何思雨 成文玉 金紅星

（河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130）

S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因失活對地中海擬無枝酸菌產(chǎn)利福霉素的影響

何思雨 成文玉 金紅星

（河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130）

為提高利福霉素的產(chǎn)量，構(gòu)建了S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因失活的地中海擬無枝酸菌。利用融合PCR構(gòu)建S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因的同源重組載體，通過電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到地中海擬無枝酸菌中，使之發(fā)生同源重組，以安普霉素為標(biāo)記，篩選了S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因失活菌株，并對比了突變菌株與原始菌株的利福霉素SV產(chǎn)量。成功構(gòu)建了S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因的同源重組載體，獲得了地中海擬無枝酸菌突變株A. mediterranei △fabD，失活菌株的利福霉素SV產(chǎn)量為168.08 mg/L，比原始菌提高了9.94%。S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因的失活，弱化了突變菌株脂肪酸的合成，強化了利福霉素的合成。

地中海擬無枝酸菌；利福霉素；S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶；融合PCR；基因失活

利福霉素是一類由地中海擬無枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）產(chǎn)生的重要安莎類抗生素，主要用于治療肺結(jié)核和其他分枝菌酸感染引起的疾病，如麻風(fēng)和艾滋病等［1-3］。利福霉素可以特異性地抑制依賴于DNA的RNA聚合酶的活性，使病原菌不能正常合成RNA產(chǎn)物，從而達到抑菌目的［4］。地中海擬無枝酸菌發(fā)酵得到的利福霉素是由利福霉素A、B、C、D、SV等多種組分構(gòu)成的，其中利福霉素SV是利福平、利福噴丁等利福霉素類藥物的直接合成前體［5-7］。

地中海擬無枝酸菌作為利福霉素的生產(chǎn)菌，長期以來主要以誘變育種為主，Pietro等［8］通過傳統(tǒng)NTG誘變—篩選的方法得到了利福霉素B的高產(chǎn)菌株A. mediterranei HP-130，金玉坤等［9］利用UV誘變再經(jīng)L-色氨酸、氯化銫等類似物作耐受處理，使利福霉素SV的產(chǎn)量提高10%左右。但這種化學(xué)或物理的誘變方法具有誘變方向難以掌握，突變體難以集中多個理想性狀、篩選工作量大等局限性。此外，Priscila等［10］通過構(gòu)建攜帶血紅蛋白基因vgb的地中海擬無枝酸菌-大腸桿菌穿梭載體，在地中海擬無枝酸菌中過表達了透明顫菌（Vitreoscilla stercoraria）的vgb基因，使利福霉素B的產(chǎn)量提高了13.9%，但其發(fā)酵過程中必須添加抗生素，才能保持工程菌中質(zhì)粒的穩(wěn)定性。目前，我國主要以發(fā)酵利福霉素SV為主，發(fā)酵單位較低，生產(chǎn)水平在5 000 U/mL左右［11］。

趙維等［12］于2010年對A. mediterranei進行了全基因組序列測定和注釋，明確了利福霉素SV生物合成及前體供給的途徑。丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA在3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA）的基礎(chǔ)上經(jīng)過縮合、環(huán)化和后修飾而形成利福霉素SV。而丙二酰CoA既是脂肪酸生物合成的前體，又是利福霉素生物合成的前體。因此，本研究利用融合PCR構(gòu)建S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因的同源重組載體，將脂肪酸合成途徑中的S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因fabD進行失活，弱化脂肪酸的合成，旨在而提高利福霉素SV的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 地中海擬無枝酸菌（A. mediterranei，由河北欣港藥業(yè)有限公司提供），大腸桿菌（E. coli）DH5α，質(zhì)粒pUC19和pSET152均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑 高保真的DNA聚合酶、T4連接酶由謙泰生物技術(shù)有限公司提供，PCR純化試劑盒購自Axygen公司，限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司。Trizol試劑盒購自Invitrogen公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，氨芐青霉素和安普霉素購自Sbase公司。引物由金唯智生物科技有限公司合成（表1）。

表1 本實驗所使用的引物

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 種子培養(yǎng)基 葡萄糖1.5%，黃豆餅粉1.0%，蛋白胨1.0%，KNO30.05%，CaCO30.1%，KH2PO40.01%，淀粉1.5%，pH7.0。

1.1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖10%，黃豆餅粉1.0%，魚粉0.5%，蛋白胨1.0%，KNO30.8%，CaCO30.3%，KH2PO40.02%，CoCl20.0003%。

1.1.3.3 培養(yǎng) 大腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃；制備地中海擬無枝酸菌的電擊感受態(tài)細胞時用YEME，地中海擬無枝酸菌電擊轉(zhuǎn)化后的孵育及篩選用本氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為28℃。

1.2 方法

1.2.1 S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因部分序列的克隆 用改進的Vingataramin等［13］方法提取地中海擬無枝酸菌的染色體DNA作模板，以Fabd-F/R為引物，PCR擴增了S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因fabD（3.8 kb），連接到pUC19上，命名為pUC19-fabd。

1.2.2 fabD基因的同源重組載體構(gòu)建 以融合PCR擴增中間為抗性標(biāo)記基因、兩側(cè)為左右同源臂的DNA片段，連接到pUC19而構(gòu)建fabD基因的同源重組載體pUC19-fabdF-apr-fabdR。

第一輪PCR（常規(guī)PCR）：以pUC19-fabd為模板，以ZF/ZR為引物，擴增為710 bp的左同源臂fabD-F，反應(yīng)條件為：98℃ 3 min；98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 22 s，30個 循 環(huán)；72℃ 10 min。以YF/YR為引物，擴增為1 170 bp的右同源臂fabD-R，反應(yīng)條件為：98℃ 3min；98℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 36 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。以質(zhì)粒pSET152為模板，以APR-F/R為引物，擴增出長度為1 200 bp的安普霉素抗性基因AprR。反應(yīng)條件為：98℃ 3 min；98℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 36 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。

第二輪PCR（融合PCR）：探索融合PCR反應(yīng)的條件，最終以3種第一輪PCR產(chǎn)物作模板各取0.5 μL，添加3%的DMSO，不加任何引物進行擴增，其原理是利用擴增片段末端的反向互補序列進行自身退火并結(jié)合，使安普霉素抗性基因兩側(cè)與fabD基因的左右同源臂相連，反應(yīng)條件為：98℃ 3 min；98℃ 30 s，47℃ 30 s，72℃ 93 s，10個循環(huán)。

第三輪PCR：以第二輪的PCR產(chǎn)物作為模板，以ZF/YR為引物，擴增3 044 bp的融合DNA片段，反應(yīng)條件為：98℃ 3 min；98℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 93 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.3 地中海擬無枝酸菌的電擊轉(zhuǎn)化 采用樊菲等［14］的方法將同源重組載體pUC19-fabdF-apr-fabdR導(dǎo)入到地中海擬無枝酸菌中，涂布于含安普霉素抗性的平板，7-10 d后挑取轉(zhuǎn)化子進行驗證。

1.2.4 突變菌株的驗證 將疑似菌株傳代培養(yǎng)5次，以Verify-F/R為引物，提取染色體DNA進行PCR驗證。以原始菌株與疑似菌株RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，以Test-F/R（設(shè)計在突變體中被替換掉的區(qū)域）為引物，進行RT-PCR驗證。以16S rRNA為管家基因，用相對定量2-ΔΔCT法計算fabD基因在突變菌株與原始菌株之間的相對表達水平［15］，重復(fù)3次。

1.2.5 發(fā)酵 將A. mediterranei突變菌株與原始菌株分別接種于裝有10 mL種子培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，220 r/min振搖培養(yǎng)48 h后，以10%的接種量接種于裝有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，發(fā)酵136 h后離心去除菌體，上清液按照改進的文獻［16］方法進行HPLC檢測利福霉素SV的產(chǎn)量。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建同源重組載體pUC19-fabdF-apr-fabdR

第1輪PCR擴增得到了預(yù)期長度為710 bp的fabD基因左同源臂、1 170 bp的fabD基因右同源臂和1 200 bp的安普霉素抗性基因表達盒（圖1-A，圖1-B）。

第2輪PCR通過3個第1輪PCR產(chǎn)物末端的反向互補序列相互退火結(jié)合，構(gòu)建成安普霉素抗性基因表達盒兩端分別連接有fabD基因左、右同源臂的DNA融合體。但是此時該融合體的量比較少，經(jīng)過第3輪PCR特異性地擴增，成功得到了預(yù)期為3 044 bp的fabD同源重組片段（圖1-C）。

將融合PCR產(chǎn)物連接到pUC19上，重組載體經(jīng)EcoR I酶切驗證。結(jié)果（圖1-D）顯示，重組載體酶切得到了預(yù)期為2 686 bp的線性pUC19和3 044 bp的融合PCR片段。重組載體測序結(jié)果表明，同源重組片段基因與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 重組載體pUC19-fabdF-apr-fabdR的構(gòu)建與驗證

2.2 fabD基因失活突變菌株的驗證

以染色體DNA為模板進行的PCR驗證，結(jié)果（圖2）顯示，以Verify-F/R作為引物，與預(yù)期的結(jié)果一樣，原始菌株染色體DNA擴增的是預(yù)期1.2 kb的DNA片段，fabD失活的突變菌株染色體DNA擴增的是1.85 kb DNA片段（目的失活片段的相對位置見圖3，設(shè)計PCR驗證引物時左右同源臂之間缺失550 bp片段）。

圖2 A.mediterranei △fabD菌株的PCR驗證電泳圖

為了進一步驗證fabD基因的失活，提取原始菌株和突變菌株的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，Test-F/R為引物，進行RT-PCR。以16S rRNA為管家基因，用相對定量2-ΔΔCT法計算fabD基因在突變菌株與原始菌株之間的相對表達水平，其結(jié)果如圖4。設(shè)定原始菌株的表達量為1，由定量PCR結(jié)果可知，在突變菌株A. mediterranei △fabD中，fabD的表達量極少，證明了fabD基因功能被破壞。

2.3 利福霉素SV的產(chǎn)量比較

突變菌和原始菌發(fā)酵液中利福霉素含量的HPLC檢測結(jié)果，見圖5。原始菌株發(fā)酵液中利福霉素SV平均含量為152.88 mg/L，突變菌株發(fā)酵液中利福霉素SV含量為168.08 mg/L。與原始菌株相比，突變菌株利福霉素SV的產(chǎn)量增加了9.94%。

圖3 目的基因失活片段和引物的相對位置

圖4 原始菌株與突變菌株fabD基因的相對表達量

3 討論

基因失活能夠有目的地缺失染色體DNA序列的部分片段，是最直接、最有說服力的遺傳育種手段之一。融合PCR技術(shù)［17］是根據(jù)PCR技術(shù)的原理和特點，采用具有互補末端的引物擴增目的片段，使擴增片段相互搭橋、拼接的一種方法。與傳統(tǒng)方法相比，融合PCR構(gòu)建同源重組載體進行基因失活，過程快捷、簡便、成本低廉并且克服了常規(guī)的酶切連接中對于酶切位點的選擇限制的缺點［18］。目前，融合PCR技術(shù)已成為基因失活同源重組載體構(gòu)建的的常用方法，劉小利等［19］采用融合PCR構(gòu)建了親水蛋白Dlp基因同源重組載體，獲得了耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）dlp基因缺失的突變株；婁菲等［20］利用兩步融合PCR技術(shù)構(gòu)建了大腸桿菌（Escherichia coli）蘋果酸酶基因（macA和macB）的失活同源重組載體，獲得的突變株蘋果酸產(chǎn)量提高了36%。

圖5 原始菌株與突變菌株發(fā)酵液的HPLC檢測結(jié)果

鑒于fabD基因有較多的常用內(nèi)切酶識別序列，本研究利用一步融合法將3個片段（fabD左同源臂、安普霉素抗性基因及fabD右同源臂）進行了無縫拼接并對融合PCR條件進行了優(yōu)化，構(gòu)建了fabD基因失活同源重組載體。因地中海擬無枝酸菌染色體的GC含量較高，選用適當(dāng)?shù)腜CR緩沖液添加適量的DMSO進行目的片段的擴增，例如融合PCR模板GC含量為60%-70%時加3% DMSO、GC含量大于70%時加5% DMSO；采用高保真DNA聚合酶進行融合PCR避免造成突變。為驗證融合PCR的準(zhǔn)確性，對目的片段進行了測序，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)堿基的插入、突變及缺失，表明獲得的同源重組載體可以用于后續(xù)的研究。

由fabD編碼合成的S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶將丙二酰CoA的?；D(zhuǎn)移到酰基載體蛋白（ACP），形成丙二酰ACP和游離CoA-SH，是脂肪酸途徑FASII系統(tǒng)中關(guān)鍵的蛋白酶之一［21］。眾所周知，大環(huán)內(nèi)酯抗生素、脂肪酸以及利福霉素的脂肪環(huán)鏈部分都是通過丙二酰CoA等逐步縮合而成的［22］。本研究利用同源重組的方法失活了脂肪酸途徑中S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因fabD，得到的突變菌株與原始菌株生長狀態(tài)無明顯差異，但該基因的破壞可能遏制了脂肪酸的合成，導(dǎo)致丙二酰CoA向脂肪酸的轉(zhuǎn)化量減少，從而使合成脂肪酸的代謝流轉(zhuǎn)向利福霉素環(huán)橋鏈的合成前體丙二酰CoA，增強了利福霉素SV的代謝合成，提高了利福霉素的產(chǎn)量。

地中海擬無枝酸菌中利福霉素SV生物合成的前體物質(zhì)除丙二酰CoA外，還有AHBA和甲基丙二酰CoA［23］。樊菲等［24］為消除芳香族氨基酸對AHBA的反饋抑制作用，失活了莽草酸途徑中合成芳香族氨基酸的分支菌酸基因aroC。本研究為降低脂肪酸對丙二酰CoA合成的抑制作用，失活了脂肪酸合成途徑的關(guān)鍵酶（S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶）基因fabD，獲得的突變菌株利福霉素SV的發(fā)酵單位達到了168.08 mg/L，比樊菲等改造的A. mediterranei△aroC菌株利福霉素SV的含量提高了13%左右。另外，地中海擬無枝酸菌的染色體基因組中存在2個拷貝的S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因（AMED_2102和AMED_3155）［25］，本研究只失活了其中一個拷貝（AMED_3155）。

4 結(jié)論

本文采用高保真DNA聚合酶，高GC含量的PCR緩沖液，添加3%的DMSO，模板量比例為1∶1∶1，最佳退火溫度為47℃進行融合PCR，構(gòu)建了S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因的重組載體。利用同源重組成功得到了地中海擬無枝酸菌S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因失活菌株，利福霉素SV產(chǎn)量相比原始菌株增加了9.94%。

［1］ Floss HG, Yu TW. Rifamycin mode of action, resistance, and biosynthesis［J］. Chem Rev, 2005, 105（2）：621-632.

［2］ 羅忠枚, 夏小冬, 崔玉彬, 等. 利福霉素類抗生素及其構(gòu)效關(guān)系研究進展［J］. 中國抗生素雜志, 2012, 34（4）：308-319.

［3］ 張靜霞, 王欣瑜, 唐克慧. 利福霉素類抗生素分析方法研究進展［J］. 中國抗生素雜志, 2009, 34（10）：588-592.

［4］ Birner J, Hodgson PR, Lane WR, et al. An Australian isolate of Nocardia mediterranea producing rifamycin SV［J］. J Antibiot, 1972, 25（6）：356-359.

［5］ Kohanski MA, Dwyer DJ, Collins JJ. How antibiotics kill bacteria：from targets to networks［J］. Nat Rev Microbiol, 2010, 8（6）：423-435.

［6］ 王延濤, 李爽, 夏玉朝, 等. 利福霉素的研究新進展［J］. 當(dāng)代醫(yī)學(xué), 2016, 22（6）：16-17.

［7］ 杜吉泉, 王軍峰, 儲炬, 等. 甘油對利福霉素SV生物合成的影響［J］. 微生物學(xué)通報, 2006, 33（6）：34-38.

［8］ Peano C, Damiano F, Forcato M, et al. Comparative genomics revealed key molecular targets to rapidly convert a reference rifamycin-producing bacterial strain into an overproducer by genetic engineering［J］. Metab Eng, 2014, 26：1-16.

［9］ 金玉坤, 熊宗貴, 白秀峰. 利福霉素產(chǎn)生菌的推理選育［J］.中國抗生素雜志, 1991, 16（4）：214-245.

［10］ Priscila G, Fernández FJ, Absalón AE, et al. Expression of the bacterial hemoglobin gene from Vitreoscilla stercoraria increases rifamycin B production in Amycolatopsis mediterranei［J］. J Biosci Bioeng, 2008, 106（5）：493-497.

［11］ 鄭璞, 王蕾, 史朝輝. 地中海擬無枝酸菌原生質(zhì)體電融合及其在提高利福霉素SV發(fā)酵效價中的應(yīng)用［J］. 中國抗生素雜志, 2002, 27（5）：267-269.

［12］ Zhao W, Zhong Y, Yuan H, et al. Complete genome sequence of the rifamycin SV-producing Amycolatopsis mediterranei U32 revealed its genetic characteristics in phylogeny and metabolism［J］. Cell Res, 2010, 20（10）：1096-1108.

［13］ Vingataramin L, Frost EH. A single protocol for extraction of gDNA from bacteria and yeast［J］. Biotechniques, 2015, 58（3）：120-125.

［14］ 樊菲, 成文玉, 金紅星. 產(chǎn)利福霉素地中海擬無枝酸菌的電轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化［J］. 中國抗生素雜志, 2015, 40（8）：575-578.

［15］ Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod［J］. Methods, 2001, 25（4）：402-408.

［16］ 劉英, 張磊, 崔春英, 等. 高效液相色譜法測定利福霉素鈉含量與有關(guān)物質(zhì)［J］. 中國抗生素雜志, 2005, 30（2）：84-87.

［17］ 陳國梁, 白興俊, 趙蓉, 等. PCR構(gòu)建融合基因方法的建立［J］. 生物技術(shù)通報, 2010（8）：209-213.

［18］ 鄺翡婷, 袁定陽, 李莉, 等. 一種載體構(gòu)建的新方法：重組融合PCR法［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2012（6）：634-639.

［19］ 劉小利, 江世杰, 薛冬, 等. 耐輻射異常球菌dlp基因缺失突變株構(gòu)建及其生物學(xué)功能研究［J］. 生物技術(shù)通報, 2017（2）：155-163.

［20］ 婁菲, 果士婷, 趙玉姣, 等. 過表達羧化途徑及失活蘋果酸酶基因?qū)Υ竽c桿菌好氧發(fā)酵產(chǎn)蘋果酸的影響［J］. 生物工程學(xué)報, 2016（11）：1539-1548.

［21］ Marcella AM, Barb AW. A rapid fluorometric assay for the S-malonyltransacylase FabD and other sulfhydryl utilizing enzymes［J］. J Biol Methods, 2016, 3（4）：e53.

［22］ Chen S, Wu Q, Shen Q, et al. Progress in understanding the genetic information and biosynthetic pathways behind Amycolatopsis antibiotics, with implications for the continued discovery of novel drugs［J］. Chem Bio Chem, 2016, 17（2）：119-128.

［23］ 邵志會, 趙維, 趙國屏, 等. 地中海擬無枝酸菌“硝酸鹽效應(yīng)”的研究進展［J］. 生物工程學(xué)報, 2015, 31（6）：845-856.

［24］ 樊菲. 地中海擬無枝酸菌分支酸合酶基因失活的研究［D］.天津：河北工業(yè)大學(xué), 2015.

［25］ Kumari R, Singh P, Lal R. Genetics and genomics of the genus amycolatopsis［J］. Indian J Med Microbi, 2016, 56（3）：233-246.

（責(zé)任編輯 李楠）

Effects of S-malonyltransferase Gene Inactivation on Rifamycin Production by Amycolatopsis mediterranei

HE Si-yu CHENG Wen-yu JIN Hong-xing
（School of Chemical Engineering and Technology，Hebei University of Technology，Tianjin 300130）

To increase rifamycin yield，the Amycolatopsis mediterranei mutant of the inactivated S-malonyltransferase gene（fabD）was constructed. S-malonyltransferase gene homologous recombinant vector was constructed using fusion PCR，and then transformed into A. mediterranei by electroporation，making the homologous recombination occurr. Then fabD-inactivated strain was screened by apramycin as a marker. Further，the rifamycin production between mutant strains was wmpared and the parental strain by fermentation. The results showed that the homologous recombinant vector of fabD was successfully constructed，and the A. mediterranei △fabD was obtained；the production of rifamycin SV in the mutant strain was 168.08 mg/L，with 9.94% increase in contrast to the parent strain. The inactivation of S-malonyltransferase gene weakened the fatty acid synthesis of mutant strain，subsequently strengthened the synthesis of rifamycin.

Amycolatopsis mediterranei；rifamycin；S-malonyltransferase；fusion PCR；gene inactivation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0200

2017-03-17

何思雨，女，碩士，研究方向：微生物遺傳育種學(xué)；E-mail：hesiyu2017@126.com

金紅星，男，博士，副教授，研究方向：微生物遺傳育種學(xué)；E-mail：jinhx87@126.com