李 納，張麗陽(yáng)，刁 雪，閉賢鳳，劉承蘭

(天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省生物農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

3種三唑類殺菌劑對(duì)映體對(duì)鐮刀菌的選擇性活性

李 納，張麗陽(yáng)，刁 雪，閉賢鳳，劉承蘭

(天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省生物農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

【目的】研究3種三唑類殺菌劑對(duì)映體對(duì)3種鐮刀菌Fusarium spp.的殺菌活性。 【方法】采用生長(zhǎng)速率法，測(cè)定戊唑醇、腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑各對(duì)映體對(duì)串珠鐮刀菌F. moniliforme、再育鐮刀菌F. proliferatum和禾谷鐮刀菌F. graminearum的殺菌活性，并分析各對(duì)映體EC50值。 【結(jié)果】3種三唑類手性殺菌劑對(duì)映體對(duì)供試串珠鐮刀菌、再育鐮刀菌和禾谷鐮刀菌菌株的殺菌活性存在差異，(–)–戊唑醇＞(+)–戊唑醇，二者殺菌活性相差32～208倍；(+)–腈菌唑＞(–)–腈菌唑，二者殺菌活性相差1.4～6.4倍；在苯醚甲環(huán)唑?qū)τ丑w之間，(2R,4R)–苯醚甲環(huán)唑活性最高，4個(gè)對(duì)映體之間的殺菌活性相差3.7～15.5倍。 【結(jié)論】3種三唑類手性殺菌劑對(duì)映體對(duì)串珠鐮刀菌、再育鐮刀菌和禾谷鐮刀菌的殺菌活性均表現(xiàn)出選擇性差異，(–)–戊唑醇、(+)–腈菌唑和(2R,4R)–苯醚甲環(huán)唑表現(xiàn)出較高的殺菌活性。本研究結(jié)果可為篩選活性高的殺菌劑、減少農(nóng)藥使用提供理論參考。

手性農(nóng)藥；三唑類殺菌劑；對(duì)映體；鐮刀菌；殺菌活性；立體選擇性

Key words:chiral pesticide; triazole fungicide; enantiomer; Fusarium spp.; fungicidal activity; enantioselective

水稻、玉米和小麥?zhǔn)俏覈?guó)三大主要糧食作物，產(chǎn)量占我國(guó)糧食總量的90%以上[1]。鐮刀菌屬Fusarium spp. 是農(nóng)作物最重要的病原真菌之一，嚴(yán)重影響谷類作物生長(zhǎng)及糧食產(chǎn)量[2]。史曉榕等[3]研究表明，串珠鐮刀菌F. moniliforme是作物穗粒腐病的主要病原菌，占所有分離群落的50%～83%；侯恩慶等[4]對(duì)水稻穗腐病原菌進(jìn)行分離與鑒定發(fā)現(xiàn)，63.4%是再育鐮刀菌F. proliferatum；我國(guó)小麥赤霉病病原菌中禾谷鐮刀菌F. graminearum高達(dá)94. 5%[5]。同時(shí)，上述3種病原鐮刀菌可產(chǎn)生多種真菌毒素。串珠鐮刀菌和再育鐮刀菌可產(chǎn)生伏馬菌素，伏馬菌素可以引起人畜急性中毒和慢性毒性，如馬腦白質(zhì)軟化綜合征、豬肺水腫和羊肝腎病變等，也可能與人類食管癌有關(guān)[6]。而小麥赤霉病致病菌禾谷鐮刀菌可產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON，又稱嘔吐毒素)[7]。研究表明，嘔吐毒素能引起豬食欲減退或廢絕、嘔吐、體質(zhì)量下降、流產(chǎn)、死胎和弱仔，抑制免疫機(jī)能和降低機(jī)體抵抗力[8]?？梢?，農(nóng)作物中鐮刀菌病害的防治具有重要意義。

三唑類殺菌劑是目前應(yīng)用范圍廣、防治效果好、使用量最大的一類殺菌劑，對(duì)多種作物病原菌具有良好的防治效果，可用于對(duì)擔(dān)子菌、子囊菌及半知菌三大菌綱真菌引起的多種病害的防治[9]。目前，三唑類殺菌劑也已廣泛用于作物中鐮刀菌病原菌的防治。同時(shí)，大多數(shù)三唑類殺菌劑是手性農(nóng)藥，分子中一般均有1～2個(gè)手性中心，存在2或4個(gè)對(duì)映異構(gòu)體。研究表明，手性農(nóng)藥各對(duì)映體對(duì)靶標(biāo)生物的生物活性、非靶標(biāo)生物的毒性及在動(dòng)植物體和環(huán)境中的降解行為都存在很大差異[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，某些三唑類手性殺菌劑對(duì)映體對(duì)多種病原菌如立枯絲核菌Rhizoctonia solani、番茄早疫病菌Alternaria solani、番茄葉霉病菌Cladosporium fulvum、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae、玉蜀黍赤霉菌Gibberella zeae等表現(xiàn)出明顯的活性差異[12]。三唑類手性殺菌劑對(duì)映體對(duì)串珠鐮刀菌、再育鐮刀菌和禾谷鐮刀菌這3種產(chǎn)毒性病原鐮刀菌的活性研究鮮見報(bào)道。本研究選取戊唑醇、腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑3種三唑類手性殺菌劑為供試藥劑，測(cè)定其外消旋體和各對(duì)映體對(duì)上述3種產(chǎn)毒性病原鐮刀菌的生物活性，以期篩選出高效的對(duì)映體，減少農(nóng)藥的使用量和環(huán)境污染。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藥劑：戊唑醇外消旋體、腈菌唑外消旋體、苯醚甲環(huán)唑外消旋體和各對(duì)映體(+)–戊唑醇、(–)–戊唑醇、(+)–腈菌唑、(–)–腈菌唑、(2S,4S)–苯醚甲環(huán)唑、(2S,4R)–苯醚甲環(huán)唑、(2R,4S)–苯醚甲環(huán)唑、(2R,4R)–苯醚甲環(huán)唑，均購(gòu)自于上海勤路生物技術(shù)有限公司，w為98%。所有藥劑均用丙酮配制成質(zhì)量濃度為5 000 μg·mL–1的母液，4 ℃條件下保存?zhèn)溆?，用無(wú)菌水稀釋成不同質(zhì)量濃度的工作液使用。

供試菌株：串珠鐮刀菌菌株(KU554607.1)和再育鐮刀菌菌株(AF291057.1)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離自蘆筍植株上并進(jìn)行病原菌分離，得到的菌株經(jīng)過(guò)純化，再進(jìn)行單孢分離，最后進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定各選取1株作為本試驗(yàn)的供試菌株；禾谷鐮刀菌菌株(KK082465.1)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)周明國(guó)教授惠贈(zèng)。

GXZ型智能光照培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、無(wú)菌水1 L)。

1.2 不同對(duì)映體對(duì)供試菌株的毒力測(cè)定

采用慕立義[13]的菌絲生長(zhǎng)速率法。供試三唑類殺菌劑外消旋體和各對(duì)映體用無(wú)菌水配置成7個(gè)質(zhì)量濃度梯度，添加到50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，充分震蕩混勻，然后倒入90 mm培養(yǎng)皿中制成含藥平板，各藥劑的質(zhì)量濃度梯度(0～500 mg·L–1)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定預(yù)試驗(yàn)以加入丙酮的培養(yǎng)基做空白對(duì)照，試驗(yàn)表明丙酮對(duì)菌絲生長(zhǎng)無(wú)影響。以加入等體積無(wú)菌水的培養(yǎng)基做空白對(duì)照，每個(gè)濃度3次重復(fù)。首先將供試菌株接到PDA平板上，25℃培養(yǎng)4 d，再用直徑為4 mm的打孔器在菌落邊緣打孔，將菌餅朝下轉(zhuǎn)接到含藥PDA平板中央；將接菌后的平板置于 25 ℃下倒置培養(yǎng)一定時(shí)間(串珠鐮刀菌培養(yǎng)6 d，再育鐮刀菌培養(yǎng)4 d，禾谷鐮刀菌培養(yǎng)3 d)后，測(cè)量菌落生長(zhǎng)量。

采用十字交叉法測(cè)定菌落生長(zhǎng)直徑[5]，求出平均值，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率：

抑制率=[(對(duì)照菌落直徑?處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件計(jì)算毒力回歸方程、EC50值及 95% 置信限。以藥劑濃度對(duì)數(shù)為X軸，菌絲生長(zhǎng)抑制率的概率為Y軸，得到毒力回歸方程

計(jì)算出各藥劑抑制菌落的EC50值和相關(guān)系數(shù)(r)。

2 結(jié)果與分析

2.1 戊唑醇對(duì)映體對(duì)鐮刀菌的殺菌活性

戊唑醇對(duì)映體對(duì)3種鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果存在明顯差異(表1)。從表1可以看出，(–)–戊唑醇對(duì)3株鐮刀菌菌株的殺菌活性最高，對(duì)串珠鐮刀菌菌株(KU554607.1)、再育鐮刀菌菌株(AF291057.1)和禾谷鐮刀菌菌株(KK082465.1)的EC50值分別為0.015、0.131和 0.311 μg·mL–1；(+)–戊唑醇對(duì)3種供試鐮刀菌菌株的EC50值分別為3.147、4.223和11.128 μg·mL–1。(–)–戊唑醇的殺菌活性明顯高于(+)–戊唑醇，二者對(duì)3種鐮刀菌菌株的殺菌活性相差32～208倍。戊唑醇外消體對(duì)3種鐮刀菌菌株的殺菌活性介于(+)–戊唑醇和(–)–戊唑醇之間，EC50值分別為0.041、0.259和0.577 μg·mL–1。

表1 戊唑醇對(duì)映體對(duì) 3 種供試鐮刀菌的毒力測(cè)定結(jié)果Tab. 1 Toxicity of tebueonazole and its enantiomers against Fusarium spp.

2.2 腈菌唑?qū)τ丑w對(duì)鐮刀菌的殺菌活性

腈菌唑外消旋體及2個(gè)對(duì)映體對(duì)3種鐮刀菌的殺菌活性見表2。從表2可以看出，(+)–腈菌唑?qū)?種鐮刀菌的殺菌活性均小于(–)–腈菌唑，(–)–腈菌唑與(+)–腈菌唑之間的毒力相差1.4～6.4倍；(+)–腈菌唑?qū)Υ殓牭毒?KU554607.1)、再育鐮刀菌菌株(AF291057.1)和禾谷鐮刀菌菌株(KK082465.1)的EC50值分別為0.425、1.703和0.560 μg·mL–1；而(–)–腈菌唑?qū)?種鐮刀菌的EC50值分別為0.578、10.902和2.204 μg·mL–1。腈菌唑外消旋體對(duì)3種供試鐮刀菌的EC50值介于(–)–腈菌唑和(+)–腈菌唑之間，EC50值分別為0.426、3.376和0.683 μg·mL–1。

表2 腈菌唑?qū)τ丑w對(duì) 3 種供試鐮刀菌的毒力測(cè)定結(jié)果Tab. 2 Toxicity of myclobutanil and its enantiomers against Fusarium spp.

2.3 苯醚甲環(huán)唑?qū)τ丑w對(duì)鐮刀菌的殺菌活性

苯醚甲環(huán)唑外消旋體和4個(gè)對(duì)映體對(duì)鐮刀菌菌株的活性見表3。從表3可知，在4個(gè)對(duì)映體中，(2R,4R)–苯醚甲環(huán)唑?qū)?種鐮刀菌的殺菌活性最高，EC50值分別為0.242、0.217和0.555 μg·mL–1；(2S,4R)–苯醚甲環(huán)唑和(2R,4S)–苯醚甲環(huán)唑?qū)?種鐮刀菌的活性相差不大，EC50值在0.355～1.535 μg·mL–1之間；(2S,4S)–苯醚甲環(huán)唑?qū)?種供試鐮刀菌的殺菌活性最小，EC50值分別為3.020、3.376和 2.026 μg·mL–1。苯醚甲環(huán)唑4個(gè)對(duì)映體對(duì)3種鐮刀菌的殺菌活性相差3.7～15.5倍。

表3 苯醚甲環(huán)唑?qū)τ丑w對(duì) 3 種供試鐮刀菌的毒力測(cè)定結(jié)果Tab. 3 Toxicity of difenaconazole and its enantiomers against Fusarium spp.

3 討論與結(jié)論

三唑類殺菌劑作為目前應(yīng)用范圍最廣、使用量最大的一類殺菌劑，已用于多種作物病原菌的防治。三唑類殺菌劑對(duì)小麥的多種病害，如銹病、白粉病、紋枯病、全蝕病、根腐病以及黑穗病等均有良好的防治效果[14]。本研究表明，三唑類殺菌劑戊唑醇、腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ殓牭毒⒃儆牭毒秃坦如牭毒@3種重要作物病原鐮刀菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性，戊唑醇對(duì)3種病原鐮刀菌的EC50值分別達(dá)0.041、0.259和 0.577 μg·mL–1；腈菌唑?qū)?種病原鐮刀菌的EC50值為0.426、3.376和 0.683 μg·mL–1；苯醚甲環(huán)唑?qū)?種病原鐮刀菌的EC50值為0.805、0.701和 0.704 μg·mL–1。表明這3種三唑類殺菌劑具有防治鐮刀菌病害的潛力，但需要做進(jìn)一步的室內(nèi)和田間研究?？偟膩?lái)說(shuō)，戊唑醇對(duì)于3種病原鐮刀菌的殺菌活性高于另外2種三唑類殺菌劑腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑。這與張勇等[15]曾報(bào)道室內(nèi)離體條件下戊唑醇對(duì)小麥赤霉病菌的殺菌活性高于腈菌唑的結(jié)果一致。

大多數(shù)三唑類殺菌劑是手性農(nóng)藥，分子中均有1個(gè)或多個(gè)手性中心。研究表明，手性農(nóng)藥對(duì)映體之間對(duì)靶標(biāo)生物的活性表現(xiàn)出立體選擇性差異[16]。本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法，分別測(cè)定了戊唑醇、腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑3個(gè)手性殺菌劑對(duì)映體對(duì)3種鐮刀菌的殺菌活性，結(jié)果表明，對(duì)映體間存在立體選擇性差異，其差異大小與殺菌劑種類和靶標(biāo)生物有關(guān)。在戊唑醇的2個(gè)對(duì)映體之間，(–)–戊唑醇的殺菌活性遠(yuǎn)高于(+)–戊唑醇，對(duì)串珠鐮刀菌、再育鐮刀菌和禾谷鐮刀菌的殺菌活性相差分別達(dá)208、32和35倍，表現(xiàn)出明顯的立體選擇性差異，同時(shí)其差異大小與目標(biāo)菌株也相關(guān)。同樣，腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑各對(duì)映體間也表現(xiàn)出選擇性差異，對(duì)3種菌株的殺菌活性差異分別為1.4～6.4和3.7～15.5倍。有研究報(bào)道，在手性殺菌劑對(duì)映體間，往往一個(gè)對(duì)映體具有強(qiáng)的活性，而另一個(gè)對(duì)映體活性卻很低。Dong等[12]報(bào)道，2R,4S–苯醚甲環(huán)唑?qū)移咸焰呔幕钚愿哂?S,4S–苯醚甲環(huán)唑，二者相差24.2倍；Han等[17]研究發(fā)現(xiàn)，(–)–已唑醇對(duì)褐腐病菌、芒果炭疽病菌和鏈格孢菌等的活性遠(yuǎn)高于(+)–已唑醇；Stehmann等[18]研究結(jié)果表明，(–)–戊唑醇的生物活性比(+)–戊唑醇高出100多倍；Sun等[19]報(bào)道，(+)–腈菌唑?qū)Ψ淹硪卟【⒑职卟【头讶~霉病菌的活性高于(–)–腈菌唑，二者相差1.79～1.90倍。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致，手性農(nóng)藥對(duì)映體對(duì)靶標(biāo)生物的活性存在立體選擇性差異，其原因或許在于結(jié)合了結(jié)構(gòu)敏感生物受體或有天然存在的手性生物分子。今后將進(jìn)一步開展室內(nèi)生物測(cè)定和田間試驗(yàn)，為篩選高活性殺菌劑單體，減少農(nóng)藥使用和保護(hù)環(huán)境提供參考。

[1]趙倩倩. 中國(guó)主要糧食作物農(nóng)藥使用現(xiàn)狀及問(wèn)題研究[D]. 北京: 北京理工大學(xué), 2015.

[2]林鎮(zhèn)躍, 闕友雄, 劉平武, 等. 植物致病鐮刀菌的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)甜菜, 2014(1): 58-64.

[3]史曉榕, 白麗. 不同類型玉米群體穗粒腐病病原菌的調(diào)查研究[J]. 植物保護(hù), 1992, 18(5): 28-29.

[4]侯恩慶. 水稻穗腐病鐮刀菌及相關(guān)毒素研究[D]. 南寧: 廣西大學(xué), 2013.

[5]全國(guó)小麥赤霉病研究協(xié)作組. 我國(guó)小麥赤霉病穗部鐮刀菌種類、分布及致病性[J]. 上海師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 1984(3): 69-82.

[6]王少康. 伏馬菌素污染情況及其毒性研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué), 2003, 20(2): 129-131.

[7]史建榮, 劉馨, 仇劍波, 等. 小麥中鐮刀菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染現(xiàn)狀與防控研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(18): 3641-3654.

[8]SWAMY H V L N, SMITH T K, MACDONALD E J, et al. Effects of feeding a blend of grains naturally contaminated with Fusarium mycotoxins on swine performance, brain regional neurochemistry, and serum chemistry and the efficacy of a polymeric glucomannan mycotoxin adsorbent[J]. J Anim Sci, 2002, 80(12): 3257-3267.

[9]周子燕, 李昌春, 高同春, 等. 三唑類殺菌劑的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(27): 11842-11844.

[10]李遠(yuǎn)播. 幾種典型手性三唑類殺菌劑對(duì)映體的分析、環(huán)境行為及其生物毒性研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2013.

[11]孫明婧. 四種三唑類手性農(nóng)藥的環(huán)境行為研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[12]DONG F, LI J, CHANKVETADZE B, et al. Chiral triazole fungicide difenoconazole: Absolute stereochemistry, stereoselective bioactivity, aquatic toxicity, and environmental behavior in vegetables and soil[J]. Environ Sci Technol, 2013, 47(7): 3386-3394.

[13]慕立義. 植物化學(xué)保護(hù)研究方法[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1994: 76-81.

[14]劉傳德, 王培松, 王繼秋, 等. 三唑類殺菌劑及其在小麥病害防治中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2005, 36(1): 157-160.

[15]張勇, 馬嚴(yán)明, 徐勁鋒, 等. 幾種三唑類殺菌劑對(duì)小麥赤霉病菌毒力的測(cè)定及藥效試驗(yàn)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 32(2): 248-249.

[16]李晶. 三唑類手性殺菌劑苯醚甲環(huán)唑的立體選擇性生物活性與環(huán)境行為研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2012.

[17]HAN J, JIANG J, SU H, et al. Bioactivity, toxicity and dissipation of hexaconazole enantiomers[J]. Chemosphere, 2013, 93(10): 2523-2527.

[18]STEHMANN C, DE WAARD M A. Relationship between chemical structure and biological activity of triazole fungicides against Botrytis cinerea[J]. Pest Manag Sci, 1995, 44(2): 183-195.

[19]SUN M, LIU D, QIU X, et al. Acute toxicity, bioactivity, and enantioselective behavior with tissue distribution in rabbits of myclobutanil enantiomers[J]. Chirality, 2014, 26(12): 784-789.

【責(zé)任編輯 周志紅】

Selective bioactivity of enantiomers of three triazole fungicides against Fusarium spp.

LI Na, ZHANG Liyang, DIAO Xue, BI Xianfeng, LIU Chenglan
(Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology, Ministry of Education/Key Laboratory of Bio-pesticide Innovation and Application of Guangdong Province/College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

【Objective】To study the activities of enantiomers of three triazole fungicides against Fusarium spp..【Method】Three chiral fungicides included tebuconazole, myclobutanil and difenoconazole. The activities of fungicide enantiomers against F. moniliforme, F. proliferatum and F. graminearum were assessed by mycelial growth rate method, respectively. The EC50values of enantiomers were analyzed. 【Result】The activities of different enantiomers against three kinds of Fusarium spp. were different. The activity of (–)-tebuconazole was higher than (+)-tebuconazole, and the EC50difference of two enantiomers was 32–208 times. The inhibitory activity of (+)-myclobutanil was higher than (–)-myclobutanil, and the EC50difference of two enantiomers was 1.4–6.4 times. (2R,4R)-difenoconazole showed the maximum activity among four enantiomers of difenoconazole, and the EC50difference of four enantiomers was 3.7–15.5 times. 【Conclusion】For Fusarium spp., the activities of three fungicides show selective difference. (–)-tebuconazole, (+)-myclobutanil and (2R,4R)-difenoconazole show higher activities. These results might contribute to screening higher active fungicides and reducing the use of pesticides.

S511；S502

A

1001-411X(2017)05-0056-05

李納, 張麗陽(yáng), 刁雪, 等. 3種三唑類殺菌劑對(duì)映體對(duì)鐮刀菌的選擇性活性[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 38(5): 56-60.

2016-10-01 優(yōu)先出版時(shí)間：2017-07-14

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170714.0856.020.html

李 納(1992—)，女，碩士研究生，E-mail: 1272807635@qq.com； 通信作者： 劉承蘭(1976—)，男，副教授，博士，E-mail: liuchenglan@scau.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(31371959)