秦 鋒，蔡孟楷，張偉東，張 京，方 博，黃俊明，卜德新，羅勇峰，馬 駿，付新亮，曹振鵬，張桂紅

(1 廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心/華南農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642； 2 華南農(nóng)業(yè)大學醫(yī)院，廣東 廣州 510642；3 煙臺市福山區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東 煙臺 261400)

3株H1N1亞型豬流感病毒的HA基因遺傳信息及抗原特異性分析

秦 鋒1?，蔡孟楷1?，張偉東2，張 京3，方 博1，黃俊明1，卜德新1，羅勇峰1，馬 駿1，付新亮1，曹振鵬1，張桂紅1

(1 廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心/華南農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642； 2 華南農(nóng)業(yè)大學醫(yī)院，廣東 廣州 510642；3 煙臺市福山區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東 煙臺 261400)

【目的】分析3株屬于歐亞類禽(SWSS1)、經(jīng)典(SWL6)與Pdm09H1N1(Pdm091057)分支的豬流感病毒的HA基因遺傳信息及抗原的特異性，為HA基因抗原表位的功能研究及流感防控奠定基礎。 【方法】以SWSS1株、SWL6株和Pdm091057株流感病毒為材料，比較分析3株H1N1亞型HA基因片段的遺傳信息，制備全病毒滅活疫苗，各免疫3只雌性新西蘭大白兔，采用血凝抑制(Hemagglutination inhibition, HI)反應試驗檢測抗體滴度。 【結(jié)果】3株病毒的HA基因片段的氨基酸序列相似性為69.4%～89.1%，各分支的HA基因的抗原表位存在差異；3株病毒經(jīng)過2次免疫后平均HI抗體滴度均能達1 280以上，且SWSS1的平均HI抗體滴度高達2 560。同時SWSS1與SWL6、Pdm091057這2株病毒均無血清學交叉反應，而SWL6與Pdm091057有較低的血清學交叉反應。 【結(jié)論】3株豬流感病毒的HA基因片段抗原表位存在著差異，可能是3毒株之間血清學交叉反應較低的原因。3株病毒免疫原性均較好，可作為候選疫苗株。

豬流感病毒；H1N1；遺傳信息；抗原表位；血凝抑制；抗體滴度；HA基因

甲型流感病毒可引起包括人、豬、馬、鳥類及海洋動物感染的病毒性傳染病，其主要宿主是水禽。豬呼吸道上皮細胞具有 2種流感病毒受體，能夠同時感染人流感病毒和禽流感病毒，被認為是流感病毒的中間宿主或流感病毒的“混合器”。在豬體內(nèi)同時感染的多種流感病毒有可能通過重組，或在對哺乳動物的適應過程，產(chǎn)生新的變異毒株[1]。1993年Fan等[2]在中國南方以及東南亞地區(qū)分離出類禽(Eurasian avian-like，EA)H1N1 SIV，現(xiàn)該類病毒已在亞洲多個地區(qū)豬群中廣泛流行。2009年甲型H1N1/2009流感(Pdm09H1N1)在墨西哥暴發(fā)，并且迅速蔓延感染至其他國家地區(qū)。Pdm09H1N1流感病毒來源于豬，是一種人、豬、禽三源重組的病毒[3]。Chen等[4]在對華南地區(qū)流感病毒血清學調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，同1份血清中可以同時檢測到3種亞型流感病毒抗體，表明H1N1豬流感的流行狀況復雜。歐亞類禽H1N1、Pdm09H1N1、經(jīng)典H1N1等亞型豬流感病毒長期共存在我國豬群中[5]，嚴重影響豬群的健康和公共衛(wèi)生安全。

本研究對華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院分離到的豬流感病毒SWSS1株、SWL6株和Pdm091057株，進行生物信息學分析，并制備全病毒滅活疫苗，免疫雌性新西蘭大白兔，采用血凝抑制試驗方法，對流行于我國豬群中的H1N1亞型豬流感病毒不同分支之間的血清學交叉特性進行分析，以期為血清學診斷提供參考依據(jù)，同時也為流感病毒的通用疫苗的研制及防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

7株流感病毒株由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院傳染病實驗室提供，分別為SWSS1：A/swine/Guangdong/ SS1/2012(HINI)、SWL6：A/swine/Guangdong/ L6/2012(HINI)、Pdm091057：A/Guangdong/ 1057/2010(H1N1)、A/swine/Guangdong/ l22/2010(H3N2)、A/Chicken/Shanghai/ 10/2001(H9N2)、A/Duck/Anhui/1/2006/(H5N1)、A/Pigeon/Shanghai/S1421/2013(H7N9)，其中，A/swine/Guangdong/SS1/2012(HINI)、A/swine/Guangdong/L6/2012(HINI)和A/Guangdong/1057/2010(H1N1)作為免疫原用于制備滅活疫苗。12只雌性新西蘭大白兔購自南方醫(yī)科大學動物實驗中心；SPF雞胚購自廣州市華南農(nóng)業(yè)大學生物藥品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒的增殖 病毒增殖按照文獻[6]的方法進行。

1.2.2 病毒血凝效價、EID50及病毒的雞胚生長曲線的測定 待檢病毒液的血凝試驗按照世界衛(wèi)生組織的標準進行，病毒株的EID50按照文獻[6]的方法進行測定。將100 EID50的原始病毒接種9日齡的SPF雞胚，分別在24、36、48、60和72 h收集尿囊液進行血凝效價測定，并繪制雞胚生長曲線。

1.2.3 遺傳和抗原相關(guān)性分析 在GenBank中選擇具有代表性的H1N1豬流感病毒不同分支參考毒株，利用生物信息學軟件分析SWSS1、SWL6和Pdm091057病毒株的遺傳進化情況。

1.2.4 疫苗制備 收獲107EID50以上的病毒液，按照體積比1∶1，加入體積分數(shù)為0.2%的甲醛溶液做滅活抗原。置37 ℃恒溫搖床內(nèi)滅活24～48 h，并在10日齡SPF雞胚上連續(xù)傳3代安檢。分別取3株滅活病毒抗原液，分別用弗氏佐劑制備上述3種病毒的全病毒滅活疫苗，油水體積比為2∶1。

1.2.5 免疫試驗 將12只新西蘭大白兔分成4組，每組3只，第1、2、3組為免疫組，分別腹腔注射SWSS1、SWL6和Pdm091057的全病毒滅活疫苗，0.1 mL·只–1，第4組為PBS對照組。免疫后每周采血檢測血凝抑制(Hemagglutination inhibition, HI)抗體滴度，2次免疫后待抗體水平達到穩(wěn)定時，收獲血清備用。

1.2.6 血清學交叉反應試驗 進行SWSS1、SWL6和Pdm091057病毒株之間的血清學交叉反應試驗以及與H3、H5、H7、H9亞型流感病毒的血清學交叉反應試驗。HI試驗參照文獻[7]的方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 HA基因片段遺傳信息和抗原位點分析

SWSS1、SWL6和Pdm091057病毒株及在GenBank中所選參考毒株的遺傳進化分析表明，SWSS1株屬于歐亞類禽分支，SWL6屬于經(jīng)典H1N1分支，Pdm091057屬于Pdm09H1N1分支(圖1)。病毒抗原位點所在的HA基因片段的氨基酸序列相似性對比結(jié)果顯示，SWSS1株與SWL6株的HA基因片段的氨基酸序列相似性為70.3%，SWSS1株與Pdm091057株的HA基因片段的氨基酸序列相似性為69.4%，SWL6株與Pdm091057株的HA基因片段的氨基酸序列相似性為89.1%。

圖1 SWSS1、SWL6和Pdm091057病毒株的HA基因遺傳進化關(guān)系Fig. 1 Phylogenetic tree of HA genes of SWSS1, SWL6 and Pdm091057 strains

進一步分析3株病毒株HA基因片段的抗原位點[7]，SWSS1毒株與SWL6、Pdm091057毒株的HA基因片段的抗原位點比較結(jié)果見圖2，SWSS1毒株與SWL6毒株在Sa位點有4個氨基酸位點的不同，與Pdm091057毒株有2個氨基酸位點的不同；SWSS1毒株與SWL6毒株Sb抗原位點有4個氨基酸位點的不同，與Pdm091057毒株Sb抗原位點有2個氨基酸位點的不同；SWSS1毒株與SWL6毒株Cb抗原位點有2個氨基酸位點的不同，與Pdm091057毒株Cb抗原位點有1個氨基酸位點的不同；SWSS1毒株與SWL6毒株、Pdm091057毒株Ca1抗原位點各有3個氨基酸位點的不同；SWSS1毒株與SWL6毒株、Pdm091057毒株Ca2抗原位點各有5個氨基酸位點的不同。

圖2 SWSS1、SWL6和Pdm091057病毒株HA基因片段抗原表位分析Fig. 2 Analysis of antigenic epitopes in HA gene fragments of SWSS1, SWL6 and Pdm091057 strains

2.2 病毒血凝效價、EID50及病毒的雞胚生長曲線

SWSS1、SWL6和Pdm091057病毒株分別接種雞胚收集尿囊液，檢測病毒的紅細胞凝集效價分別為211、29和210；計算SWSS1、SWL6和Pdm091057病毒株的雞胚半數(shù)感染量，其lgEID50·mL–1分別為9.0、8.2和8.5；將100 EID50的原始病毒液接種9日齡的SPF雞胚，收集尿囊液進行血凝效價測定，結(jié)果如圖3所示，3株病毒株在雞胚中均表現(xiàn)出高復制能力，具有較高的雞胚適應性。

2.3 滅活疫苗免疫后病毒株的HI抗體滴度

采用血凝抑制試驗檢測免疫2次后兔血清中HI抗體滴度，以評價SWSS1、SWL6和Pdm091057病毒株的免疫效果，結(jié)果如圖4所示，首免第3周HI抗體滴度可達到1 280以上，第3周再次免疫后，3株病毒株均可誘導較高的HI抗體滴度，且SWSS1的HI平均抗體滴度高達2 560以上。

2.4 血清學交叉反應

圖3 病毒的雞胚生長曲線Fig. 3 Chicken embryo growth curves of the viruses

圖4 HI抗體滴度Fig. 4 HI antibody titer

上述試驗制備的陽性抗SWSS1血清、抗SWL6血清和抗Pdm091057血清為標準血清，H1、H3、H5、H7、H9亞型流感病毒株血清學交叉反應如表1所示，SWSS1毒株制備的抗體與類人季節(jié)性H3N2亞型流感病毒具有較低水平的血清學交叉反應，與其他亞型無血清學交叉反應，SWL6與Pdm091057毒株制備的抗體相互之間具有較低的血清學反應，與其他亞型流感病毒無血清學反應。

表1 不同亞型抗原對標準血清抗體滴度檢測結(jié)果Tab. 1 The titers of different subtypes of the influenza virus against the standard serums

3 討論與結(jié)論

近年來隨著流感病毒的變異，豬流感病毒感染人的現(xiàn)象時有發(fā)生，流感病毒可通過不斷變異和進化，逃避宿主的免疫保護，引起新的暴發(fā)和流行[8]。Liu等[9]對華南地區(qū)豬群流感的發(fā)生和流行情況進行的研究表明多數(shù)豬場存在H1、H3亞型豬流感病毒感染情況，一些豬群還存在禽源H4、H5、H7、H9等亞型流感病毒抗體[10]。目前在世界豬群中流行的H1N1流感病毒主要分為3類：經(jīng)典H1N1、類禽H1N1、類人H1N1。有研究報道[11]，類禽H1N1在華南地區(qū)豬群中較為活躍，隨著變異和重組，感染人的風險逐步增強。

本試驗分析了甲型H1亞型流感病毒的HA基因遺傳進化關(guān)系，SWSS1株屬于歐亞類禽分支，SWL6屬于經(jīng)典H1N1分支，Pdm091057屬于Pdn09H1N1分支。3株病毒的HA基因片段的氨基酸序列相似性為69.4%～89.1%。同時，HA基因抗原表位分析揭示了SWSS1、SWL6和Pdm091057 毒株之間抗原位點的差異，這些差異會導致流感病毒表面蛋白構(gòu)象的理化特性不同[11]，這可能是H1亞型病毒之間的無血清學交叉反應的原因。同時，近年來的血清學調(diào)查顯示[12]，豬群中有多種亞型共感染的情況，在同一份血清中能同時檢測到H1、H3等多種亞型的流感抗體，且HI抗體效價相對較高，而本研究表明，SWSS1毒株制備的抗體與類人季節(jié)性H3N2亞型流感病毒具有較低水平的血清學交叉反應，與其他亞型無血清學交叉反應，SWL6株與Pdm091057株制備的抗體相互之間具有較低的血清學反應，而與其他亞型流感病毒無血清學反應，以上也證明了流感病毒在豬群中的共感染現(xiàn)象的存在，并且為流感病毒在豬“混合器”作用下發(fā)生流感病毒重組的可能提供了試驗依據(jù)。另外，本試驗抗SWSS1血清與人季節(jié)性H3N2亞型流感病毒之間及SWL6 株與Pdm091057株制備的抗體相互之間血清學交叉反應均較低，盡管其交叉反應機制尚不清楚，但Pdm091057株的HA基因來源于經(jīng)典H1亞型流感病毒的重組病毒，有研究表明流感病毒HA蛋白在病毒交叉反應的過程中起決定性作用[13-14]，理論上解釋了在進化關(guān)系上SWL6 株與Pdm091057株存在著一定的親緣關(guān)系，推測可能是其具有較低的血清學交叉反應的原因。

本試驗中3株病毒株在雞胚中均表現(xiàn)出高的復制能力，具有較高的雞胚適應性。首免后HI抗體滴度達到1 280以上，再次免疫后3株病毒株均可以誘導較高的HI抗體滴度，且SWSS1的平均HI抗體滴度高達2 560以上，有研究表明類禽H1N1流感病毒能降低同源異源H1亞型流感病毒對小鼠上致病性[15]，其保護機制有待進一步研究。本試驗結(jié)果顯示，類禽SWSS1株、SWL6株、Pdm091057 株病毒誘導機體產(chǎn)生高水平的抗體滴度，且平均HI抗體滴度達1 280以上，可以作為理想的疫苗候選株。另外普遍認為注射疫苗是抵抗流感病毒感染的有效方法，本研究初步分析了3株H1亞型流感病毒的HA蛋白的抗原表位，為下一步流感病毒致病機制的研究及基因工程通用表位疫苗的研制奠定基礎。

參考文獻：

[1]QIAO C, LIU L, YANG H, et al. Novel triple reassortant H1N2 influenza viruses bearing six internal genes of the pandemic 2009/H1N1 influenza virus were detected in pigs in China[J]. J Clin Virol, 2014, 61(4): 529-534.

[2]FAN X, ZHU H, ZHOU B, et al. Emergence and dissemination of a swine H3N2 reassortant influenza virus with 2009 pandemic H1N1 genes in pigs in China[J]. J Virol, 2012, 86(4): 2375-2378.

[3]ZHU H, ZHOU B, FAN X, et al. Novel reassortment of Eurasian avian-like and pandemic/2009 influenza viruses in swine: Infectious potential for humans[J]. J Virol, 2011, 85(20): 10432-10439.

[4]CHEN J, MA J, WHITE S K, et al. Live poultry market workers are susceptible to both avian and swine influenza viruses, Guangdong Province, China[J]. Vet Microbiol, 2015, 181(3/4): 230-235.

[5]DUCATEZ M F, HAUSE B, STIGGER-ROSSER E, et al. Multiple reassortment between pandemic (H1N1) 2009 and endemic influenza viruses in pigs, United States[J]. Emerg Infect Dis, 2011, 17(9): 1624-1629.

[6]MORENO A, DI TRANI L, FACCINI S, et al. Novel H1N2 swine influenza reassortant strain in pigs derived from the pandemic H1N1/2009 virus[J]. Vet Microbiol, 2011, 149(3/4): 472-477.

[7]ANDERSON T K, CAMPBELL B A, NELSON M I, et al. Characterization of co-circulating swine influenza A viruses in North America and the identification of a novel H1 genetic clade with antigenic significance[J]. Virus Res, 2015, 201: 24-31.

[8]YANG H, CHEN Y, QIAO C, et al. Prevalence, genetics, and transmissibility in ferrets of Eurasian avianlike H1N1 swine influenza viruses[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2016, 113(2): 392-397.

[9]LIU W, WEI M T, TONG Y, et al. Seroprevalence and genetic characteristics of five subtypes of influenza A viruses in the Chinese pig population: A pooled data analysis[J]. Vet J, 2011, 187(2): 200-206.

[10]QIU Y, DE HERT K, VAN REETH K. Cross-protection against European swine influenza viruses in the context of infection immunity against the 2009 pandemic H1N1 virus: Studies in the pig model of influenza[J]. Virus Res, 2015, 46: 105.

[11]VIJAYKRISHNA D, POON L L, ZHU H C, et al. Reassortment of pandemic H1N1/2009 influenza A virus in swine[J]. Science, 2010, 328(5985): 1529.

[12]CHEN Y, ZHANG J, QIAO C, et al. Co-circulation of pandemic 2009 H1N1, classical swine H1N1 and avian-like swine H1N1 influenza viruses in pigs in China[J]. Infect Genet Evol, 2013, 13: 331-338.

[13]GARTEN R J, DAVIS C T, RUSSELL C A, et al. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans[J]. Science, 2009, 325(5937): 197-201.

[14]王舒寧, 李國慶, 吳迪, 等. 甲型H1N1流感病毒HA蛋白抗原表位及受體結(jié)合位點突變特性的對比研究[J]. 生物物理學報, 2012(6): 486-498.

[15]SUI J, YANG D, QIAO C, et al. Protective efficacy of an inactivated Eurasian avian-like H1N1 swine influenza vaccine against homologous H1N1 and heterologous H1N1 and H1N2 viruses in mice[J]. Vaccine, 2016, 34(33): 3757-3763.

【責任編輯 莊 延】

Analysis of genetic information in HA genes and antigen specificities of three strains of H1N1 swine influenza virus

QIN Feng1?, CAI Mengkai1?, ZHANG Weidong2, ZHANG Jing3, FANG Bo1, HUANG Junming1, BU Dexin1,
LUO Yongfeng1, MA Jun1, FU Xinliang1, CAO Zhenpeng1, ZHANG Guihong1
(1 Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong Province/National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry/College of Veterinary, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2 Hospital of South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 3 Animal Health Supervision of Fushan District, Yantai 261400, China)

【Objective】 To study the genetic information in HA genes and antigen specificities of SWSS1, SWL6 and Pdm091057 strains which respectively belongs to Eurasian avaian-like, classical and Pdm09H1N1 branches of H1N1 swine influenza viruses (SIV), and provide a basis for functional study on antigenic epitopes of HA gene as well asprevention and control of influenza virus.【Method】We compared the genetic information in HA gene fragments of three H1N1 subtypes, SWSS1, SWL6 and Pdm091057. Inactivated SIV vaccines were prepared and each type of vaccine was used to immune three New Zealand white rabbit. The hemagglutination inhibition (HI) reaction was used to detect antibody titers. 【Result】 The amino acid sequences of HA gene fragments had 69.4%–89.1% similarities among three SIV strains. There were variations in antigenic epitopes of HA genes of the three strains. The average HI antibody titers were all above 1 280 for three strains after the second immunization, and the average HI antibody titer for SWSS1 reached 2 560. SWSS1 had no serological cross reaction with SWL6 or Pdm091057 strain, while SWL6 and Pdm091057 strains had low degree of serological cross reaction. 【Conclusion】Three SIV strains have differences in antigenic epitopes of HA gene, which may be the reason for the low degree of serological cross reaction among strains. All three strains have good immunogenicity, and can be used as candidate vaccine strains.

swine influence virus; H1N1; genetic information; antigenic epitope; hemagglutination inhibition; antibody titer; HA gene

S852.65

A

1001-411X(2017)05-0013-06

秦鋒, 蔡孟楷, 張偉東, 等. 3株H1N1亞型豬流感病毒的HA基因遺傳信息及抗原特異性分析[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報, 2017, 38(5): 13-18.

2016-10-19 優(yōu)先出版時間：2017-07-14

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170714.0855.006.html

秦 鋒(1989—)，男，碩士研究生，E-mail: 987031750@qq.com；蔡孟楷(1991—)，男，碩士研究生，E-mail: 1163034288@qq.com；?對本文貢獻相同； 通信作者： 張桂紅(1968—)，女，教授，博士，E-mail: guihongzh@scau.edu.cn

國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0500707)；國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS-36)；廣東省科技計劃(2013B020202002)；廣東省條財處項目(2012B060400015)；廣東省高等學校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃(YQ201530)