魏喻周昌陽(yáng)李艷利

（1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2. 神經(jīng)學(xué)科學(xué)研究所，上海 200031）

一種利用CRISPR/Cas9 對(duì)細(xì)胞添加生物條形碼的新方法

魏喻1周昌陽(yáng)2李艷利1

（1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2. 神經(jīng)學(xué)科學(xué)研究所，上海 200031）

旨在利用CRISPR/Cas9對(duì)細(xì)胞添加不同的生物條形碼（Barcode），實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同的標(biāo)記。將生物條形碼序列、條件誘導(dǎo)性Cas9序列及相應(yīng)的sgRNA序列通過(guò)PB酶整合到細(xì)胞中，誘導(dǎo)Cas9表達(dá)之后對(duì)生物條形碼序列測(cè)序分析細(xì)胞的標(biāo)記情況。所設(shè)計(jì)的生物條形碼含有6個(gè)相互重疊的sgRNA 識(shí)別位點(diǎn)，這種設(shè)計(jì)可以使條形碼序列只會(huì)被Cas9切割一次。結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)的生物條形碼序列在N2a細(xì)胞中經(jīng)Dox誘導(dǎo)之后能夠高效地被Cas9切割，所挑的9個(gè)克隆中，生物條形碼序列有9種不同的基因型。含有受loxp-stop-loxp 調(diào)控表達(dá)Cas9的序列及生物條形碼序列的E14胚胎干細(xì)胞經(jīng)Cre誘導(dǎo)之后，挑單克隆測(cè)序分析顯示，21株細(xì)胞中僅2株單克隆細(xì)胞生物條形碼保持原來(lái)的基因型，另外19株有18種不同的基因型。成功建立了可進(jìn)行時(shí)空調(diào)控地在細(xì)胞內(nèi)高效添加特異且相對(duì)穩(wěn)定的生物條形碼標(biāo)記的方法。

生物條形碼；CRISPR/Cas9；細(xì)胞標(biāo)記

細(xì)胞標(biāo)記在應(yīng)用于細(xì)胞譜系追蹤，癌細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)程之中各細(xì)胞的異質(zhì)性追蹤等有重要意義。目前細(xì)胞標(biāo)記的方法有多種，如用染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記［1］，不同基因背景胚胎的雜交嵌合標(biāo)記［2］，外源性DNA如病毒等插入細(xì)胞基因組進(jìn)行標(biāo)記［3，4］，基因重組進(jìn)行特異性標(biāo)記［5，6］，多種熒光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記［7］，以及自然發(fā)生的體細(xì)胞突變標(biāo)記等［8-10］。盡管這些方法已經(jīng)被應(yīng)用于各種細(xì)胞的標(biāo)記，然而其存在的一些問(wèn)題限制了其應(yīng)用，如標(biāo)記的種類(lèi)少，標(biāo)記效率低下，標(biāo)記逐漸被稀釋?zhuān)幌嚓P(guān)的細(xì)胞被標(biāo)記或者檢測(cè)太困難等等。

CRISPR/Cas9 在基因編輯領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，Cas9 能夠在sgRNA的指導(dǎo)下對(duì)基因組進(jìn)行特異性切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂，之后通過(guò)非同源性末端接合（Non-homologous end joining，NHEJ）或者同源指導(dǎo)修復(fù)（Homology directed repair，HDR）對(duì)斷裂的DNA雙鏈進(jìn)行隨機(jī)修復(fù)，以此產(chǎn)生多種不同的基因型［11-13］。最近，人們?cè)谟糜谧V系追蹤的合成靶標(biāo)陣列基因組編輯技術(shù)（Genome editing of synthetic target arrays for lineage tracing，GESTALT）中利用CRISPR/ Cas9能夠?qū)Υ罅康募?xì)胞添加不同的生物條形碼，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同的細(xì)胞進(jìn)行不同的標(biāo)記，并且這種標(biāo)記能夠遺傳給后代子細(xì)胞，同時(shí)，對(duì)這些不同標(biāo)記的檢測(cè)也相對(duì)比較簡(jiǎn)單［14］。GESTALT用于細(xì)胞標(biāo)記時(shí)在細(xì)胞基因組內(nèi)插入10個(gè) sgRNA識(shí)別位點(diǎn)序列，每個(gè)識(shí)別位點(diǎn)由3 bp 堿基分開(kāi)，通過(guò)Cas9對(duì)這10個(gè)相對(duì)獨(dú)立位點(diǎn)不同的切割方式，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞不同的標(biāo)記［14］。GESTALT 能對(duì)大量細(xì)胞添加上千種不同的相對(duì)容易檢測(cè)的標(biāo)記的特點(diǎn)，使其在應(yīng)用于對(duì)大量細(xì)胞的譜系追蹤時(shí)有著重要的意義。其在研究生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中各個(gè)器官來(lái)源及不同發(fā)育階段不同細(xì)胞的來(lái)源有著很好的應(yīng)用前景；另外對(duì)于研究癌癥中不同癌細(xì)胞來(lái)源、癌細(xì)胞遷徙等，GESTALT提供了一個(gè)很好的工具。

然而，GESTALT技術(shù)的生物條形碼有多個(gè)連續(xù)的Cas9 切割位點(diǎn)，每個(gè)切割位點(diǎn)相對(duì)獨(dú)立，Cas9會(huì)對(duì)細(xì)胞中的生物條形碼進(jìn)行多次切割，故而將會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的丟失或者紊亂。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新的含有6 個(gè)相互重疊 sgRNA 識(shí)別位點(diǎn)的生物條形碼序列對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，我們稱(chēng)該方法為 Barcode 技術(shù)。通過(guò) Barcode 技術(shù)，期望能夠高效且穩(wěn)定地對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，以解決 GESTALT 技術(shù)中生物條形碼序列被多次切割導(dǎo)致標(biāo)記紊亂的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料

DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司；Taq酶、DNA marker DL2000、DL15000購(gòu)自南京諾唯贊生物科技公司；T4 ligase、限制性酶切酶購(gòu)自Thermo Fisher Scientific有限公司；NEBuilder Master Mix重組試劑盒購(gòu)自NEB生物科技公司；Gibson Assembly? Master Mix重組試劑盒購(gòu)自NEB；Lipofectamine 3000 Reagent 購(gòu)自Invitrogen；ClonExpress Entry One Step Cloning Kit購(gòu)自南京諾為贊生物科技有限公司；PBCMV-mcherry 質(zhì)粒、PB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒、PB-CAG-LSLCas9-T2A-GFP 質(zhì)粒及Cre表達(dá)質(zhì)粒來(lái)自神經(jīng)神學(xué)研究所楊輝組；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)自2ndLab。

小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株N2a、小鼠胚胎干細(xì)胞E14購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；E14細(xì)胞培養(yǎng)基 中FBS 及Pen/Strep購(gòu) 自Gibco；DMEM、Non-Essential Amino Acid、Nucleosides、L-glutamine及 2-mercaptoethanol購(gòu) 自 Millipore；PD0325901、CHIR99021購(gòu)自 Sellck；N2a細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM、FBS加上pen/strep，來(lái)源與上述相同。細(xì)胞流式分選于神經(jīng)科學(xué)研究所流式細(xì)胞分選平臺(tái)操作。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 采用Snapgene軟件設(shè)計(jì)引物，質(zhì)粒測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，PCR擴(kuò)增引物由上海華津生物科技有限公司合成。

1.2.2 Barcode V1質(zhì)粒的構(gòu)建 Barcode序列被設(shè)計(jì)成6個(gè)重疊的CRISPR/Cas9靶序列，包含23 bp的protospacer序列和PAM序列，其序列為5′-taac agtagccagacctaccaaaggactggcatggatgatccg-3′，設(shè)計(jì)引物Barcode target-F：5′-ggctctatggcggcgcgcctaacagtagccag acctaccaaaggactggc-3′和 Barcode target-R：5′-caaaac ttttaggcgcgtcggatcatccatgccagtcctttggtagg-3′，通過(guò)兩條引物進(jìn)行退火，用重組酶（ClonExpress Entry One Step Cloning Kit）將其插入AscI線性化的PB轉(zhuǎn)座子CMV-mcherry過(guò)表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)；分別構(gòu)建出6個(gè)靶向Barcode序列的sgRNA質(zhì)粒（表1），利用Gibson Assembly? Master Mix重組試劑盒將6個(gè)U6-sgRNA序列串聯(lián)到一起。構(gòu)建出Barcode V1質(zhì)粒，元件依次 為PB 5′ arm-6*U6-sgRNA-pCMV-mCherry-WPREPolyA-Barcode-PB 3′ arm。

1.2.3 Barcode V2質(zhì)粒的構(gòu)建 將含有6個(gè)U6-sgRNA片段和Barcode靶位點(diǎn)序列插入到PB-CAG-LSL-Cas9-T2A-GFP的Cre依賴(lài)表達(dá)的Cas9過(guò)表達(dá)載體中，其中LSL為loxp-stop-loxp，這種設(shè)計(jì)使Cas9的表達(dá)受Cre的調(diào)控，GFP的強(qiáng)度反映Cas9的表達(dá)情況。通過(guò)Gibson Assembly? Master Mix重組試劑盒構(gòu)建Barcode V2質(zhì)粒，其元件依次為：PB 5′armpCAG-LSL-Cas9-T2A-GFP-WPRE-PolyA-6*U6-sgRNA-pCMV-mCherry-WPRE-PolyA-Barcode-PB 3′arm。

表1 靶向Barcode序列的sgRNA

1.2.4 Barcode 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立 利用Lipofectamine 3000 Reagent 試劑盒將Barcode質(zhì)粒及PB轉(zhuǎn)座酶表達(dá)質(zhì)粒等質(zhì)粒共轉(zhuǎn)N2a細(xì)胞或者E14細(xì)胞系。細(xì)胞傳代至六孔板2 d 生長(zhǎng)至較密集狀態(tài)后，取Opti-MEM 100 μL 與5 μL P3000、3.5 μg Barcode 質(zhì)粒及1.5 μg PB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)?；旌?；取另一EP管加入100 μL Opti-MEM 和5 μL Lipo 3000。進(jìn)一步將兩者混合，孵化5 min。將混合液加入N2a 細(xì)胞或者E14細(xì)胞中增養(yǎng)12 h 后換液培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72 h 后通過(guò)流式分選出m-Cherry陽(yáng)性細(xì)胞，培養(yǎng)5 d 后挑取單細(xì)胞克隆測(cè)序。

1.2.5 驗(yàn)證Cas9 對(duì)Barcode序列的切割 通過(guò)Suveryor assay 檢測(cè)Cas9 序列對(duì)Barcode序列的切割［11］。提取E14單克隆細(xì)胞的基因組，用Sequencing PCR primer-F：5′-cggacatttaggtgacactataggca-3′及 Sequencing PCR primer-R：5′-acgtaatacgactcactatagggcgg -3′將Barcode序列通過(guò)PCR從細(xì)胞基因組中擴(kuò)增出來(lái)。進(jìn)一步用Suveryor nuclease 切割PCR產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；另取部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。

2 結(jié)果

2.1 Barcode序列的設(shè)計(jì)

Barcode序列如圖1所示，包含有6 個(gè)相互重疊的sgRNAs 靶向位點(diǎn)，當(dāng)其中一個(gè)sgRNA位點(diǎn)被Cas9 切割之后將破壞所有的sgRNA 識(shí)別位點(diǎn)，使Barcode序列只能被Cas9 切割一次。6個(gè)sgRNA的靶向序列在NCBI中通過(guò)Blast比對(duì)，確定在小鼠基因組中沒(méi)有完全匹配的序列，避免了sgRNA切割小鼠內(nèi)源基因組DNA的可能。

圖1 Barcode序列

2.2 Cas9在N2a細(xì)胞中能對(duì)Barcode序列進(jìn)行切割

將構(gòu)建的Barcode V1質(zhì)粒（圖2-A）通過(guò)PB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)入到含有Doxycycline 誘導(dǎo)表達(dá)Cas9 的N2a細(xì)胞中，加入Doxycycline誘導(dǎo)之后，Suveryor assay結(jié)果（圖2-B）顯示Cas9 能夠?qū)arcode序列切割。PCR產(chǎn)物連接T載體，挑取9個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果（圖2-C）顯示6個(gè)單克隆產(chǎn)生不同的堿基缺失，3個(gè)克隆產(chǎn)生不同的堿基插入。說(shuō)明Cas9對(duì)Barcode序列能夠切割并能產(chǎn)生多種基因型。

2.3 Barcode V2穩(wěn)轉(zhuǎn)胚胎干細(xì)胞系的建立

將Barcode V2（圖3-A）質(zhì)粒用PB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)入E14小鼠胚胎干細(xì)胞系中，培養(yǎng)72 h 后流式分選。通過(guò)熒光顯微鏡可觀察到生長(zhǎng)出的單克隆中均有mCherry的表達(dá)（圖3-B），說(shuō)明目標(biāo)序列成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞之中。通過(guò)對(duì)挑取的Barcode V2 E14單克隆細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序（圖3-C，成功獲得帶有Barcode序列的穩(wěn)轉(zhuǎn)株，稱(chēng)其為Barcode V2 E14穩(wěn)轉(zhuǎn)株）。

2.4 Cre調(diào)控下的對(duì)細(xì)胞的特異性的標(biāo)記

將Cre質(zhì)粒用PB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)入Barcode V2 E14穩(wěn)轉(zhuǎn)株內(nèi)，分選出GFP陽(yáng)性細(xì)胞，即Cas9表達(dá)的細(xì)胞。挑單克隆細(xì)胞對(duì)Barcode序列進(jìn)行測(cè)序分析顯示，所挑的21株單克隆細(xì)胞中，2株單克隆細(xì)胞的Barcode序列為WT基因型，另外19株有18種不同的基因型（圖4）。證明該系統(tǒng)能夠高效地在Barcode區(qū)域產(chǎn)生不同的基因型，即對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的標(biāo)記。

3 討論

圖2 Cas9在N2a細(xì)胞中對(duì)Barcode序列的切割

圖3 帶有Cre 調(diào)控的Cas9和Barcode序列的穩(wěn)轉(zhuǎn)E14細(xì)胞株的建立

Barcode技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)插入一段含有6個(gè)相互重疊的sgRNA識(shí)別位點(diǎn)的DNA序列，利用Cas9對(duì)這段序列不同的切割方式及不同的修復(fù)方式，給不同的細(xì)胞隨機(jī)加上不同的標(biāo)記。通過(guò)對(duì)這一小段序列的測(cè)序即可對(duì)細(xì)胞的不同來(lái)源進(jìn)行標(biāo)記。相對(duì)于以往的細(xì)胞標(biāo)記方式，Barcode技術(shù)有很多種優(yōu)勢(shì)：（1）標(biāo)記效率很高，細(xì)胞被特異性標(biāo)記的概率高達(dá)90.5%；（2）標(biāo)記方式種類(lèi)多，6種不同的切割方式及多種不同的修復(fù)方式可以對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行不同的標(biāo)記；（3）分析相對(duì)很簡(jiǎn)單，只需對(duì)一小段序列進(jìn)行測(cè)序即可識(shí)別不同的標(biāo)記；（4）可以實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)記的時(shí)空調(diào)控，如利用Tet-on 或者Cre-loxP 系統(tǒng)條件性控制對(duì)細(xì)胞的標(biāo)記。特別是其應(yīng)用于譜系追蹤或發(fā)育譜研究時(shí)，新設(shè)計(jì)的Barcode 序列可以給細(xì)胞系添加多種穩(wěn)定的標(biāo)記，對(duì)于長(zhǎng)時(shí)程及復(fù)雜的追蹤有重要意義。

圖4 Barcode 序列經(jīng)Cas9切割后的測(cè)序結(jié)果

Barcode技術(shù)與GESTALT相比，都是利用CRISPR/Cas9 對(duì)一含有多個(gè)sgRNA識(shí)別位點(diǎn)的DNA序列——合成靶標(biāo)陣列進(jìn)行切割，通過(guò)不同的修復(fù)方式，從而產(chǎn)生多種不同的細(xì)胞標(biāo)記。其共同的優(yōu)點(diǎn)有：（1）可以同時(shí)對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記；（2）這種組合型多樣性突變能夠在一段密集的CRISPR/ Cas9 識(shí)別位點(diǎn)中產(chǎn)生；（3）通過(guò)對(duì)單個(gè)細(xì)胞中一小段序列的測(cè)序，即可得到大量細(xì)胞的標(biāo)記信息；（4）能夠應(yīng)用于包括細(xì)菌、植物及動(dòng)物等多種生物的細(xì)胞中［14］。不同之處在于，GESTALT的合成靶標(biāo)陣列由10個(gè)被3 bp 堿基隔開(kāi)的sgRNA識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)成，而B(niǎo)arcode 技術(shù)的合成靶標(biāo)陣列由6個(gè)相互重疊的sgRNA識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)成。Barcode技術(shù)的這種設(shè)計(jì)使得合成的靶標(biāo)陣列被Cas9切割之后產(chǎn)生的標(biāo)記在細(xì)胞后續(xù)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程之中不會(huì)發(fā)生變化，即對(duì)于每個(gè)細(xì)胞中的合成靶標(biāo)陣列，Cas9只會(huì)切割一次，不會(huì)因?yàn)镃as9的多次切割導(dǎo)致標(biāo)記的丟失或者紊亂，分析相對(duì)更加簡(jiǎn)單。而GESTALT中的合成靶標(biāo)陣列由于每個(gè)sgRNA識(shí)別位點(diǎn)相對(duì)獨(dú)立，致使其會(huì)被Cas9多次切割，導(dǎo)致標(biāo)記的紊亂，后續(xù)的分析過(guò)程將會(huì)很復(fù)雜。Barcode 技術(shù)與GESTALT相比缺點(diǎn)是產(chǎn)生的標(biāo)記種類(lèi)相對(duì)較少。一個(gè)可能的解決方法是在Barcode序列中加入更多的sgRNA 識(shí)別位點(diǎn)，或者設(shè)計(jì)多個(gè)不同的Barcode位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，以此來(lái)增加標(biāo)記種類(lèi)的多樣性，劣勢(shì)是增加了Cas9多次切割的概率，導(dǎo)致標(biāo)記的丟失或者紊亂。但是與GESTALT相比，標(biāo)記的穩(wěn)定性相對(duì)要高很多。可以根據(jù)研究目的在標(biāo)記數(shù)量和標(biāo)記穩(wěn)定性方面尋求一個(gè)平衡，并在標(biāo)記的時(shí)間點(diǎn)及位置上進(jìn)行控制，以達(dá)到精確標(biāo)記細(xì)胞的目的。另外一種解決方法是將兩個(gè)或者兩個(gè)以上的Barcode序列插入細(xì)胞基因組中不同的位置，這種設(shè)計(jì)避免了Cas9對(duì)同一位點(diǎn)多次切割導(dǎo)致的標(biāo)記紊亂，同時(shí)增加了標(biāo)記的多樣性。

4 結(jié)論

利用Barcode技術(shù)，可以對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行高效的、多樣的、相對(duì)穩(wěn)定的標(biāo)記，通過(guò)對(duì)一小段序列的測(cè)序可以讀出這些不同的標(biāo)記。利用重組酶Cre來(lái)調(diào)節(jié)Cas9的表達(dá)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)胞標(biāo)記的時(shí)空調(diào)控和小鼠體內(nèi)的組織特異性調(diào)控。

［1］Keller RE. Vital dye mapping of the gastrula and neurula of Xenopus laevis［J］. Dev Biol, 1975, 42（2）：222-241.

［2］Le Douarin NM, Teillet M-AM. Experimental analysis of the migration and differentiation of neuroblasts of the autonomic nervous system and of neurectodermal mesenchymal derivatives, using a biological cell marking technique［J］. Dev Biol, 1974, 41（1）：162-184.

［3］Porter SN, Baker LC, Mittelman D, et al. Lentiviral and targeted cellular barcoding reveals ongoing clonal dynamics of cell lines in vitro and in vivo［J］. Genome Biol, 2014, 15（5）：R75.

［4］Lu R, Neff NF, Quake SR, et al. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding［J］. Nat Biotech, 2011, 29（10）：928-933.

［5］Harrison DA, Perrimon N. Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila［J］. Curr Biol, 1993, 3（7）：424-433.

［6］ Ohlstein B, Spradling A. The adult Drosophila posterior midgut is maintained by pluripotent stem cells［J］. Nature, 2006, 439（7075）：470-474.

［7］ Livet J, Weissman TA, Kang H, et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system［J］. Nature, 2007, 450（7166）：56-62.

［8］Salipante SJ, Horwitz MS. Phylogenetic fate mapping［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103（14）：5448-5453.

［9］ Behjati S, Huch M, van Boxtel R, et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes［J］. Nature, 2014, 513（7518）：422-425.

［10］ Lodato MA, Woodworth MB, Lee S, et al. Somatic mutation in single human neurons tracks developmental and transcriptional history［J］. Science, 2015, 350（6256）：94-98.

［11］ Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems［J］. Science, 2013, 339（6121）：819-823.

［12］ Wang H, Yang H, Shivalila CS, et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering［J］. Cell, 2013, 153（4）：910-918.

［13］ Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering［J］. Cell, 2014, 157（6）：1262-1278.

［14］ McKenna A, Findlay GM, Gagnon JA, et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing［J］. Science, 2016, 353（6298）：aaf7907.

（責(zé)任編輯 李楠）

A Novel Approach to Establish Bio-barcode in Cells by CRISPR/Cas9

WEI Yu1ZHOU Chang-yang2LI Yan-li1
（1. College of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444；2. Institute of Neuroscience，Shanghai 200031）

The aim of this study is to add bio-barcode in cells by CRISPR/Cas9 for differentially marking the cells. The bio-barcode sequence，conditional induced Cas9 sequence and the corresponding sgRNA sequence were integrated into the cell through the PB enzyme，and then the cell markers were analyzed by sequencing the bio-barcode after inducing the expression of Cas9. The designed bio-barcode sequence contained 6 sgRNA target sites overlapping each other，which allowed the bio-barcode sequence to be spliced only once by Cas9. As results，the designed bio-barcode sequence in N2a cells after Dox induction was efficiently spliced by Cas9，and there were 9 different genotypes among 9 clones. After Cre inducing the E14 embryonic stem cells containing Cas9 sequence regulated by loxp-stop-loxp and biobarcode sequence，monoclonal sequencing showed that only 2 monoclonal cells of 21 cell lines remained the original genotype，and the rest 19 strains presented 18 different genotypes respectively. In summary，this study established a novel approach to spatio-temporally add bio-barcode markers with high specificity and relative stability into cells.

bio-barcode；CRISPR/Cas9；cell marking

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0087

2017-02-10

新藥研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（SIMM1601KF12）

魏喻，男，碩士，研究方向：細(xì)胞重編程與胚胎發(fā)育；E-mail：hustweiyu@163.com

李艷利，女，博士，研究方向：腫瘤的分子治療；E-mail：liyanli@shu.edu.cn