徐曉寧 馬曉貞 汪學(xué)昌 李生梅 冶國(guó)棟

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，青海 西寧 810001)

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雙膦酸鹽類(lèi)藥物對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用機(jī)制

徐曉寧 馬曉貞 汪學(xué)昌 李生梅 冶國(guó)棟

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，青海 西寧 810001)

目的 檢測(cè)雙膦酸鹽類(lèi)藥物唑來(lái)膦酸對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的研究機(jī)制。方法 培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株MKN-28、SGC-7901和BGC-823，將細(xì)胞分為對(duì)照組和藥物處理組，MTT法檢測(cè)10、20、40、80 μmol/L唑來(lái)膦酸對(duì)細(xì)胞株的影響。人胃癌細(xì)胞株加入10～80 μmol/L的唑來(lái)膦酸，對(duì)照組不加藥物，孵育1、3、6、12、24 h后計(jì)算不同濃度和時(shí)間對(duì)細(xì)胞的影響；人胃癌細(xì)胞株SGC-7901加入40 μmol/L的唑來(lái)膦酸培養(yǎng)24 h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Western印跡檢測(cè)半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9、Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 10、20、40、80 μmol/L的唑來(lái)膦酸作用于胃癌細(xì)胞株(BGC-823、SGC-7901、MKN-28)，唑來(lái)膦酸的半抑制濃度(IC50)為40 μmol/L，用10～80 μmol/L的唑來(lái)膦酸作用于BGC-823、SGC-7901、MKN-28胃癌細(xì)胞株1、3、6、12、24 h后，可見(jiàn)唑來(lái)膦酸抑制人胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)且有時(shí)間和濃度的依賴(lài)性，唑來(lái)膦酸對(duì)胃癌正常黏膜細(xì)胞GES-1無(wú)抑制作用；人胃癌細(xì)胞SGC-7901經(jīng)40 μmol/L的唑來(lái)膦酸作用24 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)唑來(lái)膦酸處理組細(xì)胞凋亡情況顯著高于對(duì)照組；經(jīng)40 μmol/L唑來(lái)膦酸作用后的人胃癌細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)量明顯升高，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯減少。結(jié)論 唑來(lái)膦酸能抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)且有時(shí)間和劑量依賴(lài)性，唑來(lái)膦酸可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

雙膦酸鹽類(lèi)藥物；唑來(lái)膦酸；胃癌

近年來(lái)，雖然胃癌的發(fā)病率有所下降，但胃癌患者預(yù)后恢復(fù)情況仍無(wú)明顯改變，病后5年的生存率還是很低。對(duì)于進(jìn)展期和晚期的胃癌患者，化療是主要的手段，但化療藥物副作用、局限性大〔1～3〕。雙膦酸鹽類(lèi)藥物(Bps)是一種代謝性骨病藥物，多用于治療由多種原因引起的骨溶解性疾病〔4〕。近年來(lái)，研究者又發(fā)現(xiàn)了Bps對(duì)抗腫瘤有直接或間接的作用〔5〕。唑來(lái)膦酸是第3代Bps，隨著對(duì)Bps研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)唑來(lái)膦酸也能很好地對(duì)前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤進(jìn)行治療，但對(duì)胃癌的研究還比較少〔6,7〕。本研究旨在探討B(tài)ps對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 細(xì)胞株:人胃癌細(xì)胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823和GES-1由青海大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。主要試劑:兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3多克隆抗體、兔抗Caspase-9多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體、Caspase-3 活性測(cè)定試劑盒和Caspase-9活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bioworld，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen，ELISA細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司，RPMI1640購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。主要儀器:酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)B-D公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng) 從-80℃冰箱中取出人胃癌細(xì)胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823，37℃融化后，將細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2、95%空氣飽和濕度條件下培養(yǎng)，用NaHCO3調(diào)整pH至7.2～7.4，細(xì)胞達(dá)到85%融合后，加入0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA消化分離細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 不同時(shí)間不同濃度的唑來(lái)膦酸對(duì)細(xì)胞的影響 將細(xì)胞分為對(duì)照組、藥物作用組。將人胃癌細(xì)胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰酶消化并計(jì)數(shù)后，用培養(yǎng)液稀釋為終濃度3×104個(gè)/ml，按照每個(gè)孔100 μl的量接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜。在細(xì)胞中加入10、20、40、80 μmol/L的唑來(lái)膦酸，對(duì)照組不加藥物，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育1、3、6、12、24 h后，離心收集細(xì)胞，重懸于不同濃度藥物中。向每孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 500 r/min離心10 min，棄上清，每孔加入DMSO 150 μl，搖床室溫下緩慢震蕩8 min，待結(jié)晶物充分溶解后用酶標(biāo)儀在570 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定并記錄各組的吸光度OD，計(jì)算唑來(lái)膦酸的半數(shù)抑制濃度(IC50)及抑制率。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞株SGC-7901加入40 μmol/L的唑來(lái)膦酸，對(duì)照組不加藥物，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃孵育24 h，用胰酶消化并收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)調(diào)整待測(cè)細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。取1 ml細(xì)胞懸液至離心管中，4℃1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 ml冰預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次離心棄上清，PBS重復(fù)洗滌一次，加入Binding Buffer 200 μl重懸細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin-V和PI,充分混勻后避光環(huán)境中室溫靜置20 min，加緩沖液300 μl，用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Western印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 將40 μmol/L唑來(lái)膦酸作用于人胃癌細(xì)胞24 h后，轉(zhuǎn)移到1.5 ml的Ep管中，根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量，加入適宜量的裂解緩沖液，裂解30 min，12 000 r/min、4℃離心10 min，取上清。按照細(xì)胞總蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測(cè)定試劑盒提取蛋白和測(cè)定蛋白濃度，在蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合后，100℃煮沸變性5 min，每孔中加50 μl樣品，通過(guò)Odyssey掃描系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度唑來(lái)膦酸不同時(shí)間對(duì)人胃癌細(xì)胞抑制作用 用10～80 μmol/L的唑來(lái)膦酸作用于BGC-823、SGC-7901、MKN-28胃癌細(xì)胞株1、3、6、12、24 h小后，可見(jiàn)唑來(lái)膦酸抑制人胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)且有時(shí)間和濃度的依賴(lài)性，唑來(lái)膦酸對(duì)胃癌正常黏膜細(xì)胞GES-1無(wú)抑制作用。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度唑來(lái)膦酸不同時(shí)間對(duì)人胃癌細(xì)胞的影響

2.2 不同濃度唑來(lái)膦酸對(duì)細(xì)胞的影響 BGC-823、SGC-7901、MKN-28的IC50分別為(35.12±2.88) μmol/L、(38.52±3.21) μmol/L、(33.22±1.67) μmol/L。唑來(lái)膦酸對(duì)SGC-7901細(xì)胞株的IC50為40 μmol/L，24 h的抑制效果最明顯，因此后期選用濃度為40 μmol/L，培養(yǎng)24 h的人胃癌細(xì)胞SGC-7901為研究對(duì)象。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 人胃癌細(xì)胞SGC-7901經(jīng)40 μmol/L的唑來(lái)膦酸作用24 h后，經(jīng)PI/ Annexin-V雙染色用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。唑來(lái)膦酸處理組細(xì)胞凋亡(15.53%±1.11%)顯著高于對(duì)照組(2.12%±0.66%)(P<0.01)。

2.4 Western印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 經(jīng)40 μmol/L的唑來(lái)膦酸作用后的人胃癌細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)量(0.346±0.021，0.321±0.025)與對(duì)照組(0.208±0.015，0.198±0.018)相比明顯升高，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)量(0.195±0.029)與對(duì)照組(0.324±0.031)相比明顯減少(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 唑來(lái)膦酸作用于人胃癌細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)量

3 討 論

目前，對(duì)胃癌的治療主要采取化療的方式，然而一部分胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致化療的失敗，這一直是困擾臨床治療的一個(gè)棘手問(wèn)題〔1,8〕。因此，找到一個(gè)治療胃癌效果好的藥物，盡量減少化療是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。

Bps是近40年發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)對(duì)抗代謝性骨病有重要作用的藥物，如由多種因素引起的骨質(zhì)疏松、惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、骨痛等〔9〕。目前，Bps已經(jīng)更新到第3代〔10〕，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Bps不僅對(duì)破骨細(xì)胞有作用，而且還有直接的抗腫瘤效果，對(duì)多發(fā)性的胰腺癌、乳腺癌等腫瘤疾病都有直接的抗腫瘤效果〔11,12〕。研究者進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Bps的直接抗腫瘤作用主要是通過(guò)抑制腫瘤生長(zhǎng)同時(shí)誘導(dǎo)凋亡來(lái)完成的〔13〕。

Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡過(guò)程中重要的調(diào)控因子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Bcl-2家族20種蛋白質(zhì)：一類(lèi)是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL等10多個(gè)成員，另一類(lèi)是促凋亡蛋白，包括Bax、BAD等10多個(gè)成員〔14,15〕。Bcl-2家族中主要的抗凋亡分子是Bcl-2和Bcl-xL。Bcl-2和Bcl-xL能通過(guò)自身的BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2家族的促凋亡蛋白形成二聚體，促使促凋亡成員在細(xì)胞內(nèi)定位分布，從而保護(hù)細(xì)胞不進(jìn)入凋亡程序〔16,17〕。本研究結(jié)果顯示，人胃癌細(xì)胞株經(jīng)40 μmol/L的唑來(lái)膦酸處理后，Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯減少。

Caspase 家族是細(xì)胞凋亡過(guò)程中重要的效應(yīng)子。目前已發(fā)現(xiàn)了14種Caspase家族成員。Caspase-3是凋亡的效應(yīng)子，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游。目前，在Caspase家族中Caspase-3是研究比較透徹的一個(gè)。一般情況下，胞質(zhì)中的Caspase-3以無(wú)活性的酶原形式存在，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡信號(hào)時(shí)可引起Caspase-3在一些水解酶的作用下發(fā)生裂解而活化〔18,19〕。Caspase-9是Caspase家族中的啟動(dòng)分子，在人類(lèi)的正常組織廣泛表達(dá)。研究表明，在白血病、胃癌中都發(fā)現(xiàn)Caspase-9基因轉(zhuǎn)錄和翻譯下調(diào)〔20〕。本研究結(jié)果推測(cè)唑來(lái)膦酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是通過(guò)Caspase家族的依賴(lài)途徑發(fā)揮作用。

綜上所述，唑來(lái)膦酸在胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖發(fā)揮重要作用且有時(shí)間和劑量的依賴(lài)性。唑來(lái)膦酸可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制與Bcl-2蛋白家族和Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

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〔2016-08-02修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

徐曉寧(1978-)，女，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤內(nèi)科化療研究。

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A

1005-9202(2017)14-3429-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.021