趙 闊 謝更祥 陳 艷 張紅建 羅 山 張連中 鄭聯(lián)合

（海南省糧油科學研究所，海南 瓊海 571400）

貝殼粉對儲糧霉菌抑制作用的研究

趙 闊 謝更祥 陳 艷 張紅建 羅 山 張連中 鄭聯(lián)合

（海南省糧油科學研究所，海南 瓊海 571400）

本研究通過直接粉碎、煅燒、酸處理和堿處理四種工藝制備貝殼粉，研究了貝殼粉對灰綠曲霉、黃曲霉、青霉、根霉和高大毛霉五種儲糧霉菌的抑制效果，并進行了模擬儲藏試驗。研究結(jié)果表明：四種工藝制備的貝殼粉均具有良好的抑菌作用，抑菌能力由高到低依次為：酸處理、堿處理、煅燒、直接粉碎。本研究為貝殼粉在儲糧行業(yè)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

貝殼粉；儲糧霉菌；抑制

糧食始終是關(guān)系著我國國民經(jīng)濟發(fā)展的重要資源，是全面建設(shè)小康社會的重大戰(zhàn)略性物質(zhì)基礎(chǔ)。糧食儲藏是糧食保存的根本。對糧食儲藏危害最嚴重的生物因素，主要是儲糧害蟲和儲糧微生物。儲糧害蟲易察覺，微生物不易察覺，而微生物中霉菌對儲糧的危害最嚴重[1]。當環(huán)境溫濕度滿足霉菌生長條件后，儲糧就很容易發(fā)生霉腐現(xiàn)象[2]，有的還會代謝產(chǎn)生毒素，嚴重威脅到人畜的生命健康[3-4]。本研究利用貝殼的防腐、抑菌作用[5-7]，研究了不同工藝制備的貝殼粉，對儲糧霉菌的抑制效果，以期為貝殼粉在糧食儲藏中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

貝殼，購自海鮮市場；稻谷,農(nóng)家收購；灰綠曲霉、黃曲霉、青霉、根霉、高大毛霉,來自上海復(fù)祥生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

玻璃干燥器，沈陽一化玻商貿(mào)有限公司；AY220電子天平，日本島津；UPN-11-10T超純水制造系統(tǒng)，四川優(yōu)普超純科技有限公司；XSP-BM-2CA生物顯微鏡，上海彼愛姆光學儀器廠；SX2-4-10馬弗爐,上海躍進醫(yī)療器械廠；LRH-150-S恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣東醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 貝殼預(yù)處理。將貝殼用清水清洗干凈，除去黏附雜質(zhì)，晾干備用。

1.3.2 貝殼粉制備[8-12]。（1）直接粉碎：將貝殼直接粉碎，過60目篩。（2）煅燒處理：將直接粉碎后的貝殼粉放入高溫煅燒爐中煅燒1h，取出自然冷卻。（3）酸處理：用稀鹽酸溶液浸泡直接粉碎的貝殼粉，10min后取出，用去離子水洗滌3～4次，晾干，過60目篩。（4）堿處理：用NaOH溶液浸泡直接粉碎的貝殼粉，30min后取出，用去離子水洗滌3～4次，晾干，過60目篩。

1.3.3 制備培養(yǎng)基[13]。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：將馬鈴薯洗凈去皮，取200g切成小塊，加水1000mL，煮沸半小時后，補足水分。在濾液中加入10g瓊脂，煮沸溶解后加葡萄糖20g，補足水分，分裝，滅菌，備用。

1.3.4 預(yù)試驗。先取將貝殼粉添加到PDA培養(yǎng)基中，制成貝殼粉-PDA培養(yǎng)基，然后將灰綠曲霉、黃曲霉、青霉、根霉和高大毛霉5種霉菌活化后，分別制備成菌懸液，接種到貝殼粉-PDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后觀察菌落總數(shù)。確定貝殼粉最佳用量、煅燒處理最佳煅燒溫度、酸處理最佳酸液濃度和堿處理最佳堿液濃度。

1.3.5 模擬儲藏試驗[14]。用玻璃干燥器作為模擬倉，如圖1所示。海南常年高溫高濕，儲藏條件惡劣時倉溫甚至高達35℃，濕度達80%以上[15]。根據(jù)2010年版中國藥典，35℃下飽和氯化鉀溶液相對應(yīng)的濕度為84%。將適量飽和氯化鉀溶液倒入干燥器底部，模擬倉內(nèi)濕度。在干燥器隔板上放置過濾篩網(wǎng)，將直接粉碎、煅燒、酸處理、堿處理的貝殼粉分別以0.5%的劑量與稻谷混合均勻，置于篩網(wǎng)上，裝入體積約為干燥器的50%。將干燥器蓋子蓋上，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中儲藏。以不添加貝殼粉為對照。每隔5天取樣，進行霉菌孢子計數(shù)。稱取10.0g稻谷于50mL試管中，加入30mL去離子水，加塞用力上下振蕩1min，用200目篩網(wǎng)過濾，取濾液于顯微鏡下進行霉菌孢子計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝殼粉最佳用量的確定

取直接粉碎的貝殼粉0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g，分別添加到200mLPDA培養(yǎng)基中，以不添加貝殼粉的培養(yǎng)基為對照，將灰綠曲霉等5種霉菌的菌懸液，接種到貝殼粉-PDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后觀察菌落總數(shù)，確定貝殼粉最佳用量。

試驗結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，添加了貝殼粉的培養(yǎng)基上菌落總數(shù)，明顯低于對照，說明貝殼粉對5種霉菌生長均有抑制作用，這與文獻報道中關(guān)于貝殼有抑菌作用的說法一致；隨著貝殼粉用量增加，培養(yǎng)基上菌落總數(shù)減少，抑菌效果增強，但貝殼粉用量增加到1.0g以后，增加用量抑菌效果變化不明顯，估計此時貝殼粉的抑制作用達到相對飽和狀態(tài)，因此確定貝殼粉最佳用量為1.0g。

圖1 貝殼粉用量對菌落總數(shù)的影響

2.2 煅燒溫度的確定

直接粉碎的貝殼粉分別至于200℃、400℃、600℃、800℃、1000℃高溫爐中煅燒1h，冷卻后各取1.0g，分別添加到200mL PDA培養(yǎng)基中，以添加等量直接粉碎的貝殼粉為照，將灰綠曲霉等5種霉菌的菌懸液，接種到貝殼粉-PDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后觀察菌落總數(shù)，確定貝殼粉最佳煅燒溫度。

試驗結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，煅燒溫度對貝殼粉的抑菌能力有一定影響，經(jīng)過不同溫度煅燒后的貝殼粉的抑菌能力，均比不經(jīng)過煅燒的貝殼粉（對照）的抑菌能力強。煅燒溫度低于600℃時，煅燒溫度越高貝殼粉的抑菌能力越強，可能是因為煅燒過程中貝殼粉中的有機物發(fā)生了氧化、分解，產(chǎn)生了對霉菌有抑制作用的物質(zhì)。但煅燒溫度高于600℃后，貝殼粉的抑菌能力變化不明顯，說明此時貝殼粉中的有機物全部分解完畢，貝殼粉中的碳酸鈣開始分解為氧化鈣。因此，確定最佳煅燒溫度為600℃。

圖2 煅燒溫度對貝殼粉抑菌作用的影響

2.3 酸處理濃度的確定

用0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%鹽酸溶液，分別浸泡處理直接粉碎的貝殼粉，10min后取出，水洗3～4次，晾干后過60目篩。然后取酸處理貝殼粉各1.0g，分別添加到200mL PDA培養(yǎng)基中，以添加等量直接粉碎的貝殼粉為對照，將灰綠曲霉等5種霉菌的菌懸液接種到貝殼粉-PDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后觀察菌落總數(shù)。

圖3 鹽酸溶液濃度對貝殼粉抑菌作用的影響

試驗結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，鹽酸溶液濃度對貝殼粉的抑菌效果有較大影響，添加了酸處理貝殼粉的培養(yǎng)基上菌落總數(shù)明顯低于對照。分析其原因，可能是因為鹽酸處理過程中，鹽酸與貝殼中的碳酸鈣發(fā)生化學反應(yīng)，增加了貝殼粉的表面積，并且鹽酸溶液滲透進貝殼粉的微孔中，清除了微孔中的雜質(zhì)，使微孔擴大，表面積進一步增加，提高了抑菌能力。但鹽酸濃度增加到0.6%以后，再增加鹽酸溶液濃度，貝殼粉的抑菌能力逐漸減弱，說明鹽酸溶液濃度過高反應(yīng)過于激烈，會破壞貝殼粉中的有效抑菌成分，降低貝殼粉的抑菌能力。因此，確定鹽酸溶液濃度為0.6%。

2.4 堿處理濃度的確定

用1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%的氫氧化鈉溶液，分別浸泡處理貝殼粉，30min后取出，水洗3～4次，晾干后過60目篩。然后取堿處理貝殼粉各1.0g，分別添加到200mL PDA培養(yǎng)基中，以添加等量直接粉碎的貝殼粉的培養(yǎng)基作對照，將灰綠曲霉等5種霉菌的菌懸液接種到培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后觀察菌落總數(shù)。

試驗結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，堿處理對貝殼粉的抑菌能力也有一定的影響，分析其原因，可能是堿處理過程中氫氧化鈉與貝殼粉中的氨基酸等化學成分發(fā)生反應(yīng)，生成了具有抑菌作用的胺、氨基酸鹽或衍生物[16]，提高了貝殼粉的抑菌能力。但氫氧化鈉溶液濃度＞1.2%時，抑菌效果減弱，說明高濃度的氫氧化鉀會減少貝殼粉中的抑菌成分。因此，確定氫氧化鉀溶液濃度為1.2%。

圖4 氫氧化鈉溶液濃度對貝殼粉抑菌作用的影響

2.5 不同工藝處理效果對比分析

試驗結(jié)果如表1所示。在高溫高濕條件下（35 ℃、RH 84%），對照組稻谷表面的霉菌孢子呈動態(tài)上升趨勢，符合典型的儲糧真菌生長特征。經(jīng)過貝殼粉處理過的稻谷表面霉菌受到不同程度的抑制，其中酸處理的貝殼粉的抑菌效果最佳，因此酸處理貝殼粉在糧食儲藏中有很好的應(yīng)用價值。

表1 稻谷模擬儲藏后表面霉菌孢子數(shù)單位：（個/g）

3 結(jié)論

直接粉碎、煅燒、酸處理、堿處理的貝殼粉，均對霉菌具有良好的抑制作用。在200mL PDA培養(yǎng)基中，直接粉碎的貝殼粉的飽和用量為1.0g；煅燒處理貝殼粉工藝的最佳煅燒溫度為600℃；酸處理工藝最佳鹽酸濃度為0.6%；堿處理工藝最佳氫氧化鈉濃度為1.2%。四種工藝的抑菌能力由高到低依次為：酸處理、堿處理、煅燒、直接粉碎。本研究為貝殼粉在糧食儲藏中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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