郝廣華，汪南平，黃雅姿，趙蓓蕾，張 弘，韓振華

(1西安交通大學第二附屬醫(yī)院心內科，西安 710004；2北京大學心血管研究所，分子心血管學教育部重點實驗室；*通訊作者，E-mail:npwang@bjmu.edu.cn)

?

高脂飲食對ApoE-/-小鼠血漿及主動脈視黃醇結合蛋白4表達的影響及意義

郝廣華1，汪南平2*，黃雅姿2，趙蓓蕾2，張 弘2，韓振華1

(1西安交通大學第二附屬醫(yī)院心內科，西安 710004；2北京大學心血管研究所，分子心血管學教育部重點實驗室；*通訊作者，E-mail:npwang@bjmu.edu.cn)

目的 觀察高脂飲食對apoE-/-小鼠血漿及主動脈RBP4水平的影響，探討其意義。 方法 8周齡C57 BL/6及apoE-/-小鼠分為4組：C57 BL/6小鼠普食組，C57 BL/6小鼠高脂組，apoE-/-小鼠普食組，apoE-/-小鼠高脂組。喂養(yǎng)不同周數(shù)(0,1,2,3,4周)后取血漿用于脂質和血糖的測定，應用免疫印跡法檢測血漿及附睪脂肪組織RBP4的表達，免疫組化檢測主動脈RBP4的表達。 結果 與C57BL/6小鼠普食組及apoE-/-小鼠普食組相比，喂養(yǎng)4周apoE-/-高脂組小鼠血漿膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)及血糖(GLU)升高(P<0.05)，其血漿及脂肪組織RBP4的表達水平也升高(P<0.05)。apoE-/-高脂組小鼠的主動脈RBP4的免疫陽性表達較C57BL/6高脂組小鼠及apoE-/-普食組小鼠增加，且主動脈粥樣硬化斑塊內可見到明顯的RBP4表達。 結論 高脂飲食誘導apoE-/-小鼠血漿、脂肪組織及主動脈RBP4表達升高，RBP4可能參與了代謝綜合征，特別是血管病變的病理過程。

視黃醇結合蛋白； 高脂飲食； 胰島素抵抗； 代謝綜合征； 動脈粥樣硬化

肥胖是一個威脅公眾健康的重大問題，也是胰島素抵抗和心血管疾病流行的重要危險因素。脂肪組織產(chǎn)生大量的脂肪因子，如抵抗素(resistin)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、脂聯(lián)素(adiponectin)等，參與并影響心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[1,2]。

視黃醇結合蛋白-4(retinol-binding protein 4，RBP4)是維生素A的特異性轉運蛋白，也是一種新的脂肪因子，與肥胖和胰島素抵抗的發(fā)生有關，被認為是預測代謝綜合征的一個新指標[3,4]。循環(huán)中RBP4與多種心血管疾病危險因素如體質量、腰圍、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)及收縮壓呈正相關，而與血漿高密度脂蛋白(HDL)呈負相關[5,6]。而且，循環(huán)中RBP4在臨床確診的動脈粥樣硬化患者中增高，其水平與頸動脈斑塊大小具有相關性[7]。提示RBP4可能與代謝綜合征及動脈粥樣硬化疾病相關。但迄今為止，RBP4在動脈粥樣硬化中的直接作用仍未揭示。本實驗通過檢測高脂飲食對apoE-/-小鼠血漿及及主動脈RBP4表達的影響，探討RBP4與代謝綜合征，特別是血管病變的關系。

1 材料及方法

1.1 實驗動物及主要試劑

8周齡雄性apoE-/-小鼠58只，SPF級，體質量17-25 g；8周齡野生型雄性C57BL/6小鼠56只，體質量17-25 g，均由北京大學實驗動物中心提供，適應性喂養(yǎng)1周。兔RBP4抗體由中國科學院上海生命科學研究院營養(yǎng)科學研究所劉勇教授惠贈。兔抗β-actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。ECL發(fā)光試劑及RIPA裂解液購自北京普利萊基因技術有限公司。蛋白酶抑制劑complete購自Roche applied science公司。

1.2 實驗分組及胰島素抵抗模型的建立

實驗動物分為4組：C57BL/6普食小鼠組(C57 C)：野生型C57BL/6小鼠(n=32)，喂食普通飼料；C57BL/6高脂小鼠組(C57 HF)：C57BL/6小鼠(n=24)喂食高脂飼料(1.5%膽固醇、0.5%膽酸鹽、15%脂肪、其余為普通飼料)；apoE-/-普食小鼠組(apoE-/-C，n=26)，喂食普通飼料；apoE-/-高脂小鼠組(apoE-/-HF，n=32)，喂食高脂飼料(1.5%膽固醇、0.5%膽酸鹽、15%脂肪、其余為普通飼料)。

1.3 血液標本的采集及血糖和血脂的檢測

分別于普通飼料或高脂飼料喂養(yǎng)0，1，2，3，4周時，禁食12 h，以0.6%戊巴比妥鈉0.2-0.4 ml通過腹腔注射麻醉。經(jīng)眼眶后靜脈叢取血0.5 ml(處死動物前)，立即離心(3 000 r/min，10 min)，取血清用于脂質(TC、TG)和血糖的測定，其余血清-70 ℃保存?zhèn)溆?。血清TC、TG使用酶比色法，血糖測定采用葡萄糖氧化酶法。實驗過程根據(jù)說明書進行，使用半自動生化分析儀檢測。

1.4 脂肪組織采集

于實驗設定的時間點取血后打開腹腔，經(jīng)左心室灌注0.1 mol/L PBS后分離并取出主動脈及附睪脂肪組織，清洗后立即置于液氮中保存，用于后續(xù)分析。

1.5 Western blot檢測血漿及脂肪組織RBP4水平

血漿樣品用0.1 mol/L PBS稀釋20倍，按照4 ∶1(V/V)的比例加入上樣緩沖液，煮沸10 min，離心。用裂解液(RIPA)裂解脂肪組織后提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白含量。稀釋蛋白樣品為10 μg/μl，加入上樣緩沖液，煮沸10 min，離心。血漿蛋白樣品及脂肪組織樣品分別進行8% SDS-PAGE凝膠電泳并電轉至PVDF膜上，封閉緩沖液封閉1 h，滴加兔抗RBP4抗體(1 ∶500)、β-actin抗體(1 ∶200)，4 ℃孵育過夜，生物素化山羊抗兔IgG孵育45 min，TBST洗膜，置于化學發(fā)光試劑中反應1-3 min；常規(guī)方法顯影定影，拍照后采用Gel Doc 2000系統(tǒng)行拍照及灰度分析。

1.6 免疫組織化學染色檢測主動脈RBP4表達

取胸主動脈依次經(jīng)過4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液及蔗糖溶液處理，OCT包埋后制成冰凍組織。經(jīng)冰凍切片機制成7 μm切片，0.01 mmol/L的檸檬酸鹽抗原修復液(pH=6.0)抗原熱修復，正常山羊血清抗體封閉后，加入兔抗RBP4抗體(1 ∶500)，4 ℃過夜后，DAB顯色劑顯色，蘇木素復染、脫水、透明、封片。實驗中用PBS替代一抗作為陰性對照。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠血脂及血糖

apoE-/-小鼠普食(apoE-/-HF-0W)時TC較同齡C57BL/6普食小鼠(C57 HF-0W)高。C57BL/6小鼠高脂4周(C57 HF-4W)TC較同類普食組小鼠(C57 C-4W)顯著增高。喂養(yǎng)4周時apoE-/-高脂小鼠(apoE-/-HF-4W)與C57BL/6高脂小鼠(C57 HF-4W)及同周齡的apoE-/-普食小鼠(apoE-/-HF-4W)相比，其TC，TG及血糖均顯著升高。TG及血糖在除apoE-/-高脂4周組小鼠外的組別中比較差異無統(tǒng)計學意義。

表1 各組小鼠血清脂質及血糖比較 (mmol/L)

Table 1 Plasma lipid and glucose profiles in apoE-/-and C57BL/6 mice (mmol/L)

組別nTCTGGLUC57HF-0W71.46±0.111.10±0.2612.98±0.58apoE-/-HF-0W76.25±0.38*1.42±0.2511.82±1.07C57C-4W81.50±0.090.99±0.2111.05±0.95apoE-/-C-4W77.53±0.44#1.62±0.3813.19±1.05C57HF-4W83.76±0.20#0.92±0.2012.06±0.74apoE-/-HF-4W837.52±0.57+△4.22±0.43+△23.62±1.97+△

與C57 HF-0W比較,*P<0.05;與C57 C-4W比較,#P<0.05;與C57 HF-4W比較,+P<0.05;與apoE-/-C-4W比較,△P<0.05

2.2 小鼠血漿RBP4水平

實驗中采用的兔抗RBP4抗體對小鼠血清RBP4具有較高的特異性，在實驗中可檢測到1個21 kD的條帶(見圖1)。隨著高脂飼料喂養(yǎng)周數(shù)的增加，C57BL/6小鼠血清RBP4表達水平升高(見圖1)。高脂飼料喂養(yǎng)不同周數(shù)的apoE-/-小鼠血漿RBP4水平顯著高于同周齡C57BL/6高脂小鼠。高脂飲食以時間依賴性方式增加apoE-/-小鼠血漿RBP4水平。血漿蛋白的考馬斯亮藍染色在此實驗中作為上樣內參。

與C57 HF-0W比較,*P<0.05;同時間與C57 HF 比較,#P<0.05圖1 各組小鼠血漿RBP4水平Figure 1 Comparison of plasma RBP4 between C57BL/6 and apoE-/- mice after different treatment

2.3 脂肪RBP4表達水平

C57BL/6高脂組小鼠附睪脂肪組織RBP4表達水平較同周齡普食組飼料小鼠明顯增高(見圖2)。高脂飼料開始喂養(yǎng)前(apoE-/-HF-0W)的apoE-/-小鼠附睪脂肪組織RBP4表達水平顯著高于同周齡C57BL/6普食小鼠組。高脂飲食4周則進一步增加了apoE-/-小鼠脂肪RBP4表達水平。

與C57 C-4W比較,*P<0.05;與C57 C-0W比較,#P<0.05;與apoE-/-HF-0W比較,△P<0.05圖2 各組小鼠脂肪組織RBP4水平Figure 2 Comparison of RBP4 expression in epididymal adipose tissues among C57BL/6 and apoE-/- mice

2.4 主動脈RBP4的表達

免疫組織化學染色結果顯示，普食8周的C57BL/6小鼠主動脈壁的內皮細胞、SMCs及血管外膜均有較弱的RBP4陽性表達，高脂8周的C57BL/6小鼠的主動脈內皮細胞、SMCs及血管外膜RBP4表達增加(見圖3)。apoE-/-小鼠高脂8周時除了與C57BL/6高脂8周小鼠具有相似的RBP4陽性表達外，在其動脈粥樣硬化斑塊部位可觀察到明顯的RBP4免疫陽性，且主要分布于脂質富集部位。陰性對照組免疫組織化學染色未見明顯陽性染色。

圖3 各組小鼠主動脈RBP4表達Figure 3 Expression of RBP4 in aorta of mice after different treatment

3 討論

流行病學研究顯示，肥胖與心血管疾病特別是高血壓病、冠心病等密切相關。脂肪組織是一個內分泌器官，能夠產(chǎn)生多種生物活性物質，被稱為脂肪因子(adipokines)。脂肪因子通過調控糖脂代謝及胰島素敏感性，參與胰島素抵抗及代謝綜合征的病理生理過程[1]。RBP4是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，屬于lipocalin家族成員，主要由肝臟和脂肪組織合成后分泌入血液，與transthyretin(血液中3種甲狀腺激素結合蛋白之一)1 ∶1結合，形成蛋白復合物。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖、2型糖尿病、糖耐量受損、有2型糖尿病家族史的健康者或其他胰島素抵抗相關疾病者中RBP4血清水平升高，且與胰島素敏感性呈負相關。運動或抗糖尿病藥物干預可降低血清RBP4。并且，RBP4基因單核苷酸多態(tài)性與胰島素抵抗的遺傳密切相關。因此有人提議將RBP4作為診斷代謝綜合征的一個生物標記[4,8]。

apoE-/-小鼠是研究胰島素抵抗較理想的動物模型，高脂血癥是其重要的表型特征。本實驗顯示有胰島素抵抗表型的8周齡apoE-/-小鼠比同周齡C57BL/6小鼠的基礎血漿RBP4水平升高，而高脂飲食可以時間依賴性方式增加apoE-/-小鼠的血漿RBP4水平。先前研究顯示，RBP4在多種肥胖和胰島素抵抗模型小鼠血清中水平升高，與糖代謝和胰島素抵抗密切相關。其機制可能是上調肝臟組織糖異生酶如磷酸烯醇丙酮酸激酶和磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的表達，增加葡萄糖的基礎產(chǎn)生量，并通過改變PI3K活性損傷骨骼肌的胰島素信號[9]。此外，本實驗結果顯示，高脂飲食可誘導C57BL/6小鼠血漿及附睪脂肪組織RBP4表達升高。既往研究表明沒有胰島素抵抗和2型糖尿病的肥胖者，循環(huán)RBP4水平升高。而且，輕度肥胖者中血漿RBP4水平與體質量指數(shù)相關[10]。這些結果提示高脂飲食誘導的肥胖也可使血漿RBP4水平升高，而且此誘導作用可能不依賴于是否存在胰島素抵抗。本實驗中，apoE-/-小鼠的基礎血漿RBP4水平升高，推測可能與小鼠的胰島素抵抗表型有關，而高脂飲食誘導RBP4水平進一步升高則可能與高脂誘發(fā)小鼠肥胖及體脂分布變化有關。

除此之外，本實驗檢測到高脂飲食可誘導C57BL/6小鼠附睪RBP4水平升高，apoE-/-小鼠喂食高脂飲食后附睪RBP4表達進一步升高。提示脂肪組織產(chǎn)生的RBP4是血漿中高水平的RBP4的重要來源。既往研究提示RBP4是脂肪組織特異性表達的因子，特別是與內臟脂肪有關[11]。而且，在不同的脂肪細胞分泌的脂肪因子如adiponectin、leptin、visfatin中，RBP4被認為是最有力的預測內臟脂肪大小的脂肪因子[11.12]。

脂肪因子在心血管疾病發(fā)展中具有重要作用。血清RBP4水平與腹型肥胖、胰島素抵抗、高TG水平以及血壓呈顯著正相關，而與血清HDL以及脂聯(lián)素水平呈顯著負相關[1,8,13]。并且，RBP4水平與2型糖尿病以及VLDL升高的冠狀動脈疾病患者或健康者VLDL以及LDL濃度顯著相關[3,14]。而且，循環(huán)中RBP4在臨床確診的動脈粥樣硬化患者中增高，其水平與頸動脈斑塊大小具有相關性[15]，提示RBP4可能與動脈粥樣硬化疾病相關。本實驗直接觀察到RBP4表達于小鼠的主動脈組織，高脂飲食可增加主動脈組織RBP4表達，特別是在粥樣硬化斑塊部位可觀察到RBP4蛋白表達。我們以往的實驗結果表明RBP4通過PI3K-Akt通路誘導大鼠主動脈平滑肌細胞遷移[16]。提示血管特別是動脈粥樣硬化斑塊中高表達的RBP4可能通過影響SMCs的功能進而參與動脈粥樣硬化的病理過程。

綜上所述，本實驗表明，apoE-/-小鼠血漿、附睪組織及主動脈RBP4的基礎水平升高，而且，高脂飲食進一步誘導RBP4增高，提示RBP4可能作為一個重要的脂肪因子參與代謝綜合征，特別是肥胖及胰島素抵抗及血管病變的病理生理過程。本研究將為理解與肥胖相關疾病發(fā)生的可能機制提供新的證據(jù)。

[1] Piya MK,McTernan PG,Kumar S.Adipokine inflammation and insulin resistance:the role of glucose,lipids and endotoxin[J].J Endocr,2013,216(1):T1-T15.

[2] Mechanick JI,Zhao S,Garvey WT.The Adipokine-Cardiovascular-Lifestyle Network:Translation to Clinical Practice[J].J Am Coll Cardio,2016,68(16):1785-1803.

[3] Christou GA,Tselepis AD,Kiortsis DN.The metabolic role of retinol binding protein 4:an update[J].Horm Metab Res,2012,44(1):6-14.

[4] von Eynatten M,Humpert PM.Retinol-binding protein-4 in experimental and clinical metabolic disease[J].Expert Rev Mol Diagn,2008,8(3):289-299.

[5] Wu J,Shi YH,Niu DM,etal.Association among retinol-binding protein 4,small dense LDL cholesterol and oxidized LDL levels in dyslipidemia subjects[J].Clin Biochem,2012,45:619-622.

[6] Rocha M,Banuls C,Bellod L,etal.Association of serum retinol binding protein 4 with atherogenic dyslipidemia in morbid obese patients[J].PLoS One,2013,8:e78670.

[7] Xiao Y,Xu A,Hui X,etal.Circulating lipocalin-2 and retinol-binding protein 4 are associated with intima-media thickness and subclinical atherosclerosis in patients with type 2 diabetes[J].PLoS One,2013,8:e66607.

[8] Zabetian-Targhi F,Mahmoudi MJ,Rezaei N,etal.Retinol binding protein 4 in relation to diet,inflammation,immunity,and cardiovascular diseases[J].Adv Nutr，2015,6(6):748-762.

[9] Yang Q,Graham TE,Mody N,etal.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes[J].Nature,2005,436(7049):356-362.

[10] Graham TE,Yang Q,Bluher M,etal.Retinol-binding protein 4 and insulin resistance in lean,obese,and diabetic subjects[J].New Engl J Med,2006,354(24):2552-2563.

[11] Kloting N,Graham TE,Berndt J,etal.Serum retinol-binding protein is more highly expressed in visceral than in subcutaneous adipose tissue and is a marker of intra-abdominal fat mass[J].Cell Metab,2007,6(1):79-87.

[12] Berry DC,Noy N.Signaling by vitamin A and retinol-binding protein in regulation of insulin responses and lipid homeostasis[J].Biochim Biophys Acta,2012,1821(1):168-176.

[13] Qi Q,Yu Z,Ye X,etal.Elevated retinol-binding protein 4 levels are associated with metabolic syndrome in Chinese people[J].J Clin Endocr Metab,2007,92(12):4827-4834.

[14] Balagopal P,Graham TE,Kahn BB,etal.Reduction of elevated serum retinol binding protein in obese children by lifestyle intervention:association with subclinical inflammation[J].J Clin Endocr Metab,2007,92(5):1971-1974.

[15] Ingelsson E,Lind L.Circulating retinol-binding protein 4 and subclinical cardiovascular disease in the elderly[J].Diabetes Care,2009,32(4):733-735.

[16] 郝廣華，汪南平，黃雅姿，等.視黃醇結合蛋白4對血管平滑肌細胞遷移和增殖的影響及機制[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2016(17):3212-3216.

Effect of high fat diet on RBP4 expression in plasma and aorta of apoE-/-mice

HAO Guanghua1,WANG Nanping2*,HUANG Yazi2,ZHAO Beilei2,ZHANG Hong2,HAN Zhenhua1

(1DepartmentofCardiology,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;2InstituteofCardiovascularScienceandKeyLaboratoryforMolecularCardiology,MinistryofEducation,PekingUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:npwang@bjmu.edu.cn)

ObjectiveTo explore the effect of high fat diet on RBP4 expression in plasma and aorta of apoE-/-mice.MethodsThe 8-week-old C57BL/6 and apoE-/-mice were divided into four groups:C57BL/6 control group(fed with normal diet)and C57BL/6 high-fat diet group(C57 HF),apoE-/-control group and apoE-/-high-fat diet group(apoE-/-HF).Plasma lipids were detected after different feeding time by enzymic colorimetric method.Glucose was determined using glucose oxidase method.The protein levels of RBP4 in plasma and epididymal adipose tissue were analyzed by Western blot.RBP4 expression of aorta was determined using immunohistochemistry.ResultsIn comparison with C57 mice and apoE-/-control mice,plasma levels of total cholesterol(TC),triglyceride(TG)and glucose(GLU)significantly increased after high-fat diet for 4 weeks in apoE-/-HF mice(P<0.05),and the expression of RBP4 in plasma and adipose tissue was also increased in apoE-/-HF mice(P<0.05).In comparison with C57 HF mice and apoE-/-control mice,RBP4 immunopositive blots were obviously increased in the aorta of apoE-/-HF mice,with strong positive staining in atherosclerotic lesions.ConclusionHigh-fat diet increases RBP4 expression in plasma,adipose tissue and aorta of apoE-/-mice,suggesting that RBP4 may participate in pathology of metabolic syndrome,especially the vascular disease.

retinol binding protein 4； high fat diet； insulin resistance； metabolic syndrome； atherosclerosis

國家自然科學基金資助項目(30900693)；陜西省社會發(fā)展科技攻關項目(2015SF021)

郝廣華，女，1978-05生，博士后，主治醫(yī)師，E-mail：guanghua-h@163.com

2016-12-29

R543

A

1007-6611(2017)04-0306-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.002