力檢驗，檢驗結果均符合《藥典》規(guī)定，達到預期效果。

1 材 料

1.1 菌種 豬多殺性巴氏桿菌EO630株，來自成都獸醫(yī)藥械廠。

1.2 培養(yǎng)基、試劑 馬丁肉湯干粉培養(yǎng)基，青島海博生物技術公司提供；馬丁瓊脂干粉培養(yǎng)基，北京中海生物科技有限公司提供。

1.3 儀器設備 200 L生物發(fā)酵罐，購自青島強星設備科技有限公司；pH計，購自德國賽多利斯(Sartorius)；移液器，購自德國艾本德(EPPENDORF)。

2 方 法

2.1 馬丁肉湯干粉培養(yǎng)基制備 馬丁肉湯干粉培養(yǎng)基按說明書的規(guī)定加注射用水進行配制，然后按116 ℃，30 min進行消毒滅菌后，冷卻備用。

傳統(tǒng)工藝發(fā)酵培養(yǎng)按12萬毫升的培養(yǎng)基總量準備，分段補料法發(fā)酵培養(yǎng)按10萬毫升的培養(yǎng)基總量準備，另用2萬毫升規(guī)格的玻璃瓶按1萬毫升、1.1萬毫升的培養(yǎng)基量準備若干瓶，于培養(yǎng)過程中作補料用。

2.2 細菌種子制備 按《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇版(簡稱《規(guī)程》)[3]的方法，制備豬多殺性巴氏桿菌EO630株菌種液，經純粹檢驗及有關檢查合格者，置2～8 ℃，可保存3 d。

2.3 抗原制備

2.3.1 細菌接種 根據《規(guī)程》中的方法進行細菌接種，按培養(yǎng)基總量的2%接種細菌種子液。將保存?zhèn)溆玫募毦N子液移入操作間，按發(fā)酵罐培養(yǎng)基總量加入0.1%裂解血球全血，連接接種各管道。通過空氣過濾器潔凈空氣的壓力將菌種壓入發(fā)酵罐內。

2.3.2 傳統(tǒng)工藝發(fā)酵培養(yǎng) 細菌發(fā)酵罐培養(yǎng)基量為12萬毫升，接種細菌種子液2400 mL。接種完畢后，37 ℃靜止培養(yǎng)1 h，然后通入潔凈空氣，以逐漸增大通氣量的方法進行培養(yǎng)。通氣量根據溶氧量來設置調整，2～3 h小氣量通氣培養(yǎng)，溶氧量設置在50%，在通氣培養(yǎng)至4～6 h，逐步增大氣量，溶氧量60%～100%(即培養(yǎng)至第4小時溶氧量設置為60%，培養(yǎng)至第5小時溶氧量調整到80%，通氣培養(yǎng)至第6小時開始溶氧量調整到100%)。培養(yǎng)至6 h后，全部按氣量通氣培養(yǎng)，溶氧量100%設定進行通氣培養(yǎng)至第15小時培養(yǎng)結束。從第4小時開始，每小時取樣進行活菌計數，測定EO630株的生長曲線。

本次傳統(tǒng)工藝發(fā)酵培養(yǎng)的試驗共進行4次重復，根據各個時段的活菌計數結果取平均數，最終確定該傳統(tǒng)工藝發(fā)酵培養(yǎng)的生長曲線。

2.3.3 分段補料法發(fā)酵培養(yǎng) 細菌發(fā)酵罐培養(yǎng)基量為10萬毫升，接種細菌種子液2000 mL。接種完畢后，37 ℃靜止培養(yǎng)1 h，然后通入潔凈空氣，以逐漸增大通氣量的方法進行培養(yǎng)。通氣量根據溶氧量來設置調整，2～3 h小氣量通氣培養(yǎng)，溶氧量設置在50%，在通氣培養(yǎng)第4～6小時時，逐步增大氣量，溶氧量設置為60%～100%(即培養(yǎng)第4小時溶氧量設置為60%，培養(yǎng)第5小時溶氧量調整到80%，培養(yǎng)第6小時溶氧量調整到100%)。培養(yǎng)至6 h后，全部按氣量通氣培養(yǎng)，溶氧量設定為100%來進行通氣培養(yǎng)，待培養(yǎng)至第15小時時培養(yǎng)結束。在通氣培養(yǎng)第8小時和第10小時，分別添加10%經滅菌的新鮮培養(yǎng)基(即分別添加1萬毫升、1.1萬毫升經滅菌的新鮮培養(yǎng)基)。從第4小時開始，每小時取樣并進行活菌計數，測定EO630株的生長曲線。

本次分段補料法的試驗共進行4次重復，根據各個時段的活菌計數結果取平均數，最終確定該分段補料法發(fā)酵培養(yǎng)的細菌生長曲線。

2.3.4 分段補料法制備抗原、疫苗 通過用分段補料法和傳統(tǒng)工藝分別發(fā)酵培養(yǎng)4批進行比較，摸索分段補料的發(fā)酵工藝。按2.3.3項的方法測定的生長曲線可以看出，在培養(yǎng)至第12～13小時時，活菌數達到最高峰。

根據摸索的分段補料發(fā)酵培養(yǎng)工藝共制備了5批EO630株抗原，選擇在培養(yǎng)第12小時時即結束培養(yǎng)時收獲抗原，并取樣分別進行純粹檢驗和活菌計數，按《規(guī)程》中規(guī)定的方法進行配苗、凍干。

2.3.5 質量檢驗 對每批疫苗在凍干前后分別隨機取樣進行活菌計數，統(tǒng)計疫苗的凍干存活率，并按《藥典》標準，對疫苗進行安全、效力等質量檢驗。

3 結果與分析

3.1 活菌計數結果 用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝和分段補料法分別培養(yǎng)EO630株，每個時段的活菌計數見表1。

3.2 生長曲線 兩種方法培養(yǎng)EO630株所得生長曲線見圖1所示。

3.3 分段補料發(fā)酵工藝制備抗原的結果 分段補料發(fā)酵工藝制備EO630株抗原見表2，培養(yǎng)至12 h收獲平均菌數為117 億/mL。分段補料發(fā)酵工藝制備EO630株疫苗生產情況見表3，5批疫苗凍干后的平均存活率為69%，安全檢驗、效力檢驗均合格。

圖1 生長曲線Fig 1 Growth curve

4 小結與討論

4.1 由表1可以看出，根據傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝制備EO630株抗原，在培養(yǎng)6～10 h時活菌數增長很快，培養(yǎng)第10～11小時時活菌數達到最高峰，之后活菌數逐步下降，活菌數平均為6.8×109CFU/mL。根據分段補料工藝制備EO630株抗原，在培養(yǎng)6～12 h時，活菌數都一直保持較快的生長速度，在培養(yǎng)至12～13 h時，菌液的生長達到菌高峰，之后繼續(xù)培養(yǎng)，活菌數呈現逐步下降的趨勢，活菌數平均為1.19×1010CFU/mL，與傳統(tǒng)發(fā)酵工藝相比，其活菌數有大幅度的增長，增菌效果明顯。

4.2 由表2可以看出，采用分段補料工藝制備的5批EO630株抗原，在培養(yǎng)12 h時收獲抗原，菌液活菌數穩(wěn)定在1.08×1010～1.26×1010CFU/mL之間，菌液的平均活菌數為1.17×1010CFU/mL。該活菌數和測定生長曲線時長菌高峰期的菌數基本吻合，表明該工藝還是比較穩(wěn)定的。

4.3 由表3可看出，采用分段補料法制備5批EO630株抗原用于生產疫苗，凍干后疫苗的細菌存活率穩(wěn)定在67%～73%之間，凍干后的平均存活率為69%，疫苗的安全檢驗、效力檢驗均合格，表明該工藝生產的產品質量是穩(wěn)定的，可以降低產品生產成本，有生產應用價值。

在效力檢驗中，由于試驗動物個體差異，攻毒菌數會略有差異。在文中的5批疫苗的效力檢驗中，對照成立，而保護率有3批為10/10，2批為9/10，但都超過標準規(guī)定的80%。

4.4 馬丁肉湯干粉培養(yǎng)基產品具有性質穩(wěn)定、易于保存、使用方便等優(yōu)點，對于保證豬多殺性巴氏桿菌(EO630株)抗原質量穩(wěn)定有重要作用[4]。由于各個企業(yè)的設備條件和培養(yǎng)條件有所不同，本試驗所述方法對其他企業(yè)不一定適合，僅作參考[5]。

4.5 細菌培養(yǎng)過程的中后期為營養(yǎng)消耗最快的時期，即細菌增值對數期中段添加新鮮培養(yǎng)基，既能補充細菌增值消耗的營養(yǎng)成分，又能稀釋有害代謝產物，延長細菌對數生長期，可大幅度提高培養(yǎng)菌數。本試驗對補充不同比例的培養(yǎng)基量以及補料時間段未作更多的試驗，活菌數是否會隨著培養(yǎng)基的補充量增加而提高，有待進一步的研究[6]。

[1] 陶柏輝. 豬肺疫EO630菌株變異情況的觀察[J]. 中國獸藥雜志, 2000, 34(1):24-25.

Tao B H. The Observation of variation for the EO630 Strain of Swine pneumonia[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2000, 34(1): 24-25.

[2] 中華人民共和國農業(yè)部. 中國獸藥典(三部)2010年版[S].

Ministry of Agriculture of the People's Republic of China. Pharmacopoeia of People's Republic of China 2010 edition three[S].

[3] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程2000年版[S].

Commission of Chinese Veterinary Pharmacopoeia. The People's Republic of China veterinary biological products regulation 2000 version [S].

[4] 朱云，楊麗萍，曹陽春. 用不同培養(yǎng)基生產豬多殺性巴氏桿菌活疫苗的試驗研究[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息, 2008, (2):41-42.

Zhu Y, Yang L P, Cao Y C. Experimental Study on the Production of Vaccine againstPasteurellamultocidaby Different Culture Medium[J]. Chinese Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2008, (2): 41-42.

[5] 董海杰，張金平，孫繼強，等. 用馬丁干粉培養(yǎng)多殺性巴氏桿菌內蒙系679-230株增菌高峰期試驗[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2006, (6):88.

Dong H J, Zhang J P, Sun J Q,etal. Cultivation ofPasteurellamultocidain 679-230 Strain by Martingale Powder [J]. Heilong￣jiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2006, (6):88.

[6] 吳國勝，羅鎮(zhèn)藩，李熾新，等. 豬A型多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)基改良的初步探討[J]. 廣東畜牧獸醫(yī)科技, 2012, 37(1):26-27.

Wu G S, Luo Z P, Li Z X,etal. Preliminary Study on the Improvement of Culture Medium for A typePasteurellaMultocidaof Swine [J]. Technology of Guangdong Animal and Veterinary Science, 2012, 37(1): 26-27.

(編輯：侯向輝)

Production of SwinePasteurellamultocidaVaccine(Live，Strain EO630) by Section Feeding Method

XIAO Hua-chun1, WANG Cheng-ye1, LU You-fei2, ZHANG Xiao-ming3, ZHONG Zhi-ming3, FENG Yu-ning4, CHEN Li-li4, LI Yuan-mei4

(1.YunnanBiologicalProductsCo.Ltd,Kunming650503,China; 2.GuangxiAgriculturalVocationalCollege,Nanning530007,China; 3.GuangxiLiyuanBiotechCompanyLimited,Nanning530001,China; 4.AnhuiDivinityBiologicalProductsCo.Ltd,Bozhou,Anhui236800,China)

In order to improve the swinePasteurellamultocida(also called pig lung disease) vaccine(live, strain EO630) antigen preparation technology, and improve production efficiency and product quality, production efficiency and product quality，this experiment used segmented fed batch fermentation technology to produce to improve the swinePasteurellamultocidaliving vaccine (strain EO630) antigen, the living bacteria count reaches peak time at the 12～13 hours after incubation, and the highest living bacteria count is 1.31×1010CFU/mL. producing 5 batches of antigen by segmented fed-batch fermentation, obtain antigen after 12 hours incubation. The average living bacteria count is 1.17×1010CFU/ml. Formulate the vaccine and freeze-dry 5 batch of vaccine. The average survival rate is 69% after freeze-dry. Safety test and potency test were qualified to achieve the desired results. All the results are qualified with anticipated effect. Compared with the traditional method, the living bacteria count by this method substantially increased with obvious advantages.

PasteurellamultocidaEO630 strain；traditional fermentation process；sub-fed fermentation process；living bacteria count；growth curve；survival rate after freeze-dry

肖華春，學士，工程師，從事獸用疫苗生產、研制、質量管理工作。E-mail：xhc896@163.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.03

2017-04-01

A

1002-1280 (2017) 07-0010-05

S859.797