大連海洋大學食品科學與工程學院叢瑤黃婧阿依夏穆·買買提蔣仕潔石佳琦徐晨輝溫鳳凌趙慧

魚皮膠原蛋白肽脫腥脫色工藝研究

大連海洋大學食品科學與工程學院叢瑤黃婧阿依夏穆·買買提蔣仕潔石佳琦徐晨輝溫鳳凌趙慧

本實驗以鯉魚皮為原料，通過蒸煮法制備明膠，選用水解度高的胰蛋白酶和中性蛋白酶對明膠進行酶解，研究了D4006、D3520、X-5、AB-8四種吸附樹脂對鯉魚皮明膠水解液脫腥、脫色的效果；測定吸附后產物的蛋白損失率，并進行感官評價，篩選出樹脂類型。通過測定，胰蛋白酶水解度為19.19%，中性蛋白酶為15.25%；D4006樹脂對中性蛋白酶的明膠水解液脫腥、脫色的效果最佳，此時條件為樹脂與酶解液之比為5g∶100ml，脫腥、脫色時間為3h，溫度為25℃。

鯉魚皮；明膠；酶解；樹脂；脫腥與脫色

膠原蛋白多存在于動物的真皮、肌肉、骨骼等部位，約占動物體內總蛋白質含量的25%～30%[1]，在生物體器官組織的形成中起重要作用，并參與細胞多種功能的表達。膠原蛋白在生物制藥上有廣泛的應用，包括治療骨關節(jié)炎、高血壓，以及植入人體，用于組織的再生和修復[2-5]。明膠是在膠原蛋白的基礎上將動物的皮、骨、韌帶等進行精制后得到的一種膠體物質，是膠原蛋白的變性產物，可作為食物的穩(wěn)定劑、增稠劑，也可應用于糖果中，使其更加堅韌、具有彈性。

膠原蛋白和明膠多來源于牛、豬，但隨著瘋牛病、口蹄疫的傳播及宗教因素影響，限制了該類動物膠原蛋白的應用[6]。我國海洋漁業(yè)資源極為豐富，在魚類加工過程中會產生大量未被利用的皮、鱗、骨和鰭等下腳料。因此，以魚類下腳料作為膠原蛋白、明膠的來源，既可避免疾病風險，也可提高魚類加工利用率。由于膠原蛋白和明膠分子量較大，導致生物體吸收緩慢，而利用酶法將其水解成分子量較小的生物活性肽，可減小人體腸胃消化吸收的負荷，利于發(fā)揮其效應[7]。但由于魚類明膠的酶解產物會帶有一定的色素和腥味，阻礙了其在食品行業(yè)的推廣和發(fā)展，因此對膠原蛋白肽的脫腥脫色已成為一項重要的研究內容。

脫腥脫色的方法可分為感官掩蔽法、物理法、化學法、生物法[8]，實驗中常見有活性炭法、氧化還原法、酵母法及樹脂吸附法等[9-10]。其中樹脂吸附法對有機物有較好的選擇性，可以分離有毒物質，吸附量大、機械強度高，同時樹脂的物理和化學性質也較為穩(wěn)定，并且一般利用水、稀酸稀堿或者有機溶劑即可令其再生。

本實驗以鯉魚皮為原料制備明膠多肽，對不同樹脂的脫腥脫色效果進行對比分析，確定了明膠多肽的提取、脫腥脫色條件。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

原料：鯉魚皮。

試劑：氫氧化鈉、冰乙酸、氯化鈉、石油醚、水合茚三酮、L-酪氨酸、無水碳酸鈉、四硼酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，均為分析純。

酶制劑：木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶均購于天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；胃蛋白酶購于上海蓮冠生物化工有限公司。

樹脂：D4006型樹脂、X-5型樹脂、D3520型樹脂、AB-8型樹脂購于天津南開大學樹脂有限公司。

1.2 儀器設備

BS224S分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

101-2-BS電熱恒溫鼓風干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；

PHS-3C型精密PH計：上海安亭昌吉路149號雷磁儀器廠；

721可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；

YXZ80B高溫高壓蒸煮鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；

HJ-6多頭磁力加熱攪拌器：常州國華電器有限公司；

RE-52C旋轉蒸發(fā)器：鞏義市予華儀器有限責任公司；

SCIENTZ-10N冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；

WD-9405A脫色搖床：北京六一儀器廠。

1.3 主要方法

1.3.1 鯉魚皮基本組分測定

水分：GB5009.3—2010《食品安全國家標準〈食品中水分的測定〉》；

灰分：GB5009.4—2010《食品安全國家標準〈食品中灰分的測定〉》；

粗蛋白質：GB5009.5—2010《食品安全國家標準〈食品中蛋白質的測定〉》；

粗脂肪：GB14772—2008《食品中粗脂肪的測定》。

1.3.2 原料預處理

將鯉魚皮浸泡在0.1mol/LNaOH、NaCl的混合溶液（V/V=1：1）中4～6小時，用蒸餾水清洗至中性后浸泡于1%醋酸溶液中10min，除去魚表層黑皮及雜質。

1.3.3 魚皮膠原蛋白肽的制備

將預處理后的魚皮與蒸餾水按料液比1∶3混合，調節(jié)pH值至6～6.5，在121℃下蒸煮20min，抽濾、冷凍干燥得到明膠固體。

配制4%的明膠（W/V）溶液，分別加入表1[11]中5種蛋白酶（W/V=4：100），依照對應條件酶解明膠溶液，恒溫酶解6小時[13]，反應結束在100℃下滅酶10min。

表1 蛋白酶最適反應條件

1.3.4 蛋白質水解度測定

采用茚三酮比色法[12]測定明膠水解液水解度，篩選出A、B兩種效果較好的酶解液。

1.3.5 明膠酶解液的脫腥、脫色

采用D4006型、D3520型、X-5型以及AB-8型四種吸附樹脂對A、B水解液進行脫腥脫色處理。向250ml錐形瓶中分別加入5g樹脂和100ml酶解液，在25℃下恒溫振蕩3h，抽濾后取上清液冷凍干燥并稱量，設置空白組（即不加入任何樹脂）作為對照，計算蛋白質損失率。

1.3.6 感官評價

培養(yǎng)10名感覺器官機能良好[13]的檢察人員對脫腥脫色后的產物從色澤、氣味以及滋味三方面進行感官評價，并按照表2填寫評價表格；對10名檢查人員的感官評價作統(tǒng)計并計算分析，分值越小表明測定結果越好。

表2 脫腥脫色評價標準

2 結果與討論

2.1 鯉魚皮基本組分分析

參照《食品安全國家標準》測定方法進行測定，結果如表3所示。魚皮的基本組分含量如下：

表3 鯉魚皮基本組分含量

由表3可看出，鯉魚皮蛋白質的含量約占魚皮干重的28.32%，膠原蛋白十分豐富，表明鯉魚皮具有很高的研究價值。本實驗中利用蒸煮法提取魚皮明膠產率占魚皮干重的68.31%，與魚皮初始蛋白質含量相比減少了17.09%，而產生這一差值的主要原因是在去除魚皮黑色表皮過程中損失了部分膠原蛋白。

2.2 蛋白酶水解度分析

2.2.1 標準曲線的測定

以明膠蛋白質為橫坐標測定數(shù)值，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線（圖1）。

圖1 蛋白酶水解度測定標準曲線

圖1所示的標準曲線線性回歸方程：y=1.1450x-0.1442，R2=0.9910；該標準曲線R2值趨近于1，說明線性回歸好，數(shù)據與曲線吻合度高。

2.2.2 不同蛋白酶水解度的測定

根據待測樣品的光密度值從所繪制的標準曲線上查得明膠蛋白質含量，并根據蛋白酶水解度公式計算出中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及胃蛋白酶五種不同酶解液蛋白質的水解度（圖2）。

圖2 蛋白酶水解度測定結果

由圖2可看出，在酶最適條件下反應相同時間，五種蛋白酶對魚皮明膠的酶解均有一定效果，其中蛋白質水解度較高的兩種酶依次為胰蛋白酶和中性蛋白酶，水解度分別是19.19%和15.25%，因此，可篩選出的胰蛋白酶和中性蛋白酶的酶為酶解使用酶。

2.3 明膠酶解液脫腥、脫色分析

用D4006型、D3520型、X-5型以及AB-8型樹脂分別對胰蛋白酶、中性蛋白酶兩種酶解液分別進行脫腥脫色處理，并將樣品冷凍干燥，計算得到兩種酶解液的蛋白質損失率（圖3）。

圖3 蛋白質損失率

由圖3可看出，在相同反應條件下，中性蛋白酶酶解液的蛋白質損失率普遍低于胰蛋白酶酶解液，且經D4006型吸附樹脂處理過的魚皮明膠酶解液的蛋白質損失率低于其他型號樹脂，其中經D4006型樹脂吸附后的中性蛋白酶酶解液效果最佳，其蛋白質損失率為7.27%。

2.4 感官鑒定評估結果分析

D4006型、D3520型、X-5型和AB-8型樹脂對中性蛋白酶、胰蛋白酶兩種酶解液脫腥脫色后的感官評價結果（圖4～圖6）。

圖4 不同樹脂對中性蛋白酶酶解液脫腥脫色感官評價

由圖4可知，空白組在色澤、氣味和滋味三方面的感官分值分別為2.6、3.7、3.4，與空白相比較，經不同樹脂處理后的樣品感官分值均低于空白組，表明上述四種樹脂對中性蛋白酶酶解液具有一定的脫腥脫色效果，處理后的樣品在色澤、氣味及滋味方面有明顯的改善。其中，對中性蛋白酶酶解液脫色效果較好一組為X-5型樹脂組，平均分值為1.6；脫腥效果較好的是D4006型樹脂組，分值為1.8；口感滋味較好的是D4006型，分值為2.3。

圖5 不同樹脂對胰蛋白酶酶解液脫腥脫色感官評價

由圖5可知，空白組在色澤、氣味和滋味上的感官分值依次為4.7、3.0、3.5，與空白組相比，實驗組在色澤、氣味和滋味上均得到了一定的改善，其中對胰蛋白酶酶解液脫色效果較好的樹脂為D4006型樹脂，平均分值為3.0；脫腥效果較好的是D4006型樹脂，分值為2.3；而口感滋味較好的是X-5型，分值為1.7。

圖6 蛋白酶酶解產物脫腥脫色整體感官評價

由6圖可知，四種樹脂對中性蛋白酶酶解液的脫腥脫色效果優(yōu)于胰蛋白酶酶解液，經D4006型樹脂吸附后的酶解液整體感觀評價也優(yōu)于其他型號樹脂，且經D4006型樹脂吸附后的酶解液的蛋白質損失率也低于其他實驗組。中性蛋白酶價格較低，適合工業(yè)化推廣，所以可以選用中性蛋白酶酶解魚皮明膠，并利用D4006型樹脂對明膠酶解液進行脫腥脫色處理。

3 結論

（1）通過測定蛋白質水解度，從中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶中選取水解度較高的胰蛋白酶和中性蛋白酶兩種酶解液，水解度分別為19.19%，15.25%。

（2）對兩種酶解液分別用D4006、D3520、X-5和AB-8樹脂進行脫腥、脫色研究，經D4006樹脂處理過的魚皮明膠酶解液的蛋白質干重損失率與感官評估分值較低，其中胰蛋白酶水解液干重損失率為7.97%，中性蛋白酶為7.27%。

（3）以D4006樹脂的脫腥脫色效果最佳，此時脫腥脫色條件為樹脂與魚皮明膠酶解液料液比為5g∶100ml，反應時間3h，溫度為25℃。

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