何麗芳，金晨鐘，鄧 港，胡一鴻，林王花，張雪嬌

（湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，農(nóng)藥無害化應(yīng)用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000）

超聲波輔助提取柱花草多酚工藝優(yōu)化

何麗芳，金晨鐘，鄧 港，胡一鴻，林王花，張雪嬌

（湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，農(nóng)藥無害化應(yīng)用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000）

以柱花草為材料，通過單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)超聲波輔助提取柱花草多酚工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。選取超聲功率、超聲時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，研究不同工藝參數(shù)對(duì)柱花草多酚提取濃度的影響。結(jié)果表明：超聲波輔助提取柱花草多酚的最優(yōu)工藝條件為超聲功率160 W，超聲時(shí)間60 min，料液比1︰30，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%；在此條件下，柱花草多酚濃度達(dá)9.138 mg/g。

柱花草；多酚；超聲波輔助提??；工藝優(yōu)化

柱花草（Stylosanthes guianensias SW.）又名筆花豆（pencilflower），是多年生豆科蝶形花亞科牧草，原產(chǎn)于中南美洲，該屬共有種或亞種50個(gè)[1]。該牧草于1962年被引進(jìn)至我國(guó)，目前已成為我國(guó)南方地區(qū)大面積推廣種植的熱帶牧草。柱花草具有耐旱、耐酸、耐堿、耐貧瘠、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的特點(diǎn)，主要用于畜牧飼養(yǎng)、飼料加工、有機(jī)綠肥和水土保持等領(lǐng)域[2]。柱花草不僅粗蛋白含量高[3-4]，而且富含多種維生素、礦物質(zhì)元素和微量元素，多酚類物質(zhì)含量也較高。植物多酚是廣泛存在于植物體內(nèi)的一類分子量為500～3 000的多羥基酚，是復(fù)雜酚類的次生代謝產(chǎn)物[5]，同時(shí)也是大自然中一類儲(chǔ)量豐富、可再生的綠色資源。因其特殊的功能活性及藥用價(jià)值，植物多酚在化工、制藥、食品、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、建材等領(lǐng)域具有重要意義及廣闊的應(yīng)用前景。近年來，大量醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，植物多酚具有抗氧化、抗病菌、抗癌、抗衰老、增強(qiáng)免疫力以及預(yù)防心腦血管疾病等重要功能[6]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)柱花草功能性成分的研究甚少[7]，尤其是柱花草多酚的研究更是鮮見[8]，研究主要集中在柱花草的栽培技術(shù)、遺傳多樣性、抗病抗旱性、飼料飼養(yǎng)等方面[9-11]。柱花草中多酚含量豐富，且其來源廣泛、價(jià)格低廉，將其作為一種新的植物多酚資源進(jìn)行開發(fā)利用具有較大的應(yīng)用價(jià)值。因此，試驗(yàn)采用超聲波輔助法提取柱花草多酚，對(duì)超聲功率、超聲時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)等因素與柱花草多酚濃度的關(guān)系進(jìn)行研究，并進(jìn)一步利用正交試驗(yàn)對(duì)柱花草多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為柱花草多酚的提取提供了一定的參考，并且為柱花草的綜合利用及深度加工提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試柱花草品種為熱研10號(hào)，自行種植，采集株高60 cm左右的柱花草去掉根部，凍干、粉碎，過80目篩，密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)器材主要有XFB-400型高速中藥粉碎機(jī)（吉首市中誠制藥機(jī)械廠），SK3300HP型超聲波清洗器（重慶東悅儀器有限公司），UV-1240型紫外分光光度計(jì)（日本島津），F(xiàn)D-2A型冷凍干燥機(jī)（美國(guó)熱電）；試驗(yàn)主要試劑有沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林-酚試劑（分析純，Sigma公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn) （1）超聲功率：在固定超聲時(shí)間40 min、料液比1︰20 （g/mL）、乙醇濃度60%的情況下，分別考察超聲功率為100、120、140、160、180 W時(shí)提取的多酚濃度。（2）超聲時(shí)間：在固定超聲功率為120 W、料液比1︰20（g/mL）、乙醇濃度60%的情況下，分別考察超聲時(shí)間為30、40、50、60、70 min時(shí)提取的多酚濃度。（3）料液比：在固定超聲功率120 W、超聲時(shí)間40 min、乙醇濃度60%的情況下，分別考察料液比為1︰15、1︰20、1︰25、1︰30、1︰35時(shí)提取的多酚濃度。（4）乙醇體積分?jǐn)?shù)：在固定超聲功率120 W、超聲時(shí)間40 min、料液比1︰20（g/mL）的情況下，分別考察乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)提取的多酚濃度。

1.2.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素3水平L9（34）的正交試驗(yàn)，各因素水平見表1，通過正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝[12]。

表1 正交試驗(yàn)各因素水平

1.2.3 多酚含量測(cè)定 柱花草總多酚含量的測(cè)定參照張雪嬌等[13-14]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲功率對(duì)柱花草多酚提取的影響

如圖1所示，隨著超聲波功率的增加，柱花草多酚濃度呈上升趨勢(shì)，這有可能是因?yàn)槌暡ǖ目栈?yīng)和機(jī)械破損作用加快了柱花草細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破碎，使溶媒滲透到細(xì)胞中，柱花草中的多酚類化合物更容易被浸提出來[15]。當(dāng)功率160 W時(shí)多酚濃度最高，在一定時(shí)間內(nèi)，超聲功率越高，空化效應(yīng)越強(qiáng)，有利于物料中有效成分的浸出。當(dāng)超聲功率超過160 W時(shí)，多酚濃度變化不顯著，說明超聲功率達(dá)到一定值后產(chǎn)生的熱量會(huì)加速多酚氧化，增加多酚損失，因此選取160 W為最佳提取功率。

2.2 超聲時(shí)間對(duì)柱花草多酚提取的影響

圖1 不同超聲功率提取柱花草多酚濃度的比較

從圖2可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間≤60 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的增加，多酚濃度不斷提高；超聲時(shí)間為60 min時(shí)，多酚濃度最高；當(dāng)超聲時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，多酚濃度反而略微下降。這可能是因?yàn)樵谳^短的超聲時(shí)間內(nèi)，超聲破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有利于多酚類物質(zhì)溶出，若超聲時(shí)間過長(zhǎng)，使細(xì)胞內(nèi)溫度升高，多酚類物質(zhì)被降解，導(dǎo)致柱花草多酚的得率下降[16]。因此，選取60 min作為最佳超聲時(shí)間。

圖2 不同超聲時(shí)間提取柱花草多酚濃度的比較

2.3 料液比對(duì)柱花草多酚提取的影響

由圖3可知，隨著溶劑的增加，柱花草多酚濃度隨之增加，說明溶劑比例大有利于多酚類化合物的溶出。但當(dāng)料液比在1∶20 ～1∶35之間，多酚濃度的變化比較平穩(wěn)，呈低增長(zhǎng)趨勢(shì)。這可能是由于溶劑過少，溶液容易達(dá)到飽和，不利于有效成分提取，而溶劑過多，超聲波對(duì)物料的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)的強(qiáng)度降低，影響提取效果[17]，而且還會(huì)增加生產(chǎn)成本和雜質(zhì)的含量，為后續(xù)的分離純化工藝增加難度。綜合考慮，確定最佳料液比為1∶30。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)柱花草多酚提取的影響

如圖4所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多酚濃度呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)提取效果最佳；繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，多酚濃度反而呈下降趨勢(shì)。這可能是由于過低體積分?jǐn)?shù)的乙醇不足以破壞多酚-蛋白質(zhì)穩(wěn)定復(fù)合物的氫鍵，降低了多酚的溶解率，導(dǎo)致多酚濃度不高；過高體積分?jǐn)?shù)的乙醇則因?yàn)槿軇┑臉O性與多酚差距增大，導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的溶解度降低[18]。因此，確定最優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖3 不同料液比提取柱花草多酚濃度的比較

圖4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取柱花草多酚濃度的比較

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了表1中條件參數(shù)的L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。從極差值可以看出，各因素對(duì)柱花草多酚提取的影響從大到小依次為A＞B＞C＞D，即超聲功率＞超聲時(shí)間＞料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。在正交試驗(yàn)中極差越大，該因素變動(dòng)時(shí)，柱花草多酚提取率也會(huì)隨之變化，且因素變動(dòng)越大，多酚濃度的變化也會(huì)越大。由表2可知，柱花草多酚提取的最優(yōu)工藝條件為A3B3C2D1，即在超聲功率160 W，超聲時(shí)間60 min，料液比1︰30，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%的條件下，柱花草多酚濃度最高，為9.138 mg/g。

3 結(jié)論與討論

植物多酚，是植物次生代謝產(chǎn)物的一類總稱，包含單寧和源于單寧的多種化合物[19]。植物多酚可供開發(fā)的資源充足，來源廣泛，儲(chǔ)量豐富，茶葉、水果、中草藥等植物中均有豐富的含量，目前發(fā)現(xiàn)的植物多酚種類已超過8 000種。植物多酚由于具有清除機(jī)體自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗動(dòng)脈硬化、抑菌、抑制高血壓等生理功效[20]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、化工材料等領(lǐng)域，成為了國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者的研究熱點(diǎn)，具有廣闊的開發(fā)潛力。柱花草多酚含量豐富，以柱花草為原料提取多酚，不僅成本低廉，而且為柱花草的深度開發(fā)利用打開了一條思路。

近年來，超聲波提取技術(shù)因其理想的提取效果備受人們關(guān)注。目前，針對(duì)植物多酚的超聲輔助提取技術(shù)已有較多報(bào)道，李穎暢等[18]研究了超聲輔助提取紫菜多酚，提取量為6.803 mg/g，比單獨(dú)使用乙醇溶液浸提的紫菜多酚提取率提高 8.62%。該研究利用超聲波輔助提取技術(shù)對(duì)柱花草多酚進(jìn)行提取，得到最佳工藝條件為超聲功率160 W，超聲時(shí)間60 min，料液比1︰30，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，在此條件下從熱研10號(hào)柱花草中提取的多酚濃度最高，為9.138 mg/g，與吳德錦[21]測(cè)定的熱研10號(hào)柱花草多酚含量為7.63 g/kg相比較，提取率提高了近20%。超聲波提取植物多酚得率高，可能是因?yàn)槌暤目栈?yīng)、機(jī)械振動(dòng)作用和熱效應(yīng)破壞了植物細(xì)胞，加快了溶劑滲透速率，從而縮短了浸提時(shí)間[22]。同時(shí)，由于是在低溫下提取，避免了高溫破壞熱敏性成分的現(xiàn)象，使得有效成分保留完全、雜質(zhì)較少[16]。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

[1] 唐燕瓊，胡新文，郭建春，等. 柱花草種質(zhì)遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（1）：57-64.

[2] 蔡小艷，賴志強(qiáng)，易顯鳳，等. 我國(guó)南方柱花草的利用現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，2010，（3）：51-53.

[3] 尹曉暢. 柱花草品種（系）評(píng)價(jià)及部分性狀與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2014.

[4] 趙 鋼，陳嘉輝，余曉華，等. 不同品種柱花草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的動(dòng)態(tài)變化[J]. 仲惜農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，25（3）：15-18.

[5] 潘偉彬. 植物單寧及其對(duì)牧草品質(zhì)的影響研究進(jìn)展I. 植物單寧的性質(zhì)與作用[J]. 漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，10（3）：58-61.

[6] 石恩慧，李 紅，谷明燦，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取板栗總苞多酚工藝條件[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2013，13（5）：69-76.

[7] 陳加利，沈文濤，虞道耿，等. 不同品種柱花草中單寧含量的比較[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，30（4）：30-32.

[8] 陳 晨，胡文忠，田沛源，等. 超聲輔助提取香蕉皮多酚工藝優(yōu)化及其抗氧化性的分析[J]. 食品科學(xué)，2014，35（2）：12-17.

[9] 張宣宣，黃佑誼，邱質(zhì)華，等. 柱花草生產(chǎn)、加工與開發(fā)利用技術(shù)研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)工程，2011，35（1）：4-7.

[10] 周漢林，李 茂，白昌軍，等. 應(yīng)用體外產(chǎn)氣法研究柱花草的飼用價(jià)值[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2010，31（10）：1696-1701.

[11] Way H M，Kanzan K，Goulter K C，et al. Expression of the Shpx2 peroxidase gene of Stylosanthes humilis in transgenic tobacco leads to enhanced resistance to Phytophthora parasitica pv. nicotianae and Cercospora nicotianae[J].Molecular Plant Pathology，2000，1（4）：223-232.

[12] 王 嵐，吳定軍，魯?shù)劳? 梵凈山七葉一枝花總黃酮提取工藝的優(yōu)化[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，45（4）：634-638.

[13] 張雪嬌，胡一鴻，譚顯勝，等. 玉竹多酚微波輔助提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技，2014，35（19）：208-213.

[14] 張雪嬌，金晨鐘，胡一鴻，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取木槿花多酚的工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技，2015，36（21）：228-232.

[15] 包亞妮，袁 芳. 不同方法在蛋白-多糖復(fù)合反應(yīng)中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].食品工業(yè)科技，2012，33（17）：383-387.

[16] 王苗苗，趙有為，趙開麗，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化辣木葉總黃酮超聲波輔助提取工藝[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技，2015，38（4）：22-28.

[17] 張 寧，馬朝陽，婁在祥. 超聲-微波協(xié)同輔助萃取茶皂素[J]. 中國(guó)油脂，2013，38（8）：77-80.

[18] 李穎暢，張 笑，呂艷芳，等. 響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取紫菜多酚[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2014，14（9）：82-89.

[19] 張玉潔. 番杏多酚提取純化及抗氧化活性研究[D]. 長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2016.

[20] Hossain M B，Camphuis G，Aguiló-Aguayo I，et al. Antioxidant activity guided separation of major polyphenols of marjoram（Origanum majorana L.）using flash chromatography and their identification by liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Journal of Separation Science，2014，37（22）：3205-3213.

[21] 吳德錦. 常見菌草菌糠營(yíng)養(yǎng)特性及抗?fàn)I養(yǎng)因子研究[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2014.

[22] 裴 斐，陶虹伶，蔡麗娟，等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化辣木葉多酚超聲輔助提取工藝及其抗氧化活性[J]. 食品科學(xué)，2016，37（20）：24-30.

（責(zé)任編輯：成 平）

Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Polyphenols from Stylosanthes Guianensias

HE Li-fang，JING Chen-zhong，DENG Gang，HU Yi-hong，LIN Wang-hua，ZHANG Xue-jiao
（Hunan Provincial Collaborative Innovation Center for Field Weeds Control, Key Laboratory of Harmless Application of Pesticide in Hunan Higher Education, College of Agriculture and Biotechnology, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, PRC）

Used the Stylosanthes guianensias as material to optimize the technological conditions of ultrasonic extraction of polyphenols from it, a single factor and orthogonal design was adopted. Selected the ultrasonic power, extraction time, ethanol concentration and a solid/ liquid ratio on extraction rate as index to study the effect of different process parameters on extraction concentration of polyphenols in Stylosanthes guianensias. The results suggested that the optimum technological condition for ultrasonic assisted extraction of polyphenols from Stylosanthes guianensias is: 160W ultrasonic power, 60 min extraction time, 1∶30 solid/ liquid ratio and 60% ethanol volume fraction. Under these conditions, the concentration of polyphenols reached 9.138 mg/g.

Stylosanthes guianensias; polyphenols; ultrasound-assisted extraction; process optimization

S541+.9

：A

：1006-060X（2017）06-0074-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.006.022

2017-03-24

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（201410553005）；湖南省大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（2014-502）；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金項(xiàng)目（15K066，16K047）；湖南省高校產(chǎn)業(yè)化培育項(xiàng)目（13CY030）

何麗芳（1994-），女，廣西來賓市人，本科生，專業(yè)：食品科學(xué)與工程。

張雪嬌