王玲玲夏苗苗董會(huì)娜朱蓓薇張大偉，

（1. 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，大連 116034；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

篩選脫氮假單胞菌啟動(dòng)子提高維生素B12產(chǎn)量

王玲玲1夏苗苗2董會(huì)娜2朱蓓薇1張大偉1，2

（1. 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，大連 116034；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

維生素B12（VB12/鈷胺素）具有多種生理學(xué)功能，廣泛應(yīng)用于制藥、食品等行業(yè)。脫氮假單胞菌是維生素B12常用工業(yè)菌株之一。通過篩選高表達(dá)啟動(dòng)子來過表達(dá)VB12合成途徑基因，能有效提高菌株的VB12生產(chǎn)能力。通過對(duì)脫氮假單胞菌中某些編碼熱激蛋白和分子伴侶基因前含啟動(dòng)子在內(nèi)的非編碼序列用啟動(dòng)子在線預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行分析，選取PibpA、PcbpA、PdnaJ、PhtpG、Pdnak、PgrpE的非編碼區(qū)與編碼綠色熒光蛋白的GFP報(bào)告基因相連，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)GFP的熒光信號(hào)值，對(duì)編碼熱激蛋白和分子伴侶基因前的非編碼區(qū)所含有的啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估，以獲得高表達(dá)的啟動(dòng)子對(duì)VB12合成途徑的基因進(jìn)行過表達(dá)。結(jié)果表明，含有啟動(dòng)子Pdnak的非編碼區(qū)，其表達(dá)的GFP熒光值最高。進(jìn)而構(gòu)建強(qiáng)啟動(dòng)子Pdnak與維生素B12合成途徑基因cobA的過表達(dá)重組菌，發(fā)酵數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照菌株相比重組菌株維生素B12產(chǎn)量提高21.5 mg/L。篩選高表達(dá)啟動(dòng)子用于維生素B12合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，是一種有效的提高維生素B12產(chǎn)量的方法。

脫氮假單胞菌；強(qiáng)啟動(dòng)子；cobA；維生素B12；Gibson assembly

維生素B12（Vitamin B12）又稱鉆胺素［1］，作為一種含鈷的類咕啉化合物［2］，是唯一需要腸道分泌物幫助才能被吸收的維生素。維生素B12是維生素產(chǎn)品中價(jià)格最為昂貴的品種之一，具有廣泛的生理學(xué)作用，它參與體內(nèi)甲基轉(zhuǎn)換以及葉酸代謝，促進(jìn)神經(jīng)髓鞘中脂蛋白的形成，保持中樞神經(jīng)和外周髓鞘神經(jīng)纖維的功能完整，并參與廣泛的蛋白質(zhì)及脂肪代謝［3］。維生素B12在微生物中合成是受限的，由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，超過30個(gè)基因參與到維生素B12的生物合成全過程，數(shù)量占到典型細(xì)菌基因組的1%［4］。生物合成維生素B12在自然界中有2條途徑［5］：（1）好氧途徑，此途徑在Rhodobacter sphaeroides、Sinorhizobium meliloti和脫氮假單胞菌中有所研究；（2）厭氧途徑，此途徑在Bacillus megaterium、P.shemanii 和 Salmonella typhimurium 中有所研究［6］。相比于厭氧發(fā)酵過程的丙酸桿菌，好氧發(fā)酵過程的脫氮假單胞菌表現(xiàn)出更快速的細(xì)胞生長(zhǎng)和高效維生素B12的生產(chǎn)能力。

啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的順式元件，也是基因工程表達(dá)載體的一個(gè)重要元件。啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平上所起到的重要作用，不僅決定了基因的表達(dá)水平，而且決定了基因表達(dá)的時(shí)空順序［7-9］，在確定啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度的研究中，大多是利用報(bào)告基因的表達(dá)量來達(dá)到研究目的，常用的報(bào)告基因有綠色熒光蛋白 GFP（Green fluorescent protein）、紅色熒光蛋白R(shí)FP（Red fluorescent protein）和β-半乳糖苷酶lacZ（β-galactosidase）等［10，11］。根據(jù)在菌株中篩選強(qiáng)啟動(dòng)子的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，某些編碼熱激蛋白和分子伴侶基因前的啟動(dòng)子表現(xiàn)出較高的表達(dá)強(qiáng)度。熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性，在基因表達(dá)調(diào)控中具有開關(guān)性作用［12］。Dong等［13］在氧化葡萄糖酸桿菌中發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度啟動(dòng)子Pdnak，分子伴侶蛋白啟動(dòng)子Pdnak在強(qiáng)化氧化葡萄糖酸桿菌中D-山梨醇脫氫酶關(guān)鍵基因 sldAB1的表達(dá)時(shí)，有效縮短 D-山梨醇的轉(zhuǎn)化時(shí)間、提高 L-山梨糖產(chǎn)量，轉(zhuǎn)化時(shí)間比野生菌縮短了33.3%以及產(chǎn)量提高了11.2%，驗(yàn)證了 Pdnak的高強(qiáng)度啟動(dòng)活性。

S-腺苷-L-甲硫氨酸依賴型尿卟啉原Ⅲ轉(zhuǎn)甲 基 酶（S-adenosy-L-methionine uroprophyrinogenⅢ methyltransferase，SUMT） 催 化 尿 卟 啉 原 Ⅲ（Uroprophyrinogen Ⅲ）生成前咕啉-2，是維生素 B12生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，由cobA基因編碼。法國RPR公司曾經(jīng)提高了脫氮假單胞菌中cobA基因的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)對(duì)提高維生素B12產(chǎn)量有所幫助［4］。本研究通過篩選高表達(dá)的啟動(dòng)子，能提高cobA基因的表達(dá)水平，并在質(zhì)粒上過表達(dá)cobA增加其拷貝數(shù)，達(dá)到提高維生素B12產(chǎn)量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本研究所用菌株和質(zhì)粒均列于表1。

表1 所用菌株與質(zhì)粒

1.1.2 PCR引物 本研究所用PCR引物用Primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物均合成于蘇州金唯智生物科技有限公司，見表2。

1.1.3 主要試劑、儀器和培養(yǎng)基 主要試劑：基因組DNA提取試劑盒（DP302-02），質(zhì)粒小提試劑盒（D69-4302），膠回收試劑盒和柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒（D6492-02）購于OMEGA公司，其他未特殊指明的試劑均購自索萊寶生物科技有限公司。

限制性內(nèi)切酶購自Thermo Fisher Scientific公司，DNA聚合酶PrimerSTAR Mix購自TaKaRa，2×Taq PCR MasterMix和DNA Marker購于北京天根生化科技有限公司。Gibson Assembly 1.2 Master Mix為紐英倫（NEW ENGLAND BioLabs）生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

EDC-810基因擴(kuò)增儀器：東勝國際貿(mào)易有限公司；EYETM凝膠自動(dòng)成像儀：法國VILBER LOURMAT；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DYY-6C核酸電泳儀：北京市六一儀器；WY-2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器購自上海智城分析儀器有限公司；V-1600分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；5810R臺(tái)式高速離心機(jī)：德國Eppendorf公司；SpectraMax M5 多功能連續(xù)酶標(biāo)儀：美國MD公司；Agilent 1260高效液相色譜分析儀：安捷倫科技有限公司；Leica MZFLⅢ熒光顯微鏡：購自東莞同創(chuàng)儀器有限公司。

大腸桿菌（Escherichia coli）采用LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，固體培養(yǎng)基另加入瓊脂15。

脫氮假單胞菌種子培養(yǎng)基（g/L）：KH2PO42.5，NaCl 2.5，NH4Cl 0.5，MgSO40.13，葡萄糖1，CaCl25，KOH將pH值調(diào)到pH 7.0-7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 50，玉米漿（Corn steep liquor）60，（NH4）2SO42，CoCl20.006，KH2PO42.6，甜菜堿6，前體（DMBI）1，KOH將pH值調(diào)到pH 7.0-7.2。

補(bǔ)料培養(yǎng)基（g/L）：前體（DMBI）12，甜菜堿30，CoCl20.15，葡萄糖130。抗生素和使用濃度：卡那霉素50 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 啟動(dòng)子的在線預(yù)測(cè) 利用啟動(dòng)子在線預(yù)測(cè)軟件BPROM（http://www. softberry.com/berry. phtml? Topic = bprom&group=programs&subgroup=gfindb）來預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的序列位置。

1.2.2 含不同強(qiáng)度啟動(dòng)子和gfp的重組菌的構(gòu)建 從脫單假單胞菌菌株中提取基因組，并以此為模板，擴(kuò)增啟動(dòng)子 PibpA、PcbpA、PdnaJ、PhtpG、Pdnak、PgrpE以及cobA基因自身啟動(dòng)子PcobA，與gfp基因overlap相連接。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小。用試劑盒回收目的片段，并和載體進(jìn)行Gibson Assembly［15］，50℃反應(yīng)1 h，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素50 μg/mL的LB 平板上37℃過夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并對(duì)檢測(cè)正確的菌株加入至LB液體中過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒送到蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用NCBI在線比對(duì)軟件BLAST（http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列比對(duì)。質(zhì)粒通過三親本轉(zhuǎn)化到脫氮假單胞菌，挑取單菌落過夜培養(yǎng)后，用終濃度15%的甘油保存菌液，凍存于-80℃。

1.2.3 酶標(biāo)儀檢測(cè)重組菌的熒光值 分別取-80℃凍存管，將含有不同啟動(dòng)子的重組菌株劃線，30℃倒置培養(yǎng)4 d。分別挑取單菌落接種于含有30 mL種子液的250 mL三角瓶中，200 r/min、30℃培養(yǎng)36 h，按10%的接種量，接種到含30 mL發(fā)酵液的250 mL三角瓶中200 r/min、30℃培養(yǎng)。每株重組菌株均設(shè)置兩個(gè)平行。每隔4 h取樣檢測(cè)，分別取2 mL培養(yǎng)液，使用磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）洗滌3次，去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和死細(xì)胞。使用NUNC 96孔黑色酶標(biāo)板進(jìn)行熒光檢測(cè)，使用96孔白色細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行OD600檢測(cè)（熒光和OD600檢測(cè)均做2個(gè)復(fù)孔，每孔加入200 μL洗滌后的細(xì)胞懸浮液），所用儀器為連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，操作軟件為Softmax Pro。熒光強(qiáng)度檢測(cè)參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm。OD600檢測(cè)參數(shù)設(shè)置為：吸收光波長(zhǎng) 600 nm，并選擇調(diào)整光程。同時(shí)，取10 μL發(fā)酵菌液于載玻片上并使用熒光顯微鏡進(jìn)行熒光鏡檢，曝光時(shí)間選擇為2 ms。

1.2.4 cobA過表達(dá)菌株的構(gòu)建 以脫氮假單胞菌基因組為模板，利用引物擴(kuò)增大小為843 bp的cobA基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小，膠回收后，用Gibson assembly方法連接到質(zhì)粒pBHR1 -PdnaK（載體需經(jīng)Dpn1處理），構(gòu)建得到質(zhì)粒pBHR1-PdnaK-cobA。使用三親本轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建得到的重組載體pBHR1-PdnaK-cobA導(dǎo)入到脫氮假單胞菌，驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子被命名為重組菌脫氮假單胞菌 pBHR1-PdnaK-cobA。

1.2.5 過表達(dá)cobA重組菌的搖瓶發(fā)酵及維生素B12產(chǎn)量測(cè)定 將驗(yàn)證正確的過表達(dá)cobA基因的重組菌株，挑單菌落接種于含30 mL種子液的250 mL三角瓶中200 r/min、30℃培養(yǎng)36 h，按10%的接種量，接種到含30 mL發(fā)酵液的250 mL三角瓶中200 r/min、30℃培養(yǎng)144 h。以野生型脫氮假單胞菌為對(duì)照組，每株重組菌株均設(shè)置兩個(gè)平行。菌體濃度采用測(cè)量吸光值法，取2 mL發(fā)酵液，定容至100 mL后，測(cè)量吸光值（OD600）。

維生素B12在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含量的測(cè)定方法是之前有過相關(guān)報(bào)道的高效液相色譜法（HPLC）［14］。發(fā)酵結(jié)束后取4 mL樣品液體并向其中加入1 mL NaNO28%和1 mL冰醋酸，在熱水中煮沸30 min。離心分離10 000 r/min、10 min并且將上清液通過0.22 μm膜過濾器（Φ= 0.22 μm），取濾液1 mL，加入2 %氰化鈉溶液20 μL，過濾至上樣瓶中。分析使用安捷倫（Agilent 1260）高效液相色譜法5c18-250a柱恒溫設(shè)置為35℃。流動(dòng)相為：水和乙腈，體積比為70∶30且流速控制在0.8 mL/min，檢測(cè)分析物質(zhì)在361 nm處檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 啟動(dòng)子特征分析

確定挑選的7個(gè)啟動(dòng)子片段區(qū)域，并 使 用 原核 生 物 啟 動(dòng) 子 預(yù) 測(cè) 軟 件BPROM（http://www. softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=program s&subgroup=gfindb）評(píng)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域。使用軟件均預(yù)測(cè)到-10區(qū)和-35區(qū)啟動(dòng)子核心序列的存在，該網(wǎng)站上標(biāo)明利用該軟件預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子-10區(qū)和-35區(qū)的準(zhǔn)確率在80%左右。并給出了相應(yīng)的 LDF（Linear discriminant function）預(yù)測(cè)得分，啟動(dòng)子預(yù)測(cè)的-35區(qū)和-10區(qū)，及相應(yīng)的間隔堿基數(shù)分布信息，LDF預(yù)測(cè)得分，詳見表3。

表3 啟動(dòng)子特性分析

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段PibpA、PcbpA、PdnaJ、PhtpG、Pdnak、PgrpE、PcobA，gfp基因，獲得的片段電泳圖譜如圖 1 所示。片段的長(zhǎng)度分別為512 bp、977 bp、568 bp、539 bp、588 bp、710 bp、980 bp和717 bp。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

將啟動(dòng)子片段與gfp片段overlap連接后切膠回收純化后，與線性化載體用Gibson assembly方法組裝（圖2）后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，涂于LB抗性平板，挑選單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR驗(yàn)證正確的送蘇州金唯智公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒按照方法1.2.2構(gòu)建含不同啟動(dòng)子強(qiáng)度和gfp報(bào)告基因的脫氮假單胞重組菌。

2.3 GFP熒光檢測(cè)結(jié)果分析

在脫氮假單胞菌中以gfp為報(bào)告基因評(píng)價(jià)各啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度，質(zhì)粒構(gòu)建完成后獲得7株重組菌 株 PibpA-gfp、PcbpA-gfp、Pdnak-gfp、PdnaJ-gfp、PhtpG-gfp、PgrpE-gfp、PcobA-gfp。并使用多功能熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。啟動(dòng)子強(qiáng)度由測(cè)定得到的RFU/OD600值來表征。其中Pdnak-gfp、PhtpG-gfp和PdnaJ-gfp的熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其含有的啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度較高。圖3中A、C、E顯示，3株重組菌呈線性增長(zhǎng)直到發(fā)酵28 h達(dá)到穩(wěn)定期，RFU/OD600在對(duì)數(shù)中后期達(dá)到最大值。帶有啟動(dòng)子Pdnak的菌株RFU和RFU/OD600的值明顯高于其他兩株菌。同時(shí)，將上述3株高熒光值菌株用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示重組菌株P(guān)dnak-gfp有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。酶標(biāo)儀檢測(cè)和顯微鏡鏡檢結(jié)果（圖3-B、D、F）表明，重組菌的熒光強(qiáng)度大小為Pdnak＞ PhtpG＞ PdnaJ，以最大RFU/OD600的值為標(biāo)準(zhǔn)，重組菌Pdnak約為PhtpG、PdnaJ構(gòu)建的重組菌的1.5倍和18倍。

圖2 重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

2.4 cobA過表達(dá)菌株的構(gòu)建

使用強(qiáng)啟動(dòng)子PdnaK構(gòu)建cobA的過表達(dá)重組菌。PCR擴(kuò)增cobA片段，并與線性化載體pBHR1-PDnaK通過Gibson assembly獲得重組質(zhì)粒pBHR1-PdnaK-cobA。然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，涂于LB抗性平板，挑選單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，經(jīng)驗(yàn)證正確的進(jìn)行測(cè)序。使用三親本轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建得到的重組載體pBHR1-PdnaK-cobA導(dǎo)入到脫氮假單胞菌，驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子被命名為重組菌P. denitrifican pBHR1- PdnaK- cobA。

2.5 重組菌搖瓶發(fā)酵結(jié)果

在脫氮假單胞菌中使用篩選得到的強(qiáng)啟動(dòng)子Pdnak提高維生素B12合成途徑相關(guān)基因cobA的表達(dá)。對(duì)構(gòu)建得到的工程菌株P(guān). denitrificans-Pdnak-cobA進(jìn)行發(fā)酵測(cè)定其維生素B12產(chǎn)量，對(duì)照組為野生型脫氮假單胞菌。用高效液相色譜測(cè)定維生素B12產(chǎn)量，結(jié)果如圖4所示，含有過表達(dá)質(zhì)粒Pdnak-cobA的重組菌，維生素B12產(chǎn)量為75.5 mg/L，野生型菌株維生素B12產(chǎn)量為54.1 mg/L，明顯高于野生型菌株21.5 mg/L。

圖3 重組菌的酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果和鏡檢結(jié)果

3 討論

核心啟動(dòng)子是一個(gè)含有兩個(gè)保守序列即-35區(qū)和-10區(qū)的DNA序列，它是指一個(gè)RNA聚合酶全酶和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)［16］。按照控制轉(zhuǎn)錄水平的高低，啟動(dòng)子可以分為強(qiáng)啟動(dòng)子和弱啟動(dòng)子；從啟動(dòng)子誘導(dǎo)機(jī)制上分類，啟動(dòng)子可以分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、時(shí)期特異性啟動(dòng)子及自誘導(dǎo)啟動(dòng)子［17］。通常，強(qiáng)組成型的啟動(dòng)子可用于表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建，以及在工程菌中代替目標(biāo)基因自身的啟動(dòng)子［18-20］。雖然使用在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)出了啟動(dòng)子-35區(qū)和-10區(qū)的序列，但其表達(dá)強(qiáng)度仍然需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了確保啟動(dòng)子強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究利用連續(xù)多功能酶標(biāo)儀和熒光顯微鏡進(jìn)行啟動(dòng)子強(qiáng)度的檢測(cè)。

圖4 重組菌過表達(dá)cobA基因后生產(chǎn)維生素B12發(fā)酵產(chǎn)量

細(xì)菌的代謝改造是進(jìn)一步提高菌株生產(chǎn)性能的關(guān)鍵，為篩選得到可用于脫氮假單胞菌中代謝工程改造高表達(dá)的啟動(dòng)子，對(duì)脫氮假單胞菌中某些編碼熱激蛋白和分子伴侶基因前含啟動(dòng)子在內(nèi)的非編碼序列用啟動(dòng)子在線預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行分析，利用GFP報(bào)告基因表達(dá)的熒光值來表征啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度，并挑選高表達(dá)的啟動(dòng)子應(yīng)用于提高脫氮假單胞菌中維生素B12合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平，以實(shí)現(xiàn)提高VB12產(chǎn)量的目的。本研究篩選得到Pdnak、PhtpG和PdnaJ在內(nèi)的不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子，使用GFP報(bào)告基因篩選得到高表達(dá)的啟動(dòng)子Pdnak，以最大RFU/OD600的值為標(biāo)準(zhǔn)，重組菌Pdnak約為PhtpG、PdnaJ的1.5倍和 18倍，同時(shí)結(jié)合熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果均可知其高表達(dá)強(qiáng)度得到驗(yàn)證。并使用篩選的最強(qiáng)啟動(dòng)子 Pdnak構(gòu)建含維生素B12合成途徑關(guān)鍵基因 cobA 的過表達(dá)菌株，同時(shí)以野生型菌株為對(duì)照組。發(fā)酵結(jié)果表明，脫氮假單胞菌pBHR1-Pdnak-cobA的維生素B12產(chǎn)量比野生型菌株高21.5 mg/L，實(shí)現(xiàn)了維生素B12產(chǎn)量的提高，為今后脫氮假單胞菌工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)維生素B12提供可能性。如果今后想進(jìn)一步優(yōu)化脫氮假單胞菌生產(chǎn)維生素B12的能力，可以考慮通過啟動(dòng)子優(yōu)化與酶的天然組合、過表達(dá)、支路途徑敲除、發(fā)酵條件優(yōu)化［21］等手段進(jìn)一步提高維生素B12的產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本研究通過選取脫氮假單胞菌中某些編碼熱激蛋白和分子伴侶基因前含啟動(dòng)子在內(nèi)的非編碼序列，并與報(bào)告基因GFP相連，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)GFP的熒光值，篩選得到高表達(dá)的啟動(dòng)子Pdnak，構(gòu)建了含啟動(dòng)子Pdnak及cobA基因的過表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)入生產(chǎn)維生素B12的脫氮假單胞菌中。根據(jù)發(fā)酵結(jié)果顯示維生素B12產(chǎn)量明顯提高，同時(shí)證明篩選強(qiáng)啟動(dòng)子用于關(guān)鍵基因的過表達(dá)能有效提高菌株產(chǎn)量。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Enhanced Production of Vitamin B12by Screening the Promoter in Pseudomonas denitrificans

WANG Ling-ling1Xia Miao-miao2DONG Hui-na2ZHU Bei-wei1ZHANG Da-wei1，2
（1. Dalian Polytechnic University，Dalian 116034；2. Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

Vitamin B12（VB12/Cobalamin）possesses several physiological functions and is widely used in pharmaceutical and food industries. Pseudomonas denitrificans is commonly employed in the production of VB12. In order to improve the VB12productivity by a strain，the high-expression promoters were screened and then used to express the gene synthetizing VB12. Via online prediction software，analyzing the promoters in promoters-included non-coding sequences that precede the genes encoding heat shock protein and molecular chaperone in P. denitrification，the non-encoding sequences of PibpA，PcbpA，PdnaJ，PhtpG，Pdnak，and PgrpEwere selected and ligated to GFP report gene encoding green fluorescent protein. Then the GFP fluorescence signal value was detected by enzyme standard instrument，further for obtaining the promoters with high-expression，the expression levels of promoters in the non-coding sequences preceding the genes encoding heat shock protein and molecular chaperone were evaluated，which then was applied for the overexpression of genes in the VB12synthetic pathways . Fluorescence experimental results showed that the expression of GFP fluorescence value for the non-coding sequence with the promoter Pdnakwas the highest. Subsequently，the strongest Pdnakpromoter was selected to construct the recombinant P. denitrificans overexpressing gene cobA in VB12synthesis pathway，and the fermentation results revealed that the VB12yield increased by 21.5mg/L compared with the control strain. Conclusively，screening high-expression promoter for overexpressing the key gene in VB12synthesis pathway is an effective approach for improving VB12production.

Pseudomonas denitrificans；strong promoter；cobA；vitamin B12；Gibson assembly

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0010

2017-01-16

天津市自然科學(xué)基金（16JCYBJC23500，15JCQNJC09500）

王玲玲，女，碩士研究生，研究方向：微生物代謝；E-mail：wanglingling1122@126.com

張大偉，男，博士，研究員，研究方向：蛋白質(zhì)合成細(xì)胞工廠與微生物代謝；E-mail：zhang_dw@tib.cas.cn