王 頔, 張 早, 王張平, 印 紅

河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北省動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北 保定 071002

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意大利蝗血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ基因的克隆與原核表達(dá)

王 頔, 張 早, 王張平, 印 紅*

河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北省動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北 保定 071002

昆蟲血藍(lán)蛋白是在昆蟲體內(nèi)普遍存在的一種含Cu2+的多功能蛋白，除參與呼吸外還具有能量貯存、抗菌和抗病毒等多種生物學(xué)功能。為了研究意大利蝗(Calliptanusitalicus)血藍(lán)蛋白亞基CitHc-1的結(jié)構(gòu)和表達(dá)，通過RACE技術(shù)獲得了CitHc-1的全長cDNA(2 335 bp)序列，其中開放閱讀框2 079 bp，編碼692個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白分子量79.88 kDa。序列比對結(jié)果顯示CitHc-1基因cDNA序列與蝗總科其他物種血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ的cDNA序列的相似性為91%～94%。利用MEGA的NJ法構(gòu)建昆蟲綱血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示意大利蝗CitHc-1與東亞飛蝗LmiHc-1血藍(lán)蛋白遺傳距離最近形成姐妹群。為了研究血藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，成功構(gòu)建了意大利蝗CitHc-1基因活性區(qū)域的原核表達(dá)載體。融合蛋白pEASY-E1-Hc分子量約為32 kDa，與預(yù)期值一致，為進(jìn)一步分析意大利蝗C.italicusCitHc-1的功能提供了理論基礎(chǔ)。

意大利蝗；血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ；基因克??；表達(dá)分析；原核表達(dá)

血藍(lán)蛋白是位于節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物血淋巴中含銅的呼吸蛋白，脫氧狀態(tài)為無色，結(jié)合氧狀態(tài)為藍(lán)色[1]。血藍(lán)蛋白除載氧之外，還參與能量貯存、滲透壓的維持以及蛻皮過程的調(diào)節(jié)，是一種多功能蛋白[2,3]。近年來的研究表明，血藍(lán)蛋白還具有酚氧化物酶活性和抗菌功能[4]，在節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物體液免疫等生命活動(dòng)中扮演重要角色。

最近幾年的研究表明，血藍(lán)蛋白廣泛存在于昆蟲中[5～8]。在彈尾綱(Collembola)、石蛃目 (Archaeognatha)、直翅目(Orthoptera)和蜚蠊目(Blattodea)等多種六足動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了血藍(lán)蛋白。

節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白的基本結(jié)構(gòu)為六聚體，或由多個(gè)六聚體組成[9,10]。一個(gè)典型的節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白亞基的大小約為70～80 kDa，一般包含630～660個(gè)氨基酸，結(jié)構(gòu)分為三級[11,12]。第一個(gè)結(jié)構(gòu)域包括N端的150～180個(gè)氨基酸，主要由α螺旋組成，并通過超二級結(jié)構(gòu)形成穩(wěn)定的螺旋束；第二個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)棣谅菪齾^(qū)，螯合1對Cu2+，這兩個(gè)銅離子為血藍(lán)蛋白結(jié)合O2所必需；第三個(gè)結(jié)構(gòu)域主要由β折疊結(jié)構(gòu)組成，進(jìn)一步折疊為超二級結(jié)構(gòu)而形成反平行的7股β桶結(jié)構(gòu)[11,12]。研究表明，血藍(lán)蛋白廣泛存在于昆蟲中，但目前相關(guān)直翅目昆蟲血藍(lán)蛋白的研究非常少，迄今有Yin等[13]獲取了東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis) Hc1的完整序列，張新新等[14]構(gòu)建了東亞飛蝗血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ基因的原核表達(dá)并預(yù)測了其蛋白結(jié)構(gòu)。

意大利蝗(Calliptanusitalicus)，屬于節(jié)肢動(dòng)物門，昆蟲綱(Insecta)，直翅目(Orthoptera)，蝗總科(Acridoidea)，斑腿蝗科(Acridoidea)，星翅蝗屬(Calliptamus)[15]。主要分布于新疆及周邊國家和地區(qū)[16]。其取食范圍達(dá)17科45種植物，喜食冷蒿、新疆鼠尾草、黃花苜蓿等，每年給當(dāng)?shù)氐男竽翗I(yè)經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會造成嚴(yán)重?fù)p失[17]。本研究選取意大利蝗為實(shí)驗(yàn)材料，通過RACE技術(shù)獲得CitHc-1基因全長cDNA序列，進(jìn)而構(gòu)建CitHc-1的原核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) 表達(dá)系統(tǒng)中，SDS-PAGE 電泳表明，經(jīng)過 IPTG 誘導(dǎo)，目的基因可以高效表達(dá)[18]。同時(shí)預(yù)測了CitHc-1蛋白的高級結(jié)構(gòu)，以期進(jìn)一步探討直翅目昆蟲血藍(lán)蛋白的功能和作用機(jī)理，進(jìn)而為害蟲的綜合治理以及昆蟲資源的開發(fā)利用提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx 意大利蝗卵由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院劉玉升教授惠贈(zèng)，后由本實(shí)驗(yàn)室參照Gillespie等[19]的方法人工飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 pEASYTM-T3 Cloning試劑盒、EasyPureTMPCR Purification試劑盒和TransScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。LATaq酶、T4 DNA Ligase、RNAiso plus試劑盒、3′-full RACE Core Set Ver.2.0和5′-full RACE試劑盒購于TaKaRa公司。

1.2 意大利蝗CitHc-1基因的擴(kuò)增及序列分析

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 利用液氮將孵育24 h的意大利蝗卵冷凍，按照RNAiso Plus試劑盒說明提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix合成 cDNA。

表1 本研究所用引物

注： W=A/T， R=A/G， Y=C/T。

1.2.2CitHc-1基因引物的設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 利用已經(jīng)在Genbank上發(fā)表的東亞飛蝗血藍(lán)蛋白基因序列(登錄號：HQ213937)，設(shè)計(jì)引物(表1)，以cDNA為模板擴(kuò)增該基因保守片段，共3段, 分別為677 bp、500 bp和869 bp。PCR反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，LATaq酶0.5 μL，10 μmol/L引物Hem-F 0.5 μL，10 μmol/L引物Hem-R 0.5 μL，模板cDNA 2 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 1 min；94℃ 30 s，62℃(由引物Tm決定)30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。由深圳華大基因科技有限公司對其產(chǎn)物進(jìn)行測序。利用已經(jīng)得到的意大利蝗血藍(lán)蛋白部分片段，分別設(shè)計(jì)5′和3′RACE的引物序列(5-O、5-I、3-O、3-I)見表1，并按照試劑盒推薦的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行CitHc-1基因3′端和5′端序列的擴(kuò)增，回收目的片段，克隆后測序。

1.2.3 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析 在利用BioEdit生物學(xué)軟件對其序列進(jìn)行同源性分析之前，先利用ORF finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)分析完整的開放閱讀框并應(yīng)用SignalP軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)推測信號肽；對其完整基因序列以及推斷的氨基酸序列使用在線生物軟件RANSLATE (ExPASy Proteomics Server)進(jìn)行組分、理化性質(zhì)等生物信息學(xué)分析；血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ的結(jié)構(gòu)域通過NCBI上的CD Search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行預(yù)測分析；通過軟件SWISS-MODEL(http://swiss model. expasy.org/)推測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，此處主要采用同源建模方法。應(yīng)用ClustalX 1.81軟件和MEGA4.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining，NJ)對意大利蝗血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ與昆蟲綱其他多個(gè)物種血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹，并重復(fù)抽樣1 000次進(jìn)行Bootstrap檢驗(yàn)。

1.3 意大利蝗CitHc-1蛋白的原核表達(dá)

1.3.1CitHc-1活性區(qū)域的克隆 根據(jù)所得到的意大利蝗血藍(lán)蛋白基因CitHc-1序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增其活性區(qū)域的引物Hc-F/Hc-R，引物序列見表1。以cDNA為模板，Hc-F/Hc-R為引物，PCR擴(kuò)增CitHc-1的活性區(qū)域。反應(yīng)體系如下：2×GC BufferⅠ10 μL，2.5 mmol/L dNTP1.6 μL，LATaq酶0.2 μL，10 μmol/L引物Hc-F 1 μL，10 μmol/L引物Hc-R1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃(由引物Tm決定)30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將切膠回收純化后的目的片段于表達(dá)載體pEASYTM-E1進(jìn)行TA連接。重組載體命名為pEASY-E1-Hem。

1.3.2CitHc-1原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將測序正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。對在Amp的平板上篩選出來的陽性重組子進(jìn)行DNA測序分析，并將其命名為pEASY-E1-Hc/BL21(DE3)。

1.3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 把重組子接種于LB培養(yǎng)基(含Ampicilin)中，37℃過夜培養(yǎng)，然后取0.2 mL菌液接種于5 mL新培養(yǎng)基(含Ampicilin)中，37℃ 220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.6，取1 mL菌液于1.5 mL的離心管中，離心棄上清，收集菌體作為對照。在剩下的菌液中加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，然后取1 mL菌液，離心棄上清收集菌體沉淀，使其懸浮于0.01 mol/L PBS緩沖液中。隨后進(jìn)行超聲破碎，將完全變至澄清的菌液10 000 r/min離心3 min，收集上清和沉淀。最后，分別取全菌液、上清和沉淀的樣品進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，以檢測表達(dá)產(chǎn)物的可溶性。

2 結(jié)果與分析

2.1CitHc-1基因的克隆和序列分析

將利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆得到的CitHc-1基因全長，錄入GenBank數(shù)據(jù)庫，序列登錄號為JX204834。CitHc-1基因全長為2 335 bp，包含1個(gè)2 079 bp的完整開放閱讀框(ORF)和1個(gè)256 bp 3′-UTR，編碼692個(gè)氨基酸。將所得序列通過SignalP 4.1軟件進(jìn)行信號肽分析，結(jié)果顯示其蛋白質(zhì)N端具有19個(gè)氨基酸的信號肽，預(yù)測為分泌型蛋白。將意大利蝗血藍(lán)蛋白亞基ⅠCitHc-1序列輸入到NCBI上的CD Search上，結(jié)果顯示CitHc-1含有節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白家族蛋白所具有的3個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖1，彩圖見圖版一)。經(jīng)Blastn分析發(fā)現(xiàn)，意大利蝗血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ基因與東亞飛蝗血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ的一致性最高，達(dá)94.0%。

意大利蝗CitHc-1蛋白的理論分子量是79.88 kDa，理論P(yáng)I為6.12；從氨基酸組成上看，意大利蝗CitHc-1富含Leu 9.1%、Val 8.1%、Glu 6.9%、Alg 6.8%、Asp 6.6%、Pro 6.1%。對意大利蝗CitHc-1蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示其結(jié)構(gòu)為混合型，由α螺旋和β折疊以及無規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖2，彩圖見圖版二)。

圖1 CitHc-1蛋白功能結(jié)構(gòu)域Fig.1 The conserved domain of CitHc-1 protein.(彩圖見圖版一)

2.2 同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將意大利蝗CitHc-1基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的蝗總科昆蟲血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ基因進(jìn)行比對，做同源性分析。結(jié)果表明，該基因與其他蝗總科昆蟲血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ基因的同源性達(dá)到91%～94%，確定所得序列為血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ基因。

以彈尾綱血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ作為外群，選取昆蟲綱10目11物種，利用MEGA軟件包中的NJ法基于p-distance模型構(gòu)建昆蟲綱血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明：昆蟲綱為單系群，其中有翅亞綱(直翅目、竹節(jié)蟲目、蜚蠊目、等翅目、襀翅目、螳螂目、革翅目)與無翅亞綱的衣魚目形成姐妹群。無翅亞綱的石蛃目為昆蟲綱原始的類群。直翅目為單系群，意大利蝗與東亞飛蝗形成姐妹群。

圖2 CitHc-1蛋白三級預(yù)測結(jié)構(gòu)Fig.2 The predicted tertiary structure of CitHc-1.(彩圖見圖版二)

圖3 昆蟲血藍(lán)蛋白的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Molecular phylogeny of insect hexamerins.注：東亞飛蝗 Locusta migratoria Hc1 HQ213937; 意大利蝗Calliptanus italicus Hc1 JX204834; Carausius morosus Hc1 FM242640; 美洲大蠊 Periplaneta americana Hc1 FM242648; Cryptotermes secundus Hc1 FM242644; Perla marginata Hc1 AJ555403; 勇斧螳螂 Hierodula membranacea Hc1 FM242642; 杜比亞蟑螂 Blaptica dubia Hc1 FM242646; 棘燕球螋 Chelidurella acanthopygia Hc1 FM242641; 小灶衣魚 Thermobia domestica Hc1 FM165288; Machilis germanica Hc1 FM242639; 曲毛裸長角跳蟲 Sinella curviseta Hc1 FM242638。

2.3 CitHc-1蛋白的原核表達(dá)分析

將含有重組質(zhì)粒的表達(dá)菌在終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3 h后，收集菌體沉淀，加入2×SDS上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果可見相對分子量32 kDa處(pEASY-E1-Hc)有1條明顯的蛋白條帶，與預(yù)計(jì)的融合蛋白分子量大小基本相符，電泳結(jié)果如圖4A所示。

利用超聲對全菌液破碎，分別取誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后、上清和沉淀的樣品進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳?？梢钥闯觯耗康牡鞍状蟛糠衷诔恋碇斜磉_(dá)，以包涵體形式存在，結(jié)果如圖4B所示。

圖4 重組蛋白CitHc-1的SDS-PAGE電泳分析和可溶性分析Fig.4 SDS-PAGE analysis and soluble analysis of CitHc-1 protein.注：A. M：protein marker；1：空載未誘導(dǎo)；2：空載誘導(dǎo)；3：pEASY-E1-Hc重組未誘導(dǎo)；4：pEASY-E1-Hc重組誘導(dǎo)；B. M：protein marker；1：pEASY-E1-Hc重組菌液未誘導(dǎo)；2：pEASY-E1-Hc重組菌超聲破碎后全菌液；3：pEASY-E1-Hc重組菌超聲破碎后上清；4：pEASY-E1-Hc重組菌超聲破碎后沉淀。

3 討論

本研究通過RT-PCR和RACE技術(shù)，獲得了全長為2 335 bp的CitHc-1基因cDNA序列，其中開放閱讀框(ORF)長度為2 079 bp。與LmiHc-1氨基酸序列的一致性高達(dá)98%。CitHc-1基因編碼的蛋白具有可逆結(jié)合氧氣的必需組件——6個(gè)結(jié)合Cu2+的組氨酸位點(diǎn), 蛋白的二級結(jié)構(gòu)為α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲的混合型。大部分昆蟲綱血藍(lán)蛋白基因的cDNA長度都在2 000～2 600 bp之間，昆蟲綱血藍(lán)蛋白基因亞基Ⅰ編碼的氨基酸在650～750之間, 意大利蝗血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ氨基酸序列與昆蟲綱其他物種的血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ氨基酸序列相似性為56%～98%，以上數(shù)據(jù)均表明血藍(lán)蛋白基因亞基Ⅰ在進(jìn)化過程中相對比較保守；同時(shí)，核苷酸和氨基酸二者的差異性，也體現(xiàn)了該基因在進(jìn)化過程中的變異性[8]。蛋白結(jié)構(gòu)N端有19個(gè)氨基酸的信號肽，根據(jù)Pick等[8]的研究，這是所有昆蟲血藍(lán)蛋白行使呼吸功能所必需的結(jié)構(gòu)。

以彈尾綱為外群，選取昆蟲綱10目11物種構(gòu)建昆蟲綱血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，昆蟲綱為單系群。有翅亞綱與無翅亞綱的衣魚目形成姐妹群，無翅亞綱的石蛃目為最原始類群，與形態(tài)分類的研究結(jié)果一致[20]，說明血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ的基因序列可作為很好的分子標(biāo)記，用于分析昆蟲綱各類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在直翅目中，直翅目形成單系群，意大利蝗與東亞飛蝗形成姐妹群，在形態(tài)分類上二者均屬于直翅目蝗總科[15]。

意大利蝗是重要的農(nóng)業(yè)害蟲，為了進(jìn)一步研究意大利蝗血藍(lán)蛋白亞基Ⅰ的結(jié)構(gòu)和功能，構(gòu)建了意大利蝗CitHc-1基因活性區(qū)域的原核表達(dá)載體，進(jìn)行了重組蛋白的表達(dá)，并對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，表明CitHc-1可以在大腸桿菌中正常表達(dá)，為進(jìn)一步研究其蛋白結(jié)構(gòu)和功能打下了基礎(chǔ)，進(jìn)而為害蟲的綜合治理以及昆蟲資源的開發(fā)利用提供分子依據(jù)。

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Cloning and Prokaryotic Expression of the Hemocyanin Subunit TypeⅠ fromCalliptanusitalicus

WANG Di, ZHANG Zao, WANG Zhangping, YIN Hong*

TheKeyLaboratoryofZoologicalSystematicsandApplication,CollegeofLifeSciences,HebeiUniversity,HebeiBaoding071002，China

Hemocyanins are copper-containing (Cu2+) proteins in vivo of insect and play important roles not only in respiratory but also in energy storage, antibiosis and antivirus. To investigate the structure and expression profiles ofCalliptanusitalicushemocyanin subunit typeⅠ(CitHc-1), the complete cDNA (2 335 bp) ofCitHc-1 was obtained by RACE method. TheCitHc-1 contained an open reading frame of 2 079 bp encoding 692 amino acids. The predicted molecular weight is 79.88 kDa. Sequence alignment revealed that theCitHc-1 shared an identity of 91%～94% with hemocyanins from other Acridoidea species. The dendrograms of the arthropod hemocyanin subunit typeⅠinferred by Neighbor-joining (NJ) method showed that,Calliptanusitalichemocyanin subunit typeⅠandLocustamigratoriahemocyanin subunit typeⅠformed a subclade. In order to further study the structure and function of hemocyanin subunit typeⅠfromCalliptanusitalicus, the CitHc-1 prokaryotic expression vector was established successfully and the recombined plasmid was transfected into BL21(DE3). The result of SDS-PAGE showed that the molecular weight was consistent with the theory molecular weight (32 kDa). The results provided a theoretical basis for further analysis on the function of CitHc-1 inC.italicus.

Calliptanusitalicus; hemocyanin subunitⅠ; gene clone; expression analysis; prokaryotic expression

2017-04-05; 接受日期：2017-05-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272293)資助。

王頔，碩士研究生，主要從事昆蟲分子系統(tǒng)發(fā)育研究。 E-mail: 1530471926@qq.com。*通信作者：印紅，教授，博士，主要從事昆蟲分子系統(tǒng)發(fā)育研究。E-mail:yinhong@hbu.edu.cn

10.19586/j.2095-2341.2017.0023