馬志君 吉 潔 李春輝 謝云鵬 王 廣 王維興

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 承德 067000)

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TGF-β1、Smad7在老年星形細胞瘤患者術(shù)后組織中的表達及其相關(guān)性

馬志君 吉 潔1李春輝2謝云鵬 王 廣 王維興

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 承德 067000)

目的 探討轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、Smad7在老年星形細胞瘤患者術(shù)后組織中的表達及其相關(guān)性。方法 接受手術(shù)治療的老年星形細胞瘤患者25例為研究組。取術(shù)中切除的星形細胞瘤組織標本，分為低級別(Ⅰ～Ⅱ級)11例，高級別(Ⅲ～Ⅳ級)14例；另收集本院行內(nèi)減壓術(shù)切除的額顳葉正常腦組織6例為對照組。免疫組化染色檢測TGF-β1、Smad7在星形細胞瘤及正常腦組織中的表達，RT-PCR檢測TGF-β1、Smad7 mRNA表達水平。結(jié)果 TGF-β1、Smad7主要表達于正常腦組織和星形細胞瘤組織的細胞質(zhì)，為黃色或棕黃色顆粒，細胞膜和細胞核均無明顯陽性表達；各組間TGF-β1、Smad7表達水平差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，TGF-β1、Smad7的陽性表達率由高到低依次為：高級別星形細胞瘤、低級別星形細胞瘤、正常腦組織，TGF-β1與Smad7之間呈明顯正相關(guān)。正常腦組織、低級別星形細胞瘤、高級別星形細胞瘤中TGF-β1 mRNA和Smad7 mRNA表達量逐漸增加，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 TGF-β1、Smad7表達與老年星形細胞瘤的病理分級呈正相關(guān)，TGF-β1/Smad信號通路參與了星形細胞瘤的異常增殖。

星形細胞瘤；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1；Smad7

老年星形細胞瘤約占腦腫瘤發(fā)病率的40%，惡性增殖和侵襲是其主要的生物學(xué)行為〔1〕；治療以手術(shù)為主，但難以徹底切除腫瘤，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。研究顯示，上皮細胞增殖的負性調(diào)節(jié)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/ Smad信號通路在細胞增殖和凋亡的調(diào)控機制中發(fā)揮重要作用，同時也是機體抑癌的中心環(huán)節(jié)〔2〕。本實驗旨在檢測不同分級星形細胞瘤中TGF-β1和Smad7表達情況及其在老年星形細胞瘤發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 收集2015年1月至2016年6月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的老年星形細胞瘤患者25例為研究組，取術(shù)中切除的星形細胞瘤組織標本。男16例，女9例；年齡60～78〔平均(67.05±8.31)〕歲；標本按WHO分型標準分為：低級別(Ⅰ～Ⅱ級)11例，高級別(Ⅲ～Ⅳ級)14例。另收集本院行內(nèi)減壓術(shù)切除的額顳葉正常腦組織6例作對照組。兔抗人TGF-β1多克隆抗體、兔抗人Smad7多克隆抗體均購于上海信裕生物科技有限公司；免疫組化MaxVision試劑盒購于北京雅安達生物技術(shù)有限公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購于上海心語生物科技有限公司；Trizol試劑盒購于上海聯(lián)碩生物科技有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)、氯仿、乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)購于湖北欣恒源科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 10%甲醛溶液固定標本，石蠟包埋、切片，水浴修復(fù)抗原，鏈霉菌素抗生物蛋白-過氧化物酶連接法(SP)免疫組化二步法檢測TGF-β1、Smad7蛋白表達情況，抗體均按1∶100稀釋，磷酸緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照，用已知的星形細胞瘤組織切片為陽性對照；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5 min，蘇木素輕度復(fù)染，二甲苯透明，封片后鏡檢。陽性結(jié)果為黃色或棕黃色，評定采用Volm雙評分法，高倍鏡視野下選取10個區(qū)域：①陽性細胞比例評分：1分(<25%)、2分(25%-50%)、3分(>50%)；②染色強度評分：0分(無色)、1分(淺黃色)、2分(黃色)、3分(棕黃色)。綜合兩項評分：0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為中陽性，5～6分為強陽性。

1.2.2 RT-PCR檢測TGF-β1、Smad7 mRNA表達水平 取200 mg星形細胞瘤組織，Trizol 試劑盒提取總RNA，紫外分光光度法檢測濃度符合要求后取1 μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；RT-PCR反應(yīng)體系40 μl(cDNA 4 μl，上游引物、下游引物各1 μl，TaqDNA聚合酶20 μl，蒸餾水14 μl)，引物由上海江林生物科技有限公司合成，常規(guī)反應(yīng)條件下循環(huán)32次，72℃延伸5 min。取20 μl產(chǎn)物和10 μL DNA Ladder行瓊脂糖凝膠電泳，攝像后用Image-Pro Plus6.0軟件讀取條帶的積分光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行t、秩和檢驗、Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組間TGF-β1、Smad7免疫組化染色情況比較 TGF-β1、Smad7主要表達于正常腦組織和星形細胞瘤組織的細胞質(zhì)，為黃色或棕黃色顆粒，細胞膜和細胞核均無明顯陽性表達，各組間TGF-β1、Smad7表達水平有顯著差異(P<0.01)，TGF-β1、Smad7的陽性表達率由高到低依次為：高級別星形細胞瘤、低級別星形細胞瘤、正常腦組織，TGF-β1與Smad7之間呈明顯正相關(guān)(r=0.951，P<0.05)。見表1，圖1。

表1 TGF-β1、Smad7在各組間免疫組化染色情況比較〔n(%)〕

圖1 TGF-β1、Smad7在星形細胞瘤組織中免疫組化染色情況(×400)

2.2 各組間TGF-β1、Smad7 mRNA表達量比較 正常腦組織、低級別星形細胞瘤、高級別星形細胞瘤中TGF-β1 mRNA表達量分別為：0.19±0.03、0.63±0.07、0.90±0.10，Smad7 mRNA表達量分別為：0.09±0.02、0.20±0.04、0.45±0.05；隨星形細胞瘤級別升高TGF-β1、Smad7 mRNA 表達量明顯增加，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，圖3。

M：DNA Marker；1：正常腦組織；2：低級別星形細胞瘤組織；3：高級別星形細胞瘤組織；下圖同圖2 TGF-β1 mRNA在星形細胞瘤組織中表達情況

圖3 Smad7 mRNA在星形細胞瘤組織中表達情況

3 討 論

星形細胞瘤是顱內(nèi)最為常見的原發(fā)性神經(jīng)上皮性腫瘤。星形細胞瘤惡性增殖及侵襲性生長是其主要的生物學(xué)行為。目前，星形細胞瘤的治療方案中仍首選手術(shù)，但難以完全切除病灶組織，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差，在機體功能明顯衰退的老年患者中更為明顯。星形細胞瘤組織產(chǎn)生與發(fā)展是一個多因素共同參與的長期復(fù)雜過程，具有多種病理生理機制〔3〕。

TGF-β屬于多肽類生長因子，總共5種異構(gòu)體，只有TGF-β1～β3 3個亞型在哺乳動物中表達〔4〕。其中TGF-β1是人體內(nèi)的主要存在形式，它不僅調(diào)控細胞的發(fā)育，還可抑制免疫系統(tǒng)、影響血管生成等多種活性。TGF-β1可通過影響下游相關(guān)受體及Smad蛋白來調(diào)控細胞的增殖和分化，對良、惡性細胞均可發(fā)揮重要作用〔5〕。在上述調(diào)控通路中任何元件表達異常均可能導(dǎo)致信號異常轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而對TGF-β1的正常細胞生物學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生不良影響，誘發(fā)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。

Smads蛋白作為TGF-β信號通路中的重要元件，具有細胞核移位功能和轉(zhuǎn)錄因子活性〔6〕。當(dāng)Smads蛋白異常表達時會影響正常的信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)惡性腫瘤產(chǎn)生。Smad7基因所處的染色體位置對應(yīng)的等位基因缺失見于多種惡性疾病，并且與死亡率高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)〔7〕。TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路中的抑制因子Smad7在TGF-β信號傳導(dǎo)過程中起負反饋調(diào)節(jié)作用，其能夠與活化的TGF-β受體相互結(jié)合，抑制細胞質(zhì)中Smad蛋白磷酸化，阻斷TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響細胞對TGF-β信號的應(yīng)答。本研究說明TGF-β1、Smad7過表達能夠促進星形細胞瘤的發(fā)生，并提升了星形細胞瘤的增殖速度。TGF-β1/ Smad信號通路是體內(nèi)重要的抑癌系統(tǒng)，TGF-β1抑制信號的傳導(dǎo)是通過TGF-β1受體傳入，隨后活化Smad2、3，再與Smad4結(jié)合后進入細胞核調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、抑制腫瘤生長的。但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中TGF-β1抑制作用常失效，反而發(fā)揮促進作用，與TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)紊亂有關(guān)〔8〕。TGF-β1信號傳導(dǎo)過程中Smad7發(fā)揮負反饋和抑制的作用，Smad7蛋白異常表達時，可抑制Smad磷酸化，阻斷TGF-β1抑制信號傳導(dǎo)，促進腫瘤形成。

1 宋 軍，王穎翠，謝宗凱，等.彌漫性浸潤型星形細胞瘤中單絲氨酸蛋白激酶1、基質(zhì)金屬蛋白酶-14和血管內(nèi)皮生長因子的表達及意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(23)：6004-5.

2 Zamfir AD，F(xiàn)abris D，Capitan F，etal.Profiling and sequence analysis of gangliosides in human astrocytoma by high-resolution mass spectrometry〔J〕.Anal Bioanal Chem，2013；405(23)：7321-35.

3 苗 紅.腦星形細胞瘤磁共振波譜與腫瘤細胞的Ki-67、bcl-2相關(guān)性研究〔D〕.大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2010.

4 Mazloom A，Hodges JC，Teh BS，etal.Outcome of patients with pilocytic astrocytoma and leptomeningeal dissemination〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phy，2012；84(2)：350-4.

5 Hallemeier CL，Pollock BE，Schomberg PJ，etal.Stereotactic radiosurgery for recurrent or unresectable pilocytic astrocytoma〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2012；83(1)：107-12.

6 孫紅霞，陳建光.北五味子多糖對異丙腎上腺素致大鼠心室重構(gòu)的保護作用〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015；16(1)：34-7.

7 劉政操.星形細胞瘤血管生成擬態(tài)的形態(tài)觀察及恩度抑制腫瘤與腫瘤血管形成相關(guān)分子機制的實驗研究〔D〕.沈陽中國醫(yī)科大學(xué)，2011.

8 Kotulska K，Borkowska J，Roszkowski M，etal.Surgical treatment of subependy mal giant cell astrocytoma in tuberous sclerosis complex patients〔J〕.Pediatr Neurol，2014；50(4)：307-12.

〔2017-02-13修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

吉 潔(1978-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤、婦科內(nèi)分泌研究。

馬志君(1977-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事顱腦損傷、顱腦腫瘤、腦血管病、癲癇研究。

R73

A

1005-9202(2017)14-3425-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.019

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病案室 2 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科