魏喻周昌陽(yáng)李艷利
(1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444;2. 神經(jīng)學(xué)科學(xué)研究所,上海 200031)
一種利用CRISPR/Cas9 對(duì)細(xì)胞添加生物條形碼的新方法
魏喻1周昌陽(yáng)2李艷利1
(1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444;2. 神經(jīng)學(xué)科學(xué)研究所,上海 200031)
旨在利用CRISPR/Cas9對(duì)細(xì)胞添加不同的生物條形碼(Barcode),實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同的標(biāo)記。將生物條形碼序列、條件誘導(dǎo)性Cas9序列及相應(yīng)的sgRNA序列通過(guò)PB酶整合到細(xì)胞中,誘導(dǎo)Cas9表達(dá)之后對(duì)生物條形碼序列測(cè)序分析細(xì)胞的標(biāo)記情況。所設(shè)計(jì)的生物條形碼含有6個(gè)相互重疊的sgRNA 識(shí)別位點(diǎn),這種設(shè)計(jì)可以使條形碼序列只會(huì)被Cas9切割一次。結(jié)果顯示,所設(shè)計(jì)的生物條形碼序列在N2a細(xì)胞中經(jīng)Dox誘導(dǎo)之后能夠高效地被Cas9切割,所挑的9個(gè)克隆中,生物條形碼序列有9種不同的基因型。含有受loxp-stop-loxp 調(diào)控表達(dá)Cas9的序列及生物條形碼序列的E14胚胎干細(xì)胞經(jīng)Cre誘導(dǎo)之后,挑單克隆測(cè)序分析顯示,21株細(xì)胞中僅2株單克隆細(xì)胞生物條形碼保持原來(lái)的基因型,另外19株有18種不同的基因型。成功建立了可進(jìn)行時(shí)空調(diào)控地在細(xì)胞內(nèi)高效添加特異且相對(duì)穩(wěn)定的生物條形碼標(biāo)記的方法。
生物條形碼;CRISPR/Cas9;細(xì)胞標(biāo)記
細(xì)胞標(biāo)記在應(yīng)用于細(xì)胞譜系追蹤,癌細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)程之中各細(xì)胞的異質(zhì)性追蹤等有重要意義。目前細(xì)胞標(biāo)記的方法有多種,如用染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記[1],不同基因背景胚胎的雜交嵌合標(biāo)記[2],外源性DNA如病毒等插入細(xì)胞基因組進(jìn)行標(biāo)記[3,4],基因重組進(jìn)行特異性標(biāo)記[5,6],多種熒光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記[7],以及自然發(fā)生的體細(xì)胞突變標(biāo)記等[8-10]。盡管這些方法已經(jīng)被應(yīng)用于各種細(xì)胞的標(biāo)記,然而其存在的一些問(wèn)題限制了其應(yīng)用,如標(biāo)記的種類(lèi)少,標(biāo)記效率低下,標(biāo)記逐漸被稀釋?zhuān)幌嚓P(guān)的細(xì)胞被標(biāo)記或者檢測(cè)太困難等等。
CRISPR/Cas9 在基因編輯領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,Cas9 能夠在sgRNA的指導(dǎo)下對(duì)基因組進(jìn)行特異性切割,產(chǎn)生雙鏈斷裂,之后通過(guò)非同源性末端接合(Non-homologous end joining,NHEJ)或者同源指導(dǎo)修復(fù)(Homology directed repair,HDR)對(duì)斷裂的DNA雙鏈進(jìn)行隨機(jī)修復(fù),以此產(chǎn)生多種不同的基因型[11-13]。最近,人們?cè)谟糜谧V系追蹤的合成靶標(biāo)陣列基因組編輯技術(shù)(Genome editing of synthetic target arrays for lineage tracing,GESTALT)中利用CRISPR/ Cas9能夠?qū)Υ罅康募?xì)胞添加不同的生物條形碼,實(shí)現(xiàn)對(duì)不同的細(xì)胞進(jìn)行不同的標(biāo)記,并且這種標(biāo)記能夠遺傳給后代子細(xì)胞,同時(shí),對(duì)這些不同標(biāo)記的檢測(cè)也相對(duì)比較簡(jiǎn)單[14]。GESTALT用于細(xì)胞標(biāo)記時(shí)在細(xì)胞基因組內(nèi)插入10個(gè) sgRNA識(shí)別位點(diǎn)序列,每個(gè)識(shí)別位點(diǎn)由3 bp 堿基分開(kāi),通過(guò)Cas9對(duì)這10個(gè)相對(duì)獨(dú)立位點(diǎn)不同的切割方式,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞不同的標(biāo)記[14]。GESTALT 能對(duì)大量細(xì)胞添加上千種不同的相對(duì)容易檢測(cè)的標(biāo)記的特點(diǎn),使其在應(yīng)用于對(duì)大量細(xì)胞的譜系追蹤時(shí)有著重要的意義。其在研究生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中各個(gè)器官來(lái)源及不同發(fā)育階段不同細(xì)胞的來(lái)源有著很好的應(yīng)用前景;另外對(duì)于研究癌癥中不同癌細(xì)胞來(lái)源、癌細(xì)胞遷徙等,GESTALT提供了一個(gè)很好的工具。
然而,GESTALT技術(shù)的生物條形碼有多個(gè)連續(xù)的Cas9 切割位點(diǎn),每個(gè)切割位點(diǎn)相對(duì)獨(dú)立,Cas9會(huì)對(duì)細(xì)胞中的生物條形碼進(jìn)行多次切割,故而將會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的丟失或者紊亂。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新的含有6 個(gè)相互重疊 sgRNA 識(shí)別位點(diǎn)的生物條形碼序列對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,我們稱(chēng)該方法為 Barcode 技術(shù)。通過(guò) Barcode 技術(shù),期望能夠高效且穩(wěn)定地對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,以解決 GESTALT 技術(shù)中生物條形碼序列被多次切割導(dǎo)致標(biāo)記紊亂的問(wèn)題。
1.1 材料
DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司;Taq酶、DNA marker DL2000、DL15000購(gòu)自南京諾唯贊生物科技公司;T4 ligase、限制性酶切酶購(gòu)自Thermo Fisher Scientific有限公司;NEBuilder Master Mix重組試劑盒購(gòu)自NEB生物科技公司;Gibson Assembly? Master Mix重組試劑盒購(gòu)自NEB;Lipofectamine 3000 Reagent 購(gòu)自Invitrogen;ClonExpress Entry One Step Cloning Kit購(gòu)自南京諾為贊生物科技有限公司;PBCMV-mcherry 質(zhì)粒、PB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒、PB-CAG-LSLCas9-T2A-GFP 質(zhì)粒及Cre表達(dá)質(zhì)粒來(lái)自神經(jīng)神學(xué)研究所楊輝組;大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)自2ndLab。
小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株N2a、小鼠胚胎干細(xì)胞E14購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);E14細(xì)胞培養(yǎng)基 中FBS 及Pen/Strep購(gòu) 自Gibco;DMEM、Non-Essential Amino Acid、Nucleosides、L-glutamine及 2-mercaptoethanol購(gòu) 自 Millipore;PD0325901、CHIR99021購(gòu)自 Sellck;N2a細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM、FBS加上pen/strep,來(lái)源與上述相同。細(xì)胞流式分選于神經(jīng)科學(xué)研究所流式細(xì)胞分選平臺(tái)操作。
1.2 方法
1.2.1 引物設(shè)計(jì) 采用Snapgene軟件設(shè)計(jì)引物,質(zhì)粒測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成,PCR擴(kuò)增引物由上海華津生物科技有限公司合成。
1.2.2 Barcode V1質(zhì)粒的構(gòu)建 Barcode序列被設(shè)計(jì)成6個(gè)重疊的CRISPR/Cas9靶序列,包含23 bp的protospacer序列和PAM序列,其序列為5′-taac agtagccagacctaccaaaggactggcatggatgatccg-3′,設(shè)計(jì)引物Barcode target-F:5′-ggctctatggcggcgcgcctaacagtagccag acctaccaaaggactggc-3′和 Barcode target-R:5′-caaaac ttttaggcgcgtcggatcatccatgccagtcctttggtagg-3′,通過(guò)兩條引物進(jìn)行退火,用重組酶(ClonExpress Entry One Step Cloning Kit)將其插入AscI線性化的PB轉(zhuǎn)座子CMV-mcherry過(guò)表達(dá)質(zhì)粒內(nèi);分別構(gòu)建出6個(gè)靶向Barcode序列的sgRNA質(zhì)粒(表1),利用Gibson Assembly? Master Mix重組試劑盒將6個(gè)U6-sgRNA序列串聯(lián)到一起。構(gòu)建出Barcode V1質(zhì)粒,元件依次 為PB 5′ arm-6*U6-sgRNA-pCMV-mCherry-WPREPolyA-Barcode-PB 3′ arm。
1.2.3 Barcode V2質(zhì)粒的構(gòu)建 將含有6個(gè)U6-sgRNA片段和Barcode靶位點(diǎn)序列插入到PB-CAG-LSL-Cas9-T2A-GFP的Cre依賴(lài)表達(dá)的Cas9過(guò)表達(dá)載體中,其中LSL為loxp-stop-loxp,這種設(shè)計(jì)使Cas9的表達(dá)受Cre的調(diào)控,GFP的強(qiáng)度反映Cas9的表達(dá)情況。通過(guò)Gibson Assembly? Master Mix重組試劑盒構(gòu)建Barcode V2質(zhì)粒,其元件依次為:PB 5′armpCAG-LSL-Cas9-T2A-GFP-WPRE-PolyA-6*U6-sgRNA-pCMV-mCherry-WPRE-PolyA-Barcode-PB 3′arm。
表1 靶向Barcode序列的sgRNA
1.2.4 Barcode 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立 利用Lipofectamine 3000 Reagent 試劑盒將Barcode質(zhì)粒及PB轉(zhuǎn)座酶表達(dá)質(zhì)粒等質(zhì)粒共轉(zhuǎn)N2a細(xì)胞或者E14細(xì)胞系。細(xì)胞傳代至六孔板2 d 生長(zhǎng)至較密集狀態(tài)后,取Opti-MEM 100 μL 與5 μL P3000、3.5 μg Barcode 質(zhì)粒及1.5 μg PB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)?;旌?;取另一EP管加入100 μL Opti-MEM 和5 μL Lipo 3000。進(jìn)一步將兩者混合,孵化5 min。將混合液加入N2a 細(xì)胞或者E14細(xì)胞中增養(yǎng)12 h 后換液培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72 h 后通過(guò)流式分選出m-Cherry陽(yáng)性細(xì)胞,培養(yǎng)5 d 后挑取單細(xì)胞克隆測(cè)序。
1.2.5 驗(yàn)證Cas9 對(duì)Barcode序列的切割 通過(guò)Suveryor assay 檢測(cè)Cas9 序列對(duì)Barcode序列的切割[11]。提取E14單克隆細(xì)胞的基因組,用Sequencing PCR primer-F:5′-cggacatttaggtgacactataggca-3′及 Sequencing PCR primer-R:5′-acgtaatacgactcactatagggcgg -3′將Barcode序列通過(guò)PCR從細(xì)胞基因組中擴(kuò)增出來(lái)。進(jìn)一步用Suveryor nuclease 切割PCR產(chǎn)物,將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳;另取部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。
2.1 Barcode序列的設(shè)計(jì)
Barcode序列如圖1所示,包含有6 個(gè)相互重疊的sgRNAs 靶向位點(diǎn),當(dāng)其中一個(gè)sgRNA位點(diǎn)被Cas9 切割之后將破壞所有的sgRNA 識(shí)別位點(diǎn),使Barcode序列只能被Cas9 切割一次。6個(gè)sgRNA的靶向序列在NCBI中通過(guò)Blast比對(duì),確定在小鼠基因組中沒(méi)有完全匹配的序列,避免了sgRNA切割小鼠內(nèi)源基因組DNA的可能。
圖1 Barcode序列
2.2 Cas9在N2a細(xì)胞中能對(duì)Barcode序列進(jìn)行切割
將構(gòu)建的Barcode V1質(zhì)粒(圖2-A)通過(guò)PB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)入到含有Doxycycline 誘導(dǎo)表達(dá)Cas9 的N2a細(xì)胞中,加入Doxycycline誘導(dǎo)之后,Suveryor assay結(jié)果(圖2-B)顯示Cas9 能夠?qū)arcode序列切割。PCR產(chǎn)物連接T載體,挑取9個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果(圖2-C)顯示6個(gè)單克隆產(chǎn)生不同的堿基缺失,3個(gè)克隆產(chǎn)生不同的堿基插入。說(shuō)明Cas9對(duì)Barcode序列能夠切割并能產(chǎn)生多種基因型。
2.3 Barcode V2穩(wěn)轉(zhuǎn)胚胎干細(xì)胞系的建立
將Barcode V2(圖3-A)質(zhì)粒用PB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)入E14小鼠胚胎干細(xì)胞系中,培養(yǎng)72 h 后流式分選。通過(guò)熒光顯微鏡可觀察到生長(zhǎng)出的單克隆中均有mCherry的表達(dá)(圖3-B),說(shuō)明目標(biāo)序列成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞之中。通過(guò)對(duì)挑取的Barcode V2 E14單克隆細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序(圖3-C,成功獲得帶有Barcode序列的穩(wěn)轉(zhuǎn)株,稱(chēng)其為Barcode V2 E14穩(wěn)轉(zhuǎn)株)。
2.4 Cre調(diào)控下的對(duì)細(xì)胞的特異性的標(biāo)記
將Cre質(zhì)粒用PB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)入Barcode V2 E14穩(wěn)轉(zhuǎn)株內(nèi),分選出GFP陽(yáng)性細(xì)胞,即Cas9表達(dá)的細(xì)胞。挑單克隆細(xì)胞對(duì)Barcode序列進(jìn)行測(cè)序分析顯示,所挑的21株單克隆細(xì)胞中,2株單克隆細(xì)胞的Barcode序列為WT基因型,另外19株有18種不同的基因型(圖4)。證明該系統(tǒng)能夠高效地在Barcode區(qū)域產(chǎn)生不同的基因型,即對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的標(biāo)記。
圖2 Cas9在N2a細(xì)胞中對(duì)Barcode序列的切割
圖3 帶有Cre 調(diào)控的Cas9和Barcode序列的穩(wěn)轉(zhuǎn)E14細(xì)胞株的建立
Barcode技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)插入一段含有6個(gè)相互重疊的sgRNA識(shí)別位點(diǎn)的DNA序列,利用Cas9對(duì)這段序列不同的切割方式及不同的修復(fù)方式,給不同的細(xì)胞隨機(jī)加上不同的標(biāo)記。通過(guò)對(duì)這一小段序列的測(cè)序即可對(duì)細(xì)胞的不同來(lái)源進(jìn)行標(biāo)記。相對(duì)于以往的細(xì)胞標(biāo)記方式,Barcode技術(shù)有很多種優(yōu)勢(shì):(1)標(biāo)記效率很高,細(xì)胞被特異性標(biāo)記的概率高達(dá)90.5%;(2)標(biāo)記方式種類(lèi)多,6種不同的切割方式及多種不同的修復(fù)方式可以對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行不同的標(biāo)記;(3)分析相對(duì)很簡(jiǎn)單,只需對(duì)一小段序列進(jìn)行測(cè)序即可識(shí)別不同的標(biāo)記;(4)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)記的時(shí)空調(diào)控,如利用Tet-on 或者Cre-loxP 系統(tǒng)條件性控制對(duì)細(xì)胞的標(biāo)記。特別是其應(yīng)用于譜系追蹤或發(fā)育譜研究時(shí),新設(shè)計(jì)的Barcode 序列可以給細(xì)胞系添加多種穩(wěn)定的標(biāo)記,對(duì)于長(zhǎng)時(shí)程及復(fù)雜的追蹤有重要意義。
圖4 Barcode 序列經(jīng)Cas9切割后的測(cè)序結(jié)果
Barcode技術(shù)與GESTALT相比,都是利用CRISPR/Cas9 對(duì)一含有多個(gè)sgRNA識(shí)別位點(diǎn)的DNA序列——合成靶標(biāo)陣列進(jìn)行切割,通過(guò)不同的修復(fù)方式,從而產(chǎn)生多種不同的細(xì)胞標(biāo)記。其共同的優(yōu)點(diǎn)有:(1)可以同時(shí)對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記;(2)這種組合型多樣性突變能夠在一段密集的CRISPR/ Cas9 識(shí)別位點(diǎn)中產(chǎn)生;(3)通過(guò)對(duì)單個(gè)細(xì)胞中一小段序列的測(cè)序,即可得到大量細(xì)胞的標(biāo)記信息;(4)能夠應(yīng)用于包括細(xì)菌、植物及動(dòng)物等多種生物的細(xì)胞中[14]。不同之處在于,GESTALT的合成靶標(biāo)陣列由10個(gè)被3 bp 堿基隔開(kāi)的sgRNA識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)成,而B(niǎo)arcode 技術(shù)的合成靶標(biāo)陣列由6個(gè)相互重疊的sgRNA識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)成。Barcode技術(shù)的這種設(shè)計(jì)使得合成的靶標(biāo)陣列被Cas9切割之后產(chǎn)生的標(biāo)記在細(xì)胞后續(xù)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程之中不會(huì)發(fā)生變化,即對(duì)于每個(gè)細(xì)胞中的合成靶標(biāo)陣列,Cas9只會(huì)切割一次,不會(huì)因?yàn)镃as9的多次切割導(dǎo)致標(biāo)記的丟失或者紊亂,分析相對(duì)更加簡(jiǎn)單。而GESTALT中的合成靶標(biāo)陣列由于每個(gè)sgRNA識(shí)別位點(diǎn)相對(duì)獨(dú)立,致使其會(huì)被Cas9多次切割,導(dǎo)致標(biāo)記的紊亂,后續(xù)的分析過(guò)程將會(huì)很復(fù)雜。Barcode 技術(shù)與GESTALT相比缺點(diǎn)是產(chǎn)生的標(biāo)記種類(lèi)相對(duì)較少。一個(gè)可能的解決方法是在Barcode序列中加入更多的sgRNA 識(shí)別位點(diǎn),或者設(shè)計(jì)多個(gè)不同的Barcode位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記,以此來(lái)增加標(biāo)記種類(lèi)的多樣性,劣勢(shì)是增加了Cas9多次切割的概率,導(dǎo)致標(biāo)記的丟失或者紊亂。但是與GESTALT相比,標(biāo)記的穩(wěn)定性相對(duì)要高很多。可以根據(jù)研究目的在標(biāo)記數(shù)量和標(biāo)記穩(wěn)定性方面尋求一個(gè)平衡,并在標(biāo)記的時(shí)間點(diǎn)及位置上進(jìn)行控制,以達(dá)到精確標(biāo)記細(xì)胞的目的。另外一種解決方法是將兩個(gè)或者兩個(gè)以上的Barcode序列插入細(xì)胞基因組中不同的位置,這種設(shè)計(jì)避免了Cas9對(duì)同一位點(diǎn)多次切割導(dǎo)致的標(biāo)記紊亂,同時(shí)增加了標(biāo)記的多樣性。
利用Barcode技術(shù),可以對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行高效的、多樣的、相對(duì)穩(wěn)定的標(biāo)記,通過(guò)對(duì)一小段序列的測(cè)序可以讀出這些不同的標(biāo)記。利用重組酶Cre來(lái)調(diào)節(jié)Cas9的表達(dá),能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)胞標(biāo)記的時(shí)空調(diào)控和小鼠體內(nèi)的組織特異性調(diào)控。
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(責(zé)任編輯 李楠)
A Novel Approach to Establish Bio-barcode in Cells by CRISPR/Cas9
WEI Yu1ZHOU Chang-yang2LI Yan-li1
(1. College of Life Sciences,Shanghai University,Shanghai 200444;2. Institute of Neuroscience,Shanghai 200031)
The aim of this study is to add bio-barcode in cells by CRISPR/Cas9 for differentially marking the cells. The bio-barcode sequence,conditional induced Cas9 sequence and the corresponding sgRNA sequence were integrated into the cell through the PB enzyme,and then the cell markers were analyzed by sequencing the bio-barcode after inducing the expression of Cas9. The designed bio-barcode sequence contained 6 sgRNA target sites overlapping each other,which allowed the bio-barcode sequence to be spliced only once by Cas9. As results,the designed bio-barcode sequence in N2a cells after Dox induction was efficiently spliced by Cas9,and there were 9 different genotypes among 9 clones. After Cre inducing the E14 embryonic stem cells containing Cas9 sequence regulated by loxp-stop-loxp and biobarcode sequence,monoclonal sequencing showed that only 2 monoclonal cells of 21 cell lines remained the original genotype,and the rest 19 strains presented 18 different genotypes respectively. In summary,this study established a novel approach to spatio-temporally add bio-barcode markers with high specificity and relative stability into cells.
bio-barcode;CRISPR/Cas9;cell marking
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0087
2017-02-10
新藥研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(SIMM1601KF12)
魏喻,男,碩士,研究方向:細(xì)胞重編程與胚胎發(fā)育;E-mail:hustweiyu@163.com
李艷利,女,博士,研究方向:腫瘤的分子治療;E-mail:liyanli@shu.edu.cn