吳曉飛王瑾瑜張徐俞孫玉萍陳玉珍盧存福

（1. 北京林業(yè)大學生物科學與技術學院 林木育種國家工程實驗室 教育部林木花卉遺傳育種重點實驗室，北京 100083；2. 清華大學分析測試中心，北京 100084）

鹽脅迫下胡楊和合作楊懸浮細胞端粒酶與抵御氧化損傷的關系

吳曉飛1王瑾瑜2張徐俞1孫玉萍1陳玉珍1盧存福1

（1. 北京林業(yè)大學生物科學與技術學院 林木育種國家工程實驗室 教育部林木花卉遺傳育種重點實驗室，北京 100083；2. 清華大學分析測試中心，北京 100084）

胡楊是我國西北干旱鹽堿荒漠和戈壁地帶唯一能形成森林的高大喬木樹種，具有較高抗鹽性。旨在探究鹽脅迫下細胞端粒酶活性變化與氧化損傷的關系，以抗鹽的胡楊和鹽敏感的合作楊懸浮細胞為材料，檢測了NaCl鹽脅迫條件下胡楊和合作楊細胞生長、超氧陰離子自由基與丙二醛含量以及端粒酶活性的變化。結果表明，在正常生長條件下，胡楊和合作楊細胞符合S型生長曲線，且合作楊細胞的生長量高于胡楊細胞；在鹽脅迫＜100 mmol/L時胡楊在培養(yǎng)7 d內(nèi)細胞活力高于對照（0 mmol/L），即使鹽濃度達到300 mmol/L時15 d胡楊細胞依然保持一定的細胞活力，而較低鹽處理對合作楊細胞活力影響即較大，當鹽濃度達到300 mmol/L時合作楊在第5 d細胞活力已接近零；與合作楊相比，低濃度鹽脅迫（100 mmol/L）使胡楊細胞內(nèi)超氧陰離子自由基含量增加，端粒酶活性較高，而合作楊丙二醛含量顯著增加；低濃度（＜20 mmol/L）H2O2誘導了胡楊細胞端粒酶活性，合作楊的變化則不顯著，但高濃度（＞200 mmol/L）NaCl和高濃度（50 mmol/L）H2O2可能造成了胡楊和合作楊氧化損傷，端粒酶活性降低?？果}性強的胡楊細胞端粒酶對抵御細胞內(nèi)氧化損傷具有一定作用。

胡楊；合作楊；鹽脅迫；端粒酶；氧化損傷

鹽脅迫是影響植物生長發(fā)育的非生物脅迫因子之一，主要通過滲透脅迫和擾亂植物細胞內(nèi)離子平衡對植物造成損傷［1］，進而引起一系列的生理變化，如改變細胞質(zhì)膜通透性、降低光合作用［2］以及產(chǎn)生大量活性氧（Reactive oxygen species，ROS），而高濃度的活性氧會對細胞質(zhì)膜、DNA、蛋白質(zhì)造成氧化損傷，富含鳥嘌呤的端粒序列對氧化損傷高度敏感，端粒DNA的氧化損傷則導致端?？s短和功能失調(diào)［3，4］。

端粒酶是真核生物維持端粒長度和解決末端復制問題所必須的核糖核蛋白復合物，其核心元件由RNA模板（Telomerase RNA，TER）和具有逆轉(zhuǎn)錄功能的催化蛋白（Telomerase reverse transcriptase，TERT）組成［5］。端粒酶在真核生物細胞抵抗氧化損傷和DNA修復方面發(fā)揮重要作用，對人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT的研究表明，一定程度的DNA氧化損傷可促進hTERT的表達和增加端粒酶活性，hTERT能夠提高損傷DNA的修復速度，增強DNA末端合成能力，增加細胞在DNA受損傷條件下的存活率；強氧化脅迫會使端粒酶活性急劇降低，DNA損傷加劇，引發(fā)細胞死亡［6-9］。此外，氧化應激條件下端粒酶逆轉(zhuǎn)錄亞基TERT從細胞核內(nèi)排出轉(zhuǎn)位到線粒體［10］，過表達TERT能夠保護線粒體DNA（mtDNA），增加線粒體膜電勢，減少線粒體過氧化物的產(chǎn)生和細胞內(nèi)過氧化物水平［11］。

關于植物細胞端粒、端粒酶對非生物脅迫響應的研究極其有限。Fojtová等［12］在對植物端粒酶功能的研究中發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫對煙草細胞會造成氧化損傷，去除鎘脅迫后，煙草細胞能夠修復損傷阻止細胞凋亡，在修復階段端粒酶活性明顯升高。本實驗室前期對沙冬青愈傷組織細胞的研究表明，在鹽脅迫條件下沙冬青細胞端粒酶對避免細胞遭受不可逆損傷，保持染色體DNA 穩(wěn)定性具有一定的作用［13］。

胡楊（Populus euphratica）是荒漠和半荒漠地區(qū)唯一可形成森林的喬木樹種，具有極強的鹽堿適應性，是研究木本植物抗鹽機制的理想材料［14］。對胡楊的抗鹽機制研究主要集中在顯微結構、離子運輸、鈣信號系統(tǒng)、ABA信號系統(tǒng)以及活性氧平衡等方面［15-20］，關于鹽脅迫、氧化應激和端粒酶活性的關系尚未見報道。本研究以抗鹽性較強的胡楊與速生鹽敏感性合作楊懸浮細胞為材料，檢測不同鹽脅迫下細胞生長、活性氧水平及端粒酶活性等變化，并檢測H2O2處理對楊樹細胞端粒酶活性的直接影響，旨在探討鹽脅迫、氧化損傷和端粒酶活性之間的關系，為胡楊抗鹽機制的揭示提供新資料。

1 材料與方法

1.1 材料

胡楊（Populus euphratica）懸浮細胞繼代培養(yǎng)基：MS + 0.5 mg/mL 6-BA + 0.5 mg/mL NAA；合作楊（P. simonii×P. pyramibalis cv）懸浮細胞繼代培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/mL NAA+2 mg/mL 2，4-D，培養(yǎng)條件為25℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)120 r/min，黑暗。

1.2 方法

1.2.1 細胞生長曲線的測定 分別按1%比例將培養(yǎng)7 d的胡楊懸浮細胞和合作楊懸浮細胞放入40 mL液體培養(yǎng)基中，每2 d取樣一次，測定其細胞鮮重，至懸浮培養(yǎng)的第15天，重復3次，繪制生長曲線。

1.2.2 鹽脅迫處理 將正常培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的胡楊和合作楊懸浮細胞轉(zhuǎn)入含有0、50、100、150、200、250、300 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)13 d，檢測細胞活力、端粒酶活性及其他指標的變化，實驗重復3次。

1.2.3 過氧化氫（H2O2）處理 將正常培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的胡楊和合作楊懸浮細胞轉(zhuǎn)入含有0、5、10、20、50 mmol/L H2O2的培養(yǎng)基中處理24 h取樣，檢測端粒酶活性的變化，實驗重復3次。

1.2.4 懸浮細胞活力測定 將正常培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的胡楊和合作楊懸浮細胞轉(zhuǎn)入含有0、50、100、150、200、250、300 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)13 d，每2 d取一次樣測定細胞活力。細胞活力的測定采用TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）法［21］，取100 mg不同鹽濃度處理的胡楊和合作楊愈傷加入10 mL離心管中，加入3 mL的TTC溶液（0.6%TTC，50 mmol/L PBS，pH7.4），避光，22℃孵育12 h，蒸餾水洗滌3次，500×g離心3 min，收集沉淀，加入3 mL 95%酒精重懸沉淀，置于60℃水浴鍋水浴10 min，冷卻至室溫，分光光度計測定其在485 nm處的吸光值［22］。

1.2.5 超氧陰離子自由基測定 取1 g懸浮細胞于研缽中，加入適量的65 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.8），研磨成勻漿，定容至3 mL，四層紗布過濾，濾液4℃13 000 ×g離心20 min，取上清液1 mL，磷酸緩沖液1 mL，10 mmol/L鹽酸羥胺2 mL，混合后25℃水浴1 h，取反應液2 mL，加入17 mmol/L對氨基苯磺酸2 mL和7 mmol/L α-萘胺2 mL，以加入2 mL蒸餾水作為空白對照，測定530 nm處的吸光值。用NaNO2作標準曲線，從標準曲線上求出O2.-的濃度，再換算成O2.-產(chǎn)生速率［23］。

1.2.6 丙二醛含量的測定 取3 g懸浮細胞于預冷的研缽中，加入少許石英砂，分兩次加入5 mL預冷的5% TCA（三氯乙酸）溶液，研磨至勻漿，鋼網(wǎng)過濾，將濾液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，4℃ 3000 ×g離心15 min，取2 ml上清液，加入5 mL的0.5% TBA（硫代巴比妥酸）溶液，沸水浴15 min，立即放入冷水浴中。待冷卻后，4℃ 3 000×g離心15 min，取3 mL上清液，分別測定532 nm、600 nm和450 nm處的吸光值［24］。

1.2.7 端粒酶活性測定 TRAP法檢測端粒酶活性［25］，取0.3 g懸浮細胞于預冷的研缽中迅速研磨，加入800 μL預冷的CHAPS buffer，冰上裂解30 min，4℃ 16 000×g離心20 min，取上清，加入PEG 8000使其終濃度為10%，冰上沉淀30 min，每隔3-5 min顛倒混勻一次，4℃ 16 000 ×g離心10 min，棄上清，加入200 μL CHAPS buffer重懸沉淀，冰上靜置30 min，4℃ 16 000×g離心10 min，取上清置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

50 μL PCR反應體系：36 μL DEPC H2O，5 μL TRAP buffer，1 μL 10 mmol/L dNTP mixture，1 μL TS引物，5 μL上述端粒酶提取物，26℃反應45 min，94℃變性2 min，加入1.6 μL RP引物和0.4 μL Taq聚合酶，PCR擴增片段。

上述PCR產(chǎn)物進行12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后，將凝膠置于SYBR Green I染色液中，室溫震蕩染色30 min，置于凝膠成像儀下觀察結果，用Quality one軟件分析結果。

2 結果

2.1 胡楊和合作楊細胞生長特性

在正常培養(yǎng)生長條件下，胡楊和合作楊懸浮細胞生長曲線都呈“S”型，繼代5 d，開始進入對數(shù)生長期，9 d后生長緩慢，13 d之后開始衰亡，培養(yǎng)期間合作楊懸浮細胞生長量高于胡楊細胞（圖1）。

圖1 胡楊和合作楊細胞生長曲線

2.2 鹽脅迫下胡楊和合作楊懸浮細胞活力變化

正常生長條件下（0 mmol/L）不論是胡楊還是合作楊，培養(yǎng)期間（＜ 13 d）懸浮細胞活力基本保持穩(wěn)定（圖2）；低濃度（50 mmol/L 或100 mmol/L）NaCl處理，胡楊和合作楊懸浮細胞活力在培養(yǎng)初期（＜ 3 d）高于正常生長的懸浮細胞，隨著處理時間延長，胡楊懸浮細胞7 d內(nèi)依然保持了較高的細胞活力，而合作楊懸浮細胞在處理3 d后細胞活力就開始低于正常生長細胞。值得關注的是，隨著NaCl處理濃度的升高（150-300 mmol/L），兩種楊樹的細胞活力產(chǎn)生不同變化：當鹽濃度達150 mmol/L時，胡楊愈傷組織細胞9 d內(nèi)仍能保持接近正常生長的細胞活力，而合作楊愈傷組織細胞活力在處理3 d后已經(jīng)降低了31%；當NaCl處理濃度提高到200 mmol/L，胡楊愈傷組織細胞在處理7 d后仍能保持50%正常細胞活力，而合作楊愈傷組織細胞活力僅為對照組的21%；當NaCl處理濃度達到300 mmol/L，胡楊愈傷組織細胞在處理5 d后仍能保持10%正常細胞活力，而合作楊愈傷組織細胞生長基本停滯，活力接近消失（圖2）。

圖2 鹽脅迫下胡楊（A）和合作楊（B）懸浮細胞活力的變化

2.3 鹽脅迫影響胡楊和合作楊懸浮細胞超氧陰離子自由基含量

非鹽脅迫條件下，胡楊和合作楊懸浮細胞內(nèi)超氧陰離子自由基含量均維持在一個相對穩(wěn)定的水平，即使細胞生長進入衰亡期（13 d，圖1），超氧陰離子自由基含量也沒有明顯的變化。100-300 mmol/L鹽處理13 d內(nèi)使胡楊懸浮細胞超氧陰離子自由基含量隨著鹽濃度的增加而提高，其中在第7 d時達極顯著水平（P ＜ 0.01），此后隨著培養(yǎng)時間延長至13 d，含量有降低趨勢，但與正常培養(yǎng)細胞差異顯著（P ＜ 0.05），比對照增加了44.64%（圖3-A）。而合作楊懸浮細胞則表現(xiàn)不同，超氧陰離子自由基含量在100 mmol/L鹽處理時隨著鹽處理時間延長增加，與正常培養(yǎng)細胞差異在13 d達到極顯著水平（P ＜0.01）；200 mmol/L鹽處理下合作楊懸浮細胞內(nèi)超氧陰離子自由基含量增加，與正常培養(yǎng)細胞的差異在7 d時達到顯著水平（P ＜ 0.05），該水平一直維持到第13 d；當NaCl濃度達到300 mmol/L處理7 d時，合作楊懸浮細胞超氧陰離子自由基含量與對照（0 mmol/L）相同，鹽脅迫至第13 d時超氧陰離子自由基含量比對照減少了42.54%（圖3-B）。鹽處理使胡楊與合作楊懸浮細胞內(nèi)超氧陰離子自由基含量的變化趨勢明顯不同，尤其是300 mmol/L鹽處理下合作楊懸浮細胞內(nèi)超氧陰離子自由基含量隨著鹽處理時間延長而減少，這與此時細胞活力的變化結果直接相關（圖2）。

2.4 鹽脅迫下胡楊和合作楊懸浮細胞丙二醛含量變化

在無鹽脅迫的正常生長條件下，不論胡楊還是合作楊，懸浮細胞中丙二醛（MDA）的含量相當，隨著NaCl處理濃度增加和時間延長，胡楊和合作楊愈傷組織細胞中的MDA水平發(fā)生不同變化：100-200 mmol/L NaCl濃度處理7 d，合作楊懸浮細胞中的MDA含量增加幅度較大，100 mmol/L NaCl處理7 d比對照增加了137.45%（P ＜ 0.05），之后MDA含量一直維持在較高水平；而100 mmol/L NaCl處理胡楊懸浮細胞MDA含量與對照差異不顯著，隨著鹽處理濃度提高，MDA含量增加幅度較??；當NaCl 濃度300 mmol/L處理13 d，胡楊懸浮細胞MDA含量與對照差異顯著（P ＜ 0.05），比對照增加61.92%；但300 mmol/L NaCl濃度處理使合作楊懸浮細胞中MDA含量隨時間延長逐漸降低，至脅迫13 d時比正常水平降低了40.51%（圖4），其原因與此時的細胞活力極低密切相關（圖2），大部分細胞死亡，細胞生理活動減弱，這與超氧陰離子自由基的檢測結果（圖3）較為一致。

圖3 鹽脅迫對胡楊（A）和合作楊（B）懸浮培養(yǎng)細胞超氧陰離子自由基含量的影響

2.5 鹽脅迫對胡楊和合作楊懸浮細胞端粒酶活性的影響

圖5-A和B結果顯示，胡楊懸浮細胞端粒酶活性均高于合作楊懸浮細胞細胞。無鹽脅迫處理條件下，胡楊和合作楊懸浮細胞端粒酶活性保持穩(wěn)定；100 mmol/L NaCl處理7 d，胡楊懸浮細胞端粒酶活性提高約1.68倍（P ＜ 0.01）（圖5-A、C），合作楊細胞提高約1.44倍（P ＜ 0.05）（圖5-B、D），至鹽處理13 d，胡楊細胞端粒酶活性升高為對照的1.71倍，而合作楊懸浮細胞端粒酶為對照1.27倍；200 mmol/L NaCl處理時，胡楊與合作楊細胞端粒酶活性均下降，但不同處理間差異不顯著；但當鹽濃度達到300 mmol/L時，在處理13 d內(nèi)胡楊懸浮細胞端粒酶活性與對照差異不顯著（圖5-A、C），而合作楊在鹽脅迫13 d時懸浮細胞端粒酶活性比對照下降了31.40%（圖5-B、D），這也進一步說明，200-300 mmol/L NaCl處理均導致胡楊和合作楊懸浮細胞端粒酶活性降低，但合作楊降低的程度更大。

圖4 鹽脅迫對胡楊（A）和合作楊（B）懸浮細胞丙二醛含量的影響

2.6 過氧化氫對胡楊和合作楊愈傷端粒酶活性的影響

為了確定端粒酶活性是否受到自由基的影響，本研究用不同濃度的過氧化氫（H2O2）處理胡楊和合作楊懸浮細胞24 h，實驗結果（圖6-A和B）顯示，不同濃度H2O2氧化脅迫胡楊懸浮細胞端粒酶活性均高于合作楊細胞；圖6-C和圖6-D顯示在10 mmol/L和20 mmol/L H2O2處理下，胡楊懸浮細胞端粒酶活性為非脅迫條件下的1.79倍，差異顯著（P ＜ 0.05），在50 mmol/L H2O處理下，胡楊懸浮細胞端粒酶活性降到對照水平；H2O2氧化脅迫下合作楊懸浮細胞端粒酶活性均略有升高，但變化不顯著。以上結果說明，胡楊懸浮細胞端粒酶對自由基敏感，一定濃度的H2O2能刺激提高端粒酶活性。

圖5 鹽脅迫下胡楊和合作楊懸浮細胞端粒酶活性變化

3 討論

鹽脅迫導致植物細胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧（Reactive oxygen species，ROS）［26］，高濃度的活性氧進一步攻擊DNA、蛋白質(zhì)及細胞質(zhì)膜，造成氧化損傷［27］，膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛含量增多［28-30］。本研究結果表明，不同濃度（0-300 mmol/L NaCl）鹽處理不同時間在胡楊細胞中丙二醛的水平普遍低于合作楊細胞，100 mmol/L鹽處理7 d合作楊懸浮細胞內(nèi)丙二醛含量即達到對照的2.46倍，說明此時合作楊懸浮細胞已經(jīng)受到較嚴重氧化損傷，而在100 mmol/L鹽處理13 d胡楊細胞內(nèi)丙二醛含量依然維持在一個相對較低水平；300 mmol/L鹽處理下，合作楊懸浮細胞內(nèi)丙二醛含量卻低于胡楊細胞，至脅迫13 d時甚至比正常水平降低了40.51%，此時合作楊懸浮細胞幾乎檢測不到細胞活力，細胞生長基本停滯，細胞的大量死亡導致檢測到的合作楊懸浮細胞內(nèi)丙二醛含量較低。與丙二醛檢測結果稍有不同，胡楊細胞超氧陰離子自由基含量略高于合作楊細胞，而且不同鹽濃度（0-300 mmol/L）處理不同脅迫時間（0-13 d）均呈現(xiàn)梯度上升趨勢。已有研究發(fā)現(xiàn)，當ROS水平超出防御機制所及范圍，細胞就處于氧化脅迫狀態(tài)，但在低濃度下，ROS能在植物細胞信號轉(zhuǎn)導途徑中作為第二信使介導植物對激素或環(huán)境脅迫的多種應答反應［26］。胡楊細胞內(nèi)不同鹽濃度（0-300 mmol/L）處理7 d超氧陰離子自由基含量較高，可能對胡楊細胞信號轉(zhuǎn)導起到一定作用；而在300 mmol/L高濃度鹽處理7 d胡楊細胞保持了一定活力，即使到第13 d細胞活力仍為對照的3.8%，而合作楊在200-300 mmol/L高濃度鹽處理第7 d細胞活力已近消失。Li等［31］發(fā)現(xiàn)，高濃度NaCl處理導致水稻根尖細胞發(fā)生程序性死亡，因此本研究結果表明，胡楊懸浮細胞抵抗鹽脅迫導致的氧化損傷能力較強，而合作楊對鹽脅迫則較敏感。

圖6 過氧化氫對胡楊和合作楊懸浮細胞端粒酶活性的影響

氧化損傷不僅使細胞生長受阻并能誘導程序化死亡（PCD），最終導致細胞死亡［32］。本研究結果表明，100 mmol/L NaCl濃度處理13 d，胡楊懸浮細胞超氧陰離子自由基含量大幅提高的同時，丙二醛（MDA）含量基本不變，細胞活力與對照（0 mmol/L）細胞相當，此時端粒酶活性增強；然而，100 mmol/L NaCl濃度處理合作楊懸浮細胞13 d時端粒酶活性僅比對照提高26.31%，隨著鹽處理時間延長端粒酶活性降低，超氧陰離子自由基和MDA含量顯著增加，細胞活力在處理7 d僅為對照86.96%，以后持續(xù)降低，說明100 mmol/L NaCl鹽處理13 d沒有造成胡楊懸浮細胞損傷，而合作楊已受到明顯的鹽脅迫氧化損傷，說明胡楊懸浮細胞端粒酶活性的提高對減輕低濃度鹽脅迫導致的氧化損傷起到了一定作用。端粒酶在真核生物細胞抵抗氧化損傷和DNA修復方面發(fā)揮重要作用。與染色體其他部位相比，端粒重復序列富含鳥嘌呤且位于染色體末端，更容易遭受活性氧的攻擊產(chǎn)生DNA損傷，DNA氧化損傷導致端粒縮短，影響染色體穩(wěn)定性［3，4］。成纖維細胞過表達人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因（hTERT）提高了細胞內(nèi)脫氧核苷酸（dNTP）和核苷酸（NTPs）的水平，進而提高了DNA損傷修復的能力［33］。Akiyama［8］等對Y79成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，2-5 Gy紅外輻射引起的DNA損傷能夠提高細胞內(nèi)端粒酶活性，大于10 Gy紅外輻射引起的DNA損傷導致端粒酶活性下降。本研究中，與低濃度（100 mmol/L）相比，NaCl濃度超過200 mmol/L，胡楊懸浮細胞端粒酶活性降低，細胞內(nèi)氧化損傷程度提高。前人的研究及本實驗結果表明，端粒酶抵御氧化損傷的作用具有一定限度。

過氧化氫所產(chǎn)生的羥自由基可造成單鏈或雙鏈的DNA氧化損傷［34］。10 mmol/L和20 mmol/L H2O2處理下，胡楊懸浮細胞端粒酶活性達到了正常水平的1.79倍，與100 mmol/L鹽脅迫處理下端粒酶活性變化趨勢一致，表明端粒酶活性的提高可能是自由基直接刺激的結果。無論是NaCl還是H2O2處理，抗鹽性較強的胡楊懸浮細胞端粒酶活性都高于鹽敏感的合作楊，H2O2濃度小于20 mmol/L，胡楊懸浮細胞端粒酶活性隨H2O2濃度增加而提高，H2O2濃度達到50 mmol/L，端粒酶活性降低，與200 mmol/L鹽脅迫處理下端粒酶活性變化結果一致；而合作楊懸浮細胞經(jīng)5-50 mmol/L H2O2處理后端粒酶活性變化不顯著。綜合分析前人研究及本文對兩種楊樹的實驗數(shù)據(jù)，可以作出以下推測：低濃度NaCl脅迫引起細胞內(nèi)自由基升高，而H2O2等自由基作為信號分子激活或提高端粒酶活性，增強細胞抵御鹽脅迫的能力；高濃度NaCl脅迫會導致自由基急劇上升，超越了細胞的防御能力，端粒酶活性下降，DNA及其他細胞組分被氧化降解。胡楊耐鹽性高于合作楊，端粒酶活性對鹽脅迫響應機制的不同可能是導致兩種楊樹抗鹽性不同的原因之一。

4 結論

NaCl脅迫引起胡楊細胞內(nèi)自由基含量升高幅度大于合作楊，而膜脂過氧化程度卻低于合作楊；10 mmol/L和20 mmol/L H2O2處理提高胡楊細胞端粒酶活性，而合作楊端粒酶對H2O2不敏感。在NaCl脅迫下胡楊細胞端粒酶對H2O2信號系統(tǒng)響應迅速，這可能是其抗鹽性高于合作楊的機制之一。

［1］Gupta B, Huang B. Mechanism of salinity tolerance in plants：physiological, biochemical, and molecular characterization［J］. International Journal of Genomics, 2014, doi：10.1155/2014/701596.

［2］Rodriguez P, Torrecillas A, Morales MA, et al. Effects of NaCl salinity and water stress on growth and leaf water relations of Asteriscus maritimus plants［J］. Environmental and Experimental Botany, 2005, 53（2）：113-123.

［3］Jurk D, Wilson C, Passos JF, et al. Chronic inflammation induces telomere dysfunction and accelerates ageing in mice［J］. Nature Communications, 2014, 2：4172.

［4］Fouquerel E, Lormand J, Bose A, et al. Oxidative guanine base damage regulates human telomerase activity［J］. Nature Structural & Molecular Biology, 2016, 23：1092-1100.

［5］Nelson ADL, Beilstein MA, Shippen DE. Plant telomeres and telomerase［M］. Molecular Biology. Springer New York, 2014： 25-49.

［6］Lu C, Fu W, Mattson MP. Telomerase protects developing neurons against DNA damage-induced cell death［J］. Developmental Brain Research, 2001, 131（1）：167-171.

［7］Shin KH, Kang MK, Dicterow E, et al. Introduction of human telomerase reverse transcriptase to normal human fibroblasts enhances DNA repair capacity［J］. Clinical Cancer Research, 2004, 10（7）：2551-2560.

［8］Akiyama M, Ozaki K, Kawano T, et al. Telomerase activation as a repair response to radiation-induced DNA damage in Y79 retinoblastoma cells［J］. Cancer Letters, 2013, 340（1）：82-87.

［9］Kaloyianni M, Pouikli A, Kyrka L, et al. Telomerase overexpression in human mesenchymal stem cells offers protection against oxidative DNA damage accumulation［J］. Cytotherapy, 2015, 17（6）：S34-S35.

［10］Haendeler J, Dr?se S, Büchner N, et al. Mitochondrial telomerase reverse transcriptase binds to and protects mitochondrial DNA and function from damage［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2009；29（6）：929-35.

［11］Ahmed S, Passos JF, Birket MJ, et al. Telomerase does not counteract telomere shortening but protects mitochondrial function under oxidative stress［J］. Journal of Cell Science, 2008, 121（7）：1046-1053.

［12］Fojtová M, Fulne?ková J, Fajkus J, et al. Recovery of tobacco cells from cadmium stress is accompanied by DNA repair and increased telomerase activity［J］. Journal of Experimental Botany, 2002, 53（378）：2151-2158.

［13］張徐俞, 王瑾瑜, 鄭廣順, 等. 鹽脅迫下沙冬青細胞端粒酶活性的變化與DNA穩(wěn)定性的關系［J］. 生物技術通報, 2014（10）：134-138.

［14］戴松香, 陳少良, Fritz E, 等 . 鹽脅迫下胡楊和毛白楊葉細胞中的離子區(qū)隔化［J］. 北京林業(yè)大學學報, 2006, 28（2）：1-5.

［15］Chen S, Li J, Wang S, et al. Salt, nutrient uptake and transport, and ABA of Populus euphratica；a hybrid in response to increasing soil NaCl［J］. Trees, 2001, 15（3）：186-194.

［16］Junghans U, Polle A, Düchting P, et al. Adaptation to high salinity in poplar involves changes in xylem anatomy and auxin physiology［J］. Plant, Cell & Environment, 2006, 29（8）：1519-1531.

［17］Yang Y, Zhang F, Zhao M, et al. Properties of plasma membraneH+-ATPase in salt-treated Populus euphratica callus［J］. Plant Cell Reports, 2007, 26（2）：229.

［18］Wang R, Chen S, Zhou X, et al. Ionic homeostasis and reactive oxygen species control in leaves and xylem sap of two poplars subjected to NaCl stress［J］. Tree Physiology, 2008, 28（6）：947-957.

［19］Zhang H, Yin W, Xia X. Calcineurin B-Like family in Populus：comparative genome analysis and expression pattern under cold, drought and salt stress treatment［J］. Plant Growth Regulation, 2008, 56（2）：129-140.

［20］Chen S, Polle A. Salinity tolerance of Populus［J］. Plant Biology, 2010, 12（2）：317-333.

［21］盧驍, 蘭小中, 楊鳳嬌, 等. 喜馬拉雅紫茉莉瘦果粘液對種子低溫萌發(fā)的保護［J］. 草地學報, 2014, 22（6）：1281-1287.

［22］何國維, 李偉光, 王瑞雪, 等. 利用2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑（TTC）測定細胞活力的方法與應用［J］. 軍事醫(yī)學, 2014（5）：388-391.

［23］李忠光, 龔明. 植物中超氧陰離子自由基測定方法的改進［J］.云南植物研究, 2005（2）：211-216.

［24］陳禹興, 付連雙, 王曉楠, 等. 低溫脅迫對冬小麥恢復生長后植株細胞膜透性和丙二醛含量的影響［J］. 東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2010（10）：10-16.

［25］王瑾瑜, 張徐俞, 王雅群, 等. 用改進的TRAP法測定樹木端粒酶活性［J］. 應用與環(huán)境生物學報, 2012（4）：682-686.

［26］Baxter A, Mittler R, Suzuki N. ROS as key players in plant stress signaling［J］. Journal of Experimental Botany, 2014, 65（5）：1229-1240.

［27］Miller G, Shulaev V, Mittler R. Reactive oxygen signaling and abiotic stress［J］. Physiologia Plantarum, 2008, 133（3）：481-489.

［28］Ksouri R, Megdiche W, Debez A, et al. Salinity effects on polyphenol content and antioxidant activities in leaves of the halophyte Cakile maritima［J］. Plant Physiology and Biochemistry, 2007, 45（3）：244-249.

［29］喬佩, 盧存福, 李紅梅, 等. 鹽脅迫對誘變小麥種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響［J］. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報, 2013（6）：720-727.

［30］Puyang X, An M, Han L, et al. Protective effect of spermidine on salt stress induced oxidative damage in two Kentucky bluegrass（Poa pratensis L. ）cultivars［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2015, 117：96-106.

［31］ Li JY, Jiang AL, Zhang W. Salt stress-induced programmed cell death in rice root tip cells［J］. Journal of Integrative Plant Biology, 2007, 49（4）：481-486.

［32］Pan J, Zhu M, Chen H. Aluminum-induced cell death in root-tip cells of barley［J］. Environmental and Experimental Botany, 2001, 46（1）：71-79.

［33］Sharma GG, Gupta A, Wang H, et al. hTERT associates with human telomeres and enhances genomic stability and DNA repair［J］. Oncogene, 2003, 22（1）：131-146.

［34］Kim SY, Kim RH, Huh TL. α-Phenyl-N-t-butylnitrone protects oxidative damage to HepG2 cells［J］. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2000, 34（1）：43-46.

（責任編輯 李楠）

Telomerase Activity in Relation to Oxidative Damage Resistance in Cells of Populus euphratica and×P. simonii P. pyramibalis cv Under Salt Stress

WU Xiao-fei1WANG Jin-yu2ZHANG Xu-yu1SUN Yu-ping1CHEN Yu-zhen1LU Cun-fu1
（1. College of Biological Sciences and Biotechnology，National Engineering Laboratory for Tree Breeding，Beijing Forestry University，Beijing 100083；2. Analysis and Testing Center，Tsinghua University，Beijing 100084）

Populus euphratica is an arbor that grows in drought and saline area in Northwest China. This work aims to explore the relation of telomerase activity and oxidative damage resistance. Using Populus euphratica and P. simonii×P. pyramibalis cv callus cells as materials，superoxide anion free radical levels，malondialdehyde contents and telomerase activity under salt stress were investigated. Results indicated that the fresh growth were consistent with sigmoid growth curve in both P. euphratica and P. simonii × P. pyramibalis cv cells，and the growth of P. simonii × P. pyramibalis cv was higher than that of P. euphratica. Compared to the control（0 mmol/L），the cell activity of P. euphratica increased when cultured for 7 days under the treatment of 100 mmol/L NaCl，and maintained at a certain level under the treatment of 300 mmol/ L NaCl for 15 days. However，the cell activity of P. simonii × P. pyramibalis cv was affected under low NaCl concentration，and approximated to zero when cultured for 5 days under 300 mmol/L NaCl. Under the treatment of 100 mmol/L NaCl，the content of superoxide anion free radicaland telomerase activity in P. euphratica cells increased compared to P. simonii × P. pyramibalis cv cells，while the malondialdehyde content in P. simonii × P. pyramibalis cv cells rose significantly. The telomerase activity in P. euphratica cells was much higher than that in P. simonii×P. pyramibalis cv cells when cultured in 300 mmol/L NaCl. The telomerase activity in P. euphratica cells increased but no significant change in P. simonii×P. pyramibalis cv cells under the low concentration of H2O2；high concentration of NaCl or H2O2caused the oxidative damages to both P. euphratica and P. simonii × P. pyramibalis cv cells，resulting in the decrease of telomerase activity. Experimental results suggest that the telomerase can play certain role in defensing oxidative damage.

Populus euphratica；P. simonii×P. pyramibalis cv；salt stress；telomerase；oxidative damage

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0136

2017-02-24

國家自然科學基金項目（31270737），高等學校學科創(chuàng)新引智計劃（B13007），長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（IRT13047），北京市自然科學基金項目（6112016）

吳曉飛，男，碩士，研究方向：植物端粒酶；E-mail：1293336716@qq.com

盧存福，男，博士，研究方向：植物分子細胞生物學；E-mail：lucunfu@bjfu.edu.cn