崔 凡，李 丹，陳 霞，王有為，楊 戈

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所，四川 成都 610031)

白念珠菌分泌的天冬氨酸蛋白酶6誘導(dǎo)人單核細(xì)胞凋亡

崔 凡，李 丹，陳 霞，王有為，楊 戈

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所，四川 成都 610031)

目的 檢測(cè)白念珠菌分泌的天冬氨酸蛋白酶6(Sap6)對(duì)人類單核細(xì)胞系(THP-1細(xì)胞)增殖的影響，明確Sap6蛋白是否具有誘導(dǎo)單核細(xì)胞凋亡的活性。方法用XTT比色法檢測(cè)25、50 μg/ml Sap6對(duì)THP-1細(xì)胞增殖率的影響;在流式細(xì)胞儀下用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)25、50 μg/ml Sap6誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡情況;用ConA-FITC/DAPI雙染法在熒光顯微鏡下觀察Sap6作用于THP-1細(xì)胞的位置。結(jié)果與25 μg/ml比較，50 μg/ml Sap6蛋白顯著抑制人THP-1細(xì)胞增殖率(P=0.0001)，并提高THP-1細(xì)胞早期凋亡率(P=0.0001);Sap6蛋白進(jìn)入THP-1細(xì)胞內(nèi)，結(jié)合于細(xì)胞核。結(jié)論白念珠菌分泌的Sap6在體外能夠進(jìn)入人單核細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖率。

白念珠菌;人單核細(xì)胞系;分泌型天冬氨酸蛋白酶6;細(xì)胞凋亡

白念珠菌是人類最常見的真菌病原體。根據(jù)宿主的免疫狀態(tài)，白念珠菌既可引起淺表的皮膚黏膜感染，也可引起致命的系統(tǒng)性感染。臨床研究發(fā)現(xiàn)高達(dá)80%的致命性播散性念珠菌感染由白念珠菌引起［1］。白念珠菌的致病性與其分泌的眾多毒力因子有關(guān)，其致病機(jī)制并不完全明確［2］。兼做抗原呈遞細(xì)胞的單核/巨噬細(xì)胞系構(gòu)成了人體抵御白念珠菌侵襲性感染的第一道防線［3］。單核/巨噬細(xì)胞有很強(qiáng)的殺滅念珠菌的能力，在控制系統(tǒng)性念珠菌感染的過程中起著關(guān)鍵作用，其介導(dǎo)了系統(tǒng)性念珠菌感染早期器官特異性的先天性免疫防御。單核/巨噬細(xì)胞還具有產(chǎn)生趨化因子、促炎細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-10和IL-12的能力。其中，IL-12對(duì)T細(xì)胞的分化和自然殺傷細(xì)胞的激活有著重要作用，而后兩者均能產(chǎn)生大量干擾素(IFN)-γ，從而激活細(xì)胞介導(dǎo)的抗念珠菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)［4，5］。我們前期研究從單核細(xì)胞培養(yǎng)液中提取到一種蛋白混合物，發(fā)現(xiàn)能夠在體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞凋亡。經(jīng)過一系列蛋白分離、純化和測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)白念珠菌分泌的天冬氨酸蛋白酶6(Sap6)可能是其活性成分。本實(shí)驗(yàn)利用純化的Sap6作用于人單核細(xì)胞細(xì)胞系(THP-1)，觀察其是否具有抑制單核細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡的活性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備單核細(xì)胞系(THP-1)細(xì)胞購自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫，純化Sap6蛋白由上海第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院饋贈(zèng)。RMPI 1640培養(yǎng)基(美國(guó) Gibico)、胎牛血清(FBS)(美國(guó) Gibico)、GENMED XTT比色法細(xì)胞繁殖測(cè)定試劑盒(美國(guó)GENMED)、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(北京嘉美生物)、ConA-FITC(美國(guó)Sigma)、DAPI熒光染料(北京金菩嘉生物)、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)、相差顯微鏡(美國(guó)Motic)、熒光顯微鏡(日本Olympus)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)。

1.2 XTT法檢測(cè)Sap6對(duì)THP-1細(xì)胞增殖率的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 THP-1細(xì)胞，吹打混勻，1000rpm，離心5 min，去掉上清液后加入適量THP-1細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打重懸細(xì)胞，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml。在THP-1細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別加入25、50 μg/ml的Sap6蛋白，同時(shí)設(shè)置 THP-1單獨(dú)培養(yǎng)組作為對(duì)照，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。按照XTT試劑盒操作手冊(cè)加入檢測(cè)試劑，繼續(xù)孵育4小時(shí)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。實(shí)驗(yàn)組相對(duì)對(duì)照組細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。

1.3 Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測(cè)Sap6誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡情況在1×106/ml THP-1細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別加入25、50 μg/ml的Sap6蛋白，同時(shí)設(shè)置THP-1單獨(dú)培養(yǎng)組作為對(duì)照，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)6小時(shí)。按照凋亡檢測(cè)試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行檢測(cè)，所有流程均避光操作。在流式細(xì)胞儀下檢測(cè)THP-1細(xì)胞凋亡情況。

1.4 ConA-FITC/DAPI雙染法觀察Sap6與THP-1細(xì)胞的作用部位將1 mg/ml的ConA-FITC溶液加入Sap6蛋白溶液，于暗室室溫下孵育20分鐘，使ConA-FITC充分標(biāo)記Sap6。將25 μg/ml ConA-FITC標(biāo)記的Sap6蛋白復(fù)合物加入1×106/ml THP-1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立只加入Sap6蛋白的THP-1培養(yǎng)組做陰性對(duì)照。共孵育2小時(shí)后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管2000 rpm，離心5分鐘，去除上清液，加入1×PBS溶液清洗細(xì)胞，重復(fù)兩次。吸取上清液后，加入200 μl甲醇重懸固定細(xì)胞。晾干后，各組分別加入10 μl DAPI，于熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sap6能夠抑制THP-1細(xì)胞增殖率經(jīng)過24小時(shí)的共培養(yǎng)，與THP-1單獨(dú)培養(yǎng)組相比，25 μg/ml Sap6蛋白顯著抑制了THP-1的細(xì)胞增殖率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。50 μg/ml Sap6對(duì)THP-1的細(xì)胞增殖率抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)見表1。

表1 Sap6蛋白對(duì)THP-1細(xì)胞增殖率的影響 (n=3)

2.2 Sap6蛋白誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡 經(jīng)過6小時(shí)共培養(yǎng)，25 μg/ml Sap6蛋白誘導(dǎo)THP-1的早期凋亡率顯著高于THP-1單獨(dú)培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。蛋白濃度50 μg/ml時(shí)，Sap6誘導(dǎo)THP-1早期凋亡率進(jìn)一步增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2、圖 1)。

表2 Sap6對(duì)THP-1細(xì)胞早期凋亡率的影響 (n=3)

圖1 Sap6誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞早期凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 右下象限表明早期凋亡細(xì)胞 a:THP-1單獨(dú)培養(yǎng)組;b:THP-1與Sap6(25 μg/ml)共培養(yǎng)組;c:THP-1 與 Sap6(50 μg/ml)共培養(yǎng)組

2.3 Sap6蛋白結(jié)合于THP-1細(xì)胞核 在熒光顯微鏡下，Sap6蛋白與 ConA-FITC藕連后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，結(jié)合于細(xì)胞核，發(fā)出點(diǎn)狀、團(tuán)塊狀綠色熒光。陰性對(duì)照顯示沒有標(biāo)記ConA-FITC的Sap6蛋白無法發(fā)出定位熒光(圖2)。

圖2 Sap6蛋白結(jié)合于THP-1細(xì)胞核 FITC(－)DAPI(+)為沒有標(biāo)記ConA-FITC的Sap6蛋白組;FITC(+)DAPI(+)為標(biāo)記了ConA-FITC的Sap6蛋白組

3 討論

白念珠菌毒力因子包括黏附、分泌的胞外水解酶、酵母相到菌絲相的轉(zhuǎn)換和生物膜的形成等。其中分泌型天冬氨酸蛋白酶(Saps)是白念珠菌的關(guān)鍵毒力因子，其編碼基因、理化特性及功能均得到了最深入的研究。Saps由至少10個(gè)受到高度調(diào)控的基因(SAP1-SAP10)組成的多基因家族編碼，這些蛋白酶分子質(zhì)量在35～50 kDa。根據(jù)氨基酸序列Saps可分為幾個(gè)亞家族，即 Sap1-3、Sap4-6、Sap9和Sap10［6，7］。Sap6 蛋白除了具有 Saps 的共同屬性外，在白念菌株致病過程中有著獨(dú)特的至關(guān)重要的生物學(xué)作用。Buu等［8］的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SAP6基因缺失突變株與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)菌絲形成能力明顯降低，而且免疫熒光染色顯示Sap6是位于菌絲尖端的主要Sap蛋白，他們認(rèn)為Sap6在與其他胞壁功能相關(guān)蛋白共同被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面的過程中，可能通過水解活性使這些蛋白得以成熟而發(fā)揮維持白念珠菌細(xì)胞表面完整性的作用。Schaller等［9］的研究發(fā)現(xiàn)SAP6基因表達(dá)與部分白念珠菌芽管形成和上皮組織嚴(yán)重?fù)p害同時(shí)發(fā)生。Pietrella等［10］的研究表明Saps尤其Sap6蛋白可能通過依賴網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞途徑進(jìn)入單核細(xì)胞后，破壞溶酶體、激活炎癥體和促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而導(dǎo)致白念珠菌感染過程中過度的炎癥反應(yīng)。因此，白念珠菌分泌的Sap6蛋白在其致病過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的毒力作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Sap6蛋白在體外能夠進(jìn)入THP-1細(xì)胞內(nèi)，結(jié)合于細(xì)胞核，并以劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡，抑制細(xì)胞增殖率。但Sap6蛋白是通過什么方式進(jìn)入人單核細(xì)胞進(jìn)而誘導(dǎo)其凋亡的仍不明確。ConA在Ca2+和Mn2+離子存在情況下可與末端α-D-甘露糖基和α-D-葡糖基殘基結(jié)合，而 Sap6蛋白為含有該糖基殘基的糖蛋白。FITC在熒光顯微鏡顯示綠色熒光。ConA-FITC與Sap6蛋白結(jié)合后可顯示Sap6蛋白的位置。DAPI可以透過完整的細(xì)胞膜與DNA強(qiáng)力結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色。本實(shí)驗(yàn)利用FITC和DAPI兩種熒光染料可以結(jié)合于細(xì)胞不同部位以及在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)不同顏色，從而分辨出Sap6蛋白作用于THP-1細(xì)胞的部位。我們的觀察結(jié)果提示Sap6蛋白能夠進(jìn)入THP-1細(xì)胞內(nèi)，結(jié)合于細(xì)胞核發(fā)揮作用。Wu等［11］研究發(fā)現(xiàn)Saps4-6可通過Arg-Gly-Asp(RGD)/Lys-Gly-Asp(KGD)氨基酸基序與上皮細(xì)胞表面的整合素結(jié)合，并內(nèi)化到溶酶體中，內(nèi)化的Saps4-6造成了溶酶體膜的通透性增高，釋放出組織蛋白酶D，最后通過caspase3的激活觸發(fā)上皮細(xì)胞凋亡。然而溶酶體通透性增高是否參與了Sap6誘導(dǎo)人單核細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性信號(hào)傳導(dǎo)通路有待進(jìn)一步研究。

單核/巨噬細(xì)胞系在宿主抗系統(tǒng)性真菌感染中處于核心地位。單核細(xì)胞一方面能夠吞噬病原真菌，將抗原呈遞給Th細(xì)胞，激活宿主抗真菌感染的細(xì)胞免疫反應(yīng);另一方面在免疫應(yīng)答的效應(yīng)階段，能夠大量吞噬和殺滅病原真菌［12］。白念珠菌感染宿主過程中如果大量分泌Sap6蛋白，攻擊宿主單核細(xì)胞系，將導(dǎo)致宿主抗真菌感染的固有免疫和獲得性免疫缺陷，加重系統(tǒng)性真菌感染的癥狀。因此Sap6誘導(dǎo)人單核細(xì)胞凋亡的機(jī)制的明確將有助于探索出新的治療靶點(diǎn)。

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Apoptosis of human monocytes induced by secretory aspartic proteinase 6 secreted by Candida albicans

CUI Fan，LI Dan，CHEN Xia，WANG You-wei，YANG Ge (Institute of Dermatology，Sichuan A-cademy of Medical Sciences ＆ Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610031，China)

Objective To investigate the effects of secretory aspartic proteinase 6(Sap6)from Candida albicans on human monocyte cell line(THP-1)proliferation，and to find out whether Sap6 has an activity to induce the apoptosis of monocytes．MethodsThe effect of Sap6 on THP-1 cell proliferation was evaluated by XTT assay．Apoptotic rate of THP-1 cells induced by Sap6 was measured by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit．The location of Sap6 on THP-1 cells was examined by ConA-FITC/DAPI staining under fluorescence microscope．Results50 μg/ml of Sap6 had a significantly inhibitory effect on the proliferative rate of THP-1(P=0.0001) ．50 μg/ml of Sap6 increased the early apoptotic rate of THP-1(P=0.0001) ．Sap6 was internalized into THP-1 and combined with nucleus of the cells．ConclusionSecretory aspartic proteinase 6 from Candida albicans could access into human monocytes in vitro，and inhibit the proliferation of monocytes by inducing cell apoptosis．

Candida albicans;Human monocyte cell line;Secretory aspartic proteinase 6;Cell apoptosis

R379.4

A

1672-6170(2017)04-0030-03

2017-01-17;

2017-03-22)

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(編號(hào):81101231)，四川省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研基金資助項(xiàng)目(編號(hào):150195)