劉 棟,王建華*,宋 斌,孫學(xué)軍,鄭見(jiàn)寶,劉 斌,劉思達(dá),毛智軍,普彥淞,段降龍,龍延濱

(1陜西省人民醫(yī)院普外二科,西安 710068;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科;*通訊作者,E-mail：wangjianhuaman@163.com)

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miR-582在胃癌組織中的表達(dá)及其作用機(jī)制

劉 棟1,王建華1*,宋 斌1,孫學(xué)軍2,鄭見(jiàn)寶2,劉 斌1,劉思達(dá)1,毛智軍1,普彥淞1,段降龍1,龍延濱1

(1陜西省人民醫(yī)院普外二科,西安 710068;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科;*通訊作者,E-mail：wangjianhuaman@163.com)

目的 研究胃癌和癌旁組織中microRNA-582(miR-582)的表達(dá)水平,以及調(diào)控miR-582表達(dá)后對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901功能的影響。 方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人胃癌和正常胃組織中miR-582的表達(dá)水平;將miR-582 inhibitors(miR-582下調(diào)表達(dá))通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至人胃癌SGC-7901細(xì)胞中(miR-582 inhibitors組),設(shè)未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(control組)和miRNA無(wú)義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組(NC組)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-582的表達(dá)變化;MTT方法檢測(cè)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)活力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組的細(xì)胞周期和凋亡率;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力;Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Rab7a、CDK1和AKT3蛋白表達(dá)。 結(jié)果 miR-582在胃癌中的表達(dá)量為癌旁組織的(0.34±0.11)倍(P<0.05)。與control組和NC組相比,miR-582 inhibitors組中SGC-7901細(xì)胞增殖和侵襲能力上升(P<0.05),細(xì)胞周期被促進(jìn),細(xì)胞凋亡減少(P<0.05),Rab23蛋白表達(dá)上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 miR-582在胃癌組織中低表達(dá),miR-582通過(guò)下調(diào)Rab23抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、侵襲、遷移能力,促進(jìn)其凋亡。其可以作為胃癌診斷和治療的新靶點(diǎn)。

胃癌; miR-582; Rab23; SGC-7901細(xì)胞; 細(xì)胞活力; 細(xì)胞凋亡; 細(xì)胞侵襲

胃癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在我國(guó)也是發(fā)病率和死亡率分別位居第2位和第3位的惡性腫瘤[1]。從分子水平上闡釋胃癌的發(fā)生和發(fā)展的具體機(jī)制,是為了尋求新的胃癌早期標(biāo)記物和有效生物治療的靶點(diǎn)。胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多種癌基因的激活、抑癌基因的失活等一系列的異常生物學(xué)過(guò)程[2]。microRNA(miRNA)是一種19-25個(gè)核苷酸大小的內(nèi)源性非編碼的RNA,在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮重要作用[3],現(xiàn)在大量研究已證實(shí)其參與到腫瘤發(fā)生發(fā)展的很多過(guò)程,如增殖、凋亡、侵襲、耐藥等[4]。一般來(lái)說(shuō),miRNA主要以完全或部分互補(bǔ)配對(duì)的方式通過(guò)結(jié)合到靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)(3′UTR)來(lái)發(fā)揮功能[5]。miR-582作為近年來(lái)在腫瘤發(fā)展中扮演重要角色的微小RNA成員之一,已經(jīng)引起了越來(lái)越多的關(guān)注。很多研究表明miR-582涉及到腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲遷移的多種生物學(xué)進(jìn)程中,如膀胱癌[6]和結(jié)直腸癌[7,8]。然而miR-582在胃癌中的功能尚不清楚,本研究檢測(cè)miR-582在胃癌組織中的表達(dá)及抑制miR-582在胃癌細(xì)胞SGC-7901中的表達(dá),研究其在胃癌增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移中的作用,探討miR-582作為胃癌治療靶點(diǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司;Real-Time PCR購(gòu)自日本TaKaRa公司生產(chǎn);Real-Time PCR檢測(cè)儀器為美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)的CFX96TMReal-Time PCR Detection System;miR-582、U6引物由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成;RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司;胎牛血清購(gòu)自法國(guó)Biowest公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;OPTI-MEN購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Annexin Ⅴ-FITC試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司;MTT購(gòu)置美國(guó)Sigma公司;miR-582及Negative Control(NC)購(gòu)自上海吉瑪公司生產(chǎn);Rab23,CDK1,AKT3和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

GES-1、SGC-7901、MGC-803、AGS、BGC-823和MKN28為西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存,采用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)滿約80%時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代,取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。收集2016-01～2016-05于陜西省人民醫(yī)院普通外科手術(shù)切除的20例原發(fā)性胃癌標(biāo)本及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本(距離癌灶邊緣5 cm以上的組織),其中男14例,女6例;年齡39-73歲,平均年齡58.3歲。所有患者術(shù)前未經(jīng)過(guò)放、化療,術(shù)后經(jīng)病理確診。新鮮標(biāo)本離體后迅速置于液氮中保存待用。所有入選患者均簽署知情通知書,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)。

1.3 real-time PCR檢測(cè)miR-582

用Trizol試劑按照操作說(shuō)明書對(duì)正常胃黏膜細(xì)胞系GES-1和5株胃癌細(xì)胞行總RNA提取,各取2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA,行real-time PCR。反應(yīng)條件:反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;然后按95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以每個(gè)樣本的U6作為內(nèi)參,基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化,取2×104個(gè)接種于6孔板,設(shè)實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-582 inhibitors)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染negative control)組和空白對(duì)照組(untreated cell)。用250 μl OPTI-MEN稀釋LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑5 μl室溫靜置5 min,再用250 μl OPTI-MEN稀釋miR-582 inhibitors或Negative Control 5 μl,兩者混合室溫靜置20 min, 每孔加入500 μl中的轉(zhuǎn)染復(fù)合液,在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4-6 h,用新鮮的完全培養(yǎng)基(含血清)替換含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基,供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用MTT法,將消化后的胃癌細(xì)胞SGC-7901按照5×103個(gè)/孔接種于96孔板中,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔;未接種細(xì)胞的孔中加入RPMI 1640培養(yǎng)基作為調(diào)零孔,放于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后24,48,72,96 h,每孔加入MTT 20 μl繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h,后用酶標(biāo)儀檢測(cè)其490 nm處吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè)

取胃癌細(xì)胞SGC-7901按照2×105個(gè)/孔接種于6孔板中,分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,轉(zhuǎn)染后48 h、24 h,然后再換成含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,用胰酶收集各組細(xì)胞,所收集細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次,1 000 r/min,5 min,棄上清。加入-20 ℃預(yù)冷的75%冰乙醇1 ml固定細(xì)胞,置于4 ℃冰箱過(guò)夜;檢測(cè)前離心(1 000 r/min 5 min),用PBS洗滌2次;加入100 μl PBS并將細(xì)胞吹懸;用含0.01%RNase和0.5%碘化丙錠(PI)4 ℃處理細(xì)胞20 min。過(guò)300目尼龍網(wǎng)。送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取胃癌細(xì)胞按照2×105個(gè)/孔接種于6孔板中,分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,轉(zhuǎn)染后24 h Annexin Ⅴ-FITC試劑盒進(jìn)行染色,并在1 h內(nèi)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測(cè)Rab23的表達(dá)水平

取胃癌細(xì)胞按照2×105個(gè)/孔接種于6孔板中,分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,收集轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液,提取細(xì)胞總蛋白,BCA法檢測(cè)總蛋白濃度,每組樣本取10 μl進(jìn)行10%SDS-PAGE垂直電泳,濕轉(zhuǎn)法將膠中蛋白水平轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶在37 ℃搖床上封閉1 h,加入TBST稀釋后的一抗,4 ℃過(guò)夜;取出后TBST洗膜3次再加入二抗,孵育1 h,再洗膜3次,添加ECL發(fā)光液反應(yīng)底物,凝膠成像系統(tǒng)掃描,采用相關(guān)圖像分析軟件(Bio-rad Quantity One,CA)進(jìn)行條帶灰度分析，實(shí)驗(yàn)采用GAPDH作為參照蛋白。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件,兩組間差異分別采用兩樣本t檢驗(yàn),多組間差異采用單因素方差分析One-way ANOVA,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人胃癌組織和胃癌細(xì)胞中miR-582的表達(dá)

與20例相應(yīng)的癌旁組織相比,miR-582在胃癌組織中表達(dá)明顯降低(P<0.05,見(jiàn)圖1A)。miR-582在胃癌中的表達(dá)量為癌旁組織的(0.34±0.11)倍(P<0.05)。與正常胃黏膜細(xì)胞GES-1相比,miR-582在人胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901相對(duì)高表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),而MKN28、BGC-823、AGS等胃癌細(xì)胞中miR-582的表達(dá)量與GES-1細(xì)胞相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05,見(jiàn)圖1B)。因此，后續(xù)功能學(xué)研究選用miR-582表達(dá)量較高的胃癌細(xì)胞SGC-7901為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,采用miR-582 inhibitors下調(diào)miR-582在胃癌細(xì)胞SGC-7901中的表達(dá)。

與GES-1細(xì)胞比較，*P<0.05,**P<0.01 A.20例胃癌及癌旁組織 B.正常胃黏膜細(xì)胞及胃癌細(xì)胞系圖1 組織及細(xì)胞系中miR-582的表達(dá)Figure 1 The expression of miR-582 in gastric cancer tissue and gastric cancer cells

2.2 轉(zhuǎn)染后24 h miR-582的表達(dá)水平

與陰性對(duì)照組比較,人胃癌細(xì)胞SGC-7901轉(zhuǎn)染miR-582 inhibitors后miR-582的表達(dá)水平顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖2)。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.3 miR-582對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示,相對(duì)陰性對(duì)照組,人胃癌細(xì)胞SGC-7901轉(zhuǎn)染miR-582 inhibitors,在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h生長(zhǎng)速度均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,見(jiàn)圖3),在72 h、96 h生長(zhǎng)速度明顯增快,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明下調(diào)miR-582具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的作用。

與NC組比較,*P<0.05圖2 細(xì)胞系SGC-7901轉(zhuǎn)染miR-582 inhibitors 24 h后miR-582的表達(dá)Figure 2 Expression of miR-582 in SGC-7901 cells after transfection with miR-582 inhibitor for 24 h

2.4 miR-582對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,相比陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,人胃癌細(xì)胞SGC-7901轉(zhuǎn)染miR-582 inhibitors 48 h,其G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少(實(shí)驗(yàn)組vs陰性對(duì)照組vs空白對(duì)照組:45.6%vs52.4%vs53.4%,P<0.05,見(jiàn)圖4),S期細(xì)胞比例增多(實(shí)驗(yàn)組vs陰性對(duì)照組vs空白對(duì)照組:32.9%vs21%vs23.9%,P<0.05),G2/M期細(xì)胞比例沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(實(shí)驗(yàn)組vs陰性對(duì)照組vs空白對(duì)照組:20.6%vs26.7%vs23.3%,P>0.05)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果表明下調(diào)miR-582具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)化的作用。

與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Figure 3 Cell growth curves of SGC-7901 cells after transfection with miR-582

A.control組 B.NC組 C.inhibitors組圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞周期Figure 4 Cell cycle distribution by flow cytometry at 48 h after transfection

2.5 miR-582對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

與陰性對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染了miR-582 inhibitors的人胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡比例減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖5)。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果表明下調(diào)miR-582對(duì)胃癌細(xì)胞具有促進(jìn)凋亡的作用。

A.Control組 B.NC組 C.Inhibitors組圖5 細(xì)胞儀檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞凋亡Figure 5 Apoptosis of SGC-7901 cells by flow cytometry

2.6 miR-582對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲及遷移的影響

與陰性對(duì)照相比,人胃癌細(xì)胞SGC-7901轉(zhuǎn)染miR-582 inhibitors后侵襲能力均顯著增強(qiáng)(見(jiàn)圖6),即每視野穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著增加(均P<0.05,見(jiàn)圖7)。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果表明下調(diào)miR-582對(duì)胃癌細(xì)胞具有促進(jìn)侵襲的作用。

A.空白對(duì)照組 B.陰性對(duì)照組C.Inhibitors組圖6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(結(jié)晶紫染色100倍)Figure6 Cellinvasionassay(crystalvioletstaining×100)

圖7 miR-582對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲的影響(*P<0.05)Figure 7 Effect of miR-582 on cell invasion(*P<0.05)

2.7 miR-582對(duì)胃癌相關(guān)蛋白R(shí)ab23、CDK1及AKT3的影響

相比陰性對(duì)照組,轉(zhuǎn)染了miR-582 inhibitors后的SGC-7901細(xì)胞Rab23表達(dá)明顯升高(P<0.05),CDK1及AKT3表達(dá)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖8)。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明,miRNA在對(duì)其靶向的癌基因、抑癌基因或者參與腫瘤增殖、血管生成和凋亡的相關(guān)基因的調(diào)控方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[9]。此外血清中游離的異常的miRNA的表達(dá)為腫瘤的早期診斷和疾病進(jìn)展的標(biāo)志物提供新的診療希望[10,11]。根據(jù)先前的研究[12],在胃癌中許多miRNA異常表達(dá),提示在胃癌的發(fā)生發(fā)展中miRNA的表達(dá)的差異性是十分普遍的現(xiàn)象,miRNA的異常表達(dá)與胃癌細(xì)胞增殖活性,藥物敏感性和侵襲遷移能力密切相關(guān)。miR-582已被證實(shí)在多種人的腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。最近一篇文獻(xiàn)[6]顯示miR-582能抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng),在腫瘤形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但是關(guān)于miR-582在胃癌中的作用至今未被報(bào)道。

圖8 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-582在SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)Figure 8 The expression of miR-582 protein in SGC-7901 cells by Western blot

Rab蛋白是小GTPase超家族的成員,其在細(xì)胞分泌、內(nèi)吞、信號(hào)傳導(dǎo)和發(fā)育過(guò)程中都有重要作用[13],在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中同樣參與了重要過(guò)程[14]。Rab23,是Rab家族的成員,與細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲遷移密切相關(guān)。根據(jù)以往的報(bào)道,Rab23被認(rèn)為在胃癌中高表達(dá),且被miR-367所調(diào)節(jié)[15]和本研究結(jié)果相一致,Rab23可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,并抑制凋亡。高分辨率的基于芯片的比較基因組雜交發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中Rab23基因的擴(kuò)增現(xiàn)象,且Rab23可以顯著性提高AGS細(xì)胞的侵襲能力[16]。

本研究證實(shí)miR-582在胃癌的組織和細(xì)胞中顯著性下降,Rab23可能是miR-582在胃癌細(xì)胞的靶基因之一,下調(diào)miR-582能夠通過(guò)增加Rab23的表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖,減少凋亡,增加侵襲能力。因此,本研究得出miR-582在胃癌的腫瘤形成過(guò)程中扮演者抑癌基因的角色。其他腫瘤的相關(guān)報(bào)道,miR-582在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系的表達(dá)降低,上調(diào)miR-582能抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng),且CDK1和AKT3作為miR-582的直接靶基因調(diào)節(jié)肝癌的進(jìn)程[17]。然而在不同類型的實(shí)體腫瘤中miR-582的靶基因也不盡相同。在人前列腺癌細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-582表達(dá)上調(diào)且促進(jìn)細(xì)胞增殖,在前列腺細(xì)胞中miR-582在剝奪雄激素的條件下靶向下調(diào)EFNB2[18],而膠質(zhì)瘤中靶向下調(diào)凋亡相關(guān)基因caspase 3和9[19]。在急性肺結(jié)核中,miR-582上調(diào)并通過(guò)靶向FOXO1來(lái)抑制單核細(xì)胞的凋亡[20]。而本研究發(fā)現(xiàn)miR-582通過(guò)Rab23來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲,促進(jìn)其凋亡。

綜上所述,上調(diào)miR-582能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖活性和侵襲能力,促進(jìn)胃癌凋亡,提示其在胃癌中可能扮演致抑癌基因的角色,本研究首次提示其可能通過(guò)靶基因Rab23發(fā)揮生物學(xué)功能,為胃癌的發(fā)生機(jī)制及臨床生物治療提供新的靶點(diǎn)。

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Expression of miR-582 in gastric cancer and its mechanism

LIU Dong1,WANG Jianhua1*,SONG Bin1,SUN Xuejun2,ZHENG Jianbao2,LIU Bin1,LIU Sida1,MAO Zhijun1,PU Yansong1,DUAN Xianglong1,LONG Yanbin1

(1SecondDepartmentofGeneralSurgery,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China;2DepartmentofGeneralSurgery,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:wangjianhuaman@163.com)

ObjectiveTo explore the expression level of microRNA-582(miR-582)in human gastric cancer and normal gastric tissues and the effect of miR-582 expression on the function of gastric cancer cells.MethodsThe expression levels of miR-582 in human gastric cancer and normal gastric tissues were detected by real-time PCR. The miR-582 inhibitors were transfected into human gastric cancer SGC-7901 cells by liposome method. The expression of miR-583 in the cells after transfection was detected by real-time PCR.The experiment was divided into control group,negative control group(NC)and miR-582 inhibitors group.The cell viability was measured by MTT assay.The cell cycle and apoptotic rate of SGC-7901 cells were analyzed by flow cytometry.The invasion ability of SGC-7901 cells was measured by Transwell assay.The expression levels of Rab23,CDK1 and AKT3 were detected by Western blot.ResultsThe expression level of miR-582 in human gastric cancer tissues was significantly lower than that in normal gastric tissues(P<0.05).Compared with control group and NC group,the viability and invasion ability of the SGC-7901 cells were increased in miR-582 inhibitors group(P<0.05),the cell cycle was promoted(P<0.05),and the cell apoptosis was decreased and the protein expression of Rab23 was up-regulated(P<0.05).ConclusionThe expression of miR-582 significantly decreases in gastric cancer tissues.MiR-582 can inhibit gastric cancer SGC-7901 cell proliferation,migration and invasion by down-regulating Rab23 to promote apoptosis.It can be used as a new diagnosis and treatment target for gastric cancer.

gastric cancer; miR-582； Rab23； SGC-7901cells； cell proliferation； cell apoptosis； cell invasion

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81101874)

劉棟,男,1982-09生,博士,主治醫(yī)師,E-mail:liudong522@163.com

2017-01-08

R735.2

A

1007-6611(2017)04-0316-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.004