徐麗梅,許鵬程,張崇淼,王曉昌(西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710055)

紫外線消毒對(duì)大腸桿菌的損傷及復(fù)蘇的研究

徐麗梅,許鵬程,張崇淼*,王曉昌**(西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710055)

調(diào)查了紫外線消毒后大腸桿菌的光復(fù)活和暗修復(fù)能力,分析了紫外線消毒對(duì)細(xì)胞膜、三磷酸腺苷以及核酸(DNA、RNA)的損傷,結(jié)合recA的SOS損傷修復(fù)機(jī)制,闡述大腸桿菌對(duì)紫外線的響應(yīng)機(jī)制.結(jié)果表明:20mJ/cm2紫外線劑量下,大腸桿菌去除率為5.63-log,且經(jīng)光復(fù)活和暗修復(fù)24h后,光復(fù)活和暗修復(fù)百分比分別達(dá)到0.018%和0.00042%,光復(fù)活能力明顯大于暗修復(fù)能力.紫外線消毒過(guò)程DNA的損傷取決于片段長(zhǎng)度,長(zhǎng)片段16s rRNA的基因損傷更明顯,水處理常規(guī)的紫外線消毒劑量對(duì)總ATP含量和膜的完整性影響較小,為紫外線消毒過(guò)程的復(fù)蘇提供了基本保障.然而紫外線消毒對(duì)大腸桿菌的RNA損傷較嚴(yán)重,紫外劑量達(dá)到50mJ/cm2時(shí),大腸桿菌失去了SOS損傷修復(fù)的能力,因此培養(yǎng)法檢測(cè)80mJ/cm2時(shí)大腸桿菌的復(fù)蘇能力極弱,recA相關(guān)的RNA的消失可用于指示微生物發(fā)生了不可逆損傷.

紫外線；復(fù)蘇；膜完整性；三磷酸腺苷；DNA；RNA

消毒過(guò)程作為水處理過(guò)程中的最后的一道壁壘,主要用于殺滅病原微生物保障水質(zhì)的安全.紫外線消毒由于其能高效的滅活細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物以及消毒副產(chǎn)物量少等優(yōu)勢(shì)[1-3],在污水、再生水、飲用水處理過(guò)程中已得到廣泛應(yīng)用.但是紫外線消毒不能提供持久性消毒效果,在長(zhǎng)期的儲(chǔ)存和可見(jiàn)光的照射下,微生物能通過(guò)自身?yè)p傷修復(fù)機(jī)制發(fā)生復(fù)蘇現(xiàn)象,使水質(zhì)指標(biāo)無(wú)法達(dá)到使用和回用標(biāo)準(zhǔn),產(chǎn)生安全健康風(fēng)險(xiǎn)[4-6].目前,已被證實(shí)存在復(fù)蘇現(xiàn)象的微生物種類繁多,主要包括:細(xì)菌(例如:大腸埃希氏菌、糞鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、鏈霉菌屬等)、真菌(青霉菌屬、酵母屬)、原生動(dòng)物(隱孢子蟲(chóng)、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng))[4-9].大腸桿菌作為糞便污染的指示菌,已成為水處理檢測(cè)中一項(xiàng)重要的衛(wèi)生學(xué)指標(biāo),用于指示水傳播疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的可能性[10-11].因此了解紫外線消毒過(guò)程中大腸桿菌的復(fù)蘇現(xiàn)象,對(duì)于保證出水水質(zhì)安全具有重要的意義.

研究報(bào)道,紫外線消毒對(duì)微生物損傷的作用位點(diǎn)在核酸上,其主要以紫外線消毒過(guò)程細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)紫外光的吸收為依據(jù),即紫外線很容易被微生物的DNA所吸收發(fā)生光化學(xué)反應(yīng),形成嘧啶二聚體和6-4光產(chǎn)物,因此紫外線消毒主要是破壞微生物的核酸[12-13].目前對(duì)于紫外線消毒的大多數(shù)研究仍停留在宏觀的以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的研究,其缺點(diǎn)是培養(yǎng)法無(wú)法用于檢測(cè)亞致死的或處于活的但不可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)菌存在,而對(duì)微觀的分子水平損傷的研究仍較少.有研究表明由于 RNA在非活性菌中能迅速被降解,RNA的存在能更好反應(yīng)微生物的活性[14],其中recA基因是重要的SOS損傷修復(fù)機(jī)制[15-16],因此recA相關(guān)的RNA的消失可能用于指示微生物的完全失活.

本文以糞便污染指示菌—大腸桿菌為研究對(duì)象,分析了紫外線消毒過(guò)程中大腸桿菌的滅活、光復(fù)活和暗修復(fù)現(xiàn)象,并借助流式細(xì)胞儀技術(shù)、熒光發(fā)光檢測(cè)儀和PCR技術(shù),進(jìn)一步分析了紫外線消毒對(duì)細(xì)胞膜、三磷酸腺苷以及DNA、RNA的損傷,結(jié)合recA的SOS損傷修復(fù)機(jī)制,闡述大腸桿菌對(duì)紫外線壓力的響應(yīng)機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 微生物

美國(guó)菌種保藏中心購(gòu)買的大腸桿菌 E. coli (ATCC 25922),接種于液體LB培養(yǎng)基中,37℃搖床中200rpm培養(yǎng)12～16h, 1000g離心10min,得到細(xì)胞懸濁液,用磷酸緩沖液(PBS, pH=7.2)沖洗2次,進(jìn)行10倍稀釋得到不同濃度的E. coli菌液,作為后續(xù)指示性細(xì)菌.

1.2 紫外線消毒

向直徑為 90mm的培養(yǎng)皿中加入接種大腸桿菌的40mL PBS水樣,大腸桿菌的起始濃度約為106CFU/mL,把培養(yǎng)皿放到準(zhǔn)平行光紫外線照射器的紫外燈下,培養(yǎng)皿下置磁力攪拌器,輕輕攪拌水樣,通過(guò)調(diào)節(jié)紫外線照射時(shí)間達(dá)到不同的紫外線輻射劑量,輻射一定時(shí)間后將水樣取出,4℃保存,用于后續(xù)分析.每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,試驗(yàn)所用紫外燈的功率為 15W(波長(zhǎng) 254nm),試驗(yàn)中紫外線強(qiáng)度為 0.10mW/cm2,紫外線輻射劑量(mJ/cm2)=紫外線強(qiáng)度(mW/cm2)×輻射時(shí)間(s).

1.3 復(fù)蘇過(guò)程

1.3.1 光復(fù)活過(guò)程 采用15W的日光燈研究紫外線照射后菌株的光復(fù)活情況.提前開(kāi)啟日光燈預(yù)熱 20min,將經(jīng)紫外線照射的水樣轉(zhuǎn)移至日光燈下 20cm,采用磁力攪拌子輕輕攪拌水樣,延長(zhǎng)光照時(shí)間分別為0、2、4、6、8、12、16、20、24h,測(cè)定不同光復(fù)活時(shí)間后大腸桿菌的濃度.

1.3.2 暗修復(fù)過(guò)程 經(jīng)紫外線照射后的水樣進(jìn)行避光保存,采用磁力攪拌子輕輕攪拌水樣,使暗處理時(shí)間分別為0、2、4、8、24h,檢測(cè)不同暗處理時(shí)間后大腸桿菌的濃度.

1.4 細(xì)菌計(jì)數(shù)過(guò)程

試驗(yàn)過(guò)程采用膜過(guò)濾平板計(jì)數(shù)方法分析大腸桿菌的濃度,5mL水樣經(jīng)10倍系列稀釋后,采用直徑 50mm孔徑 0.22μm的混合纖維膜過(guò)濾,置于m-FC培養(yǎng)基上,于37℃培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)分析.

1.5 損傷機(jī)制研究

1.5.1 流式細(xì)胞儀分析膜的完整性 結(jié)合使用PI和SYBR Green I來(lái)表征紫外線消毒過(guò)程中細(xì)菌的膜的完整性損傷,將10μL的SYBR GreenⅠ加入1mL的二甲基亞砜中制成SYBR GreenⅠ儲(chǔ)備液后,將PI(30mM)和SYBR GreenⅠ儲(chǔ)備液以1:100的比例混合,避光于-20℃保存.將經(jīng)紫外線照射后的PBS水樣進(jìn)行10倍稀釋使細(xì)菌總濃度達(dá)到 103～104cells/mL,取 0.5mL的樣品加入5μL的染料,于30℃避光染色15min后,采用BD Accuri C6?流式細(xì)胞儀(BD Accuri cytometers,美國(guó))進(jìn)行樣品分析,測(cè)定0.5mL樣品中的30μL細(xì)菌狀態(tài),流式細(xì)胞儀光源為488nm氣冷氬離子激光,其中經(jīng)SYBR Green I(綠色熒光)染色的大腸桿菌通過(guò)FL1通道,而經(jīng)PI(紅色染料)染色的受損的大腸桿菌通過(guò)FL3通道.

1.5.2 三磷酸腺苷(ATP)的檢測(cè) 采用發(fā)光檢測(cè)儀(LB 962CentroLIA/PC,德國(guó))分析消毒過(guò)程中ATP的含量,實(shí)驗(yàn)所用試劑為BacTiter-GloTM(Promega,美國(guó)),將 100μL樣品加入不透明多孔板中,加入等體積的BacTiter-GloTM試劑,在定軌振蕩器上振蕩混勻 1min后,測(cè)定熒光強(qiáng)度.采用ATP粉末(Sigma, A2383)配置不同濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)品,建立ATP與熒光強(qiáng)度的標(biāo)線,通過(guò)測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度推算樣品中總ATP的含量.

1.5.3 DNA、RNA的損傷 大腸桿菌水樣經(jīng)14000r/min 4℃離心 20min,棄上清液,收集菌體,參照細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司,DP2001)說(shuō)明提取總DNA,作為DNA損傷分析的模板.參照細(xì)菌RNA提取試劑盒(Omega, R6950-01,美國(guó))說(shuō)明提取細(xì)菌總RNA,并參照 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara, DRR047A) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn),得到cDNA作為后續(xù)RNA損傷分析的模板.

為了確定消毒過(guò)程中核酸的損傷程度,分別采用通用引物U968:AACGCGAAGAACCTTAC和 L1401:GCGTGTGTACAAGACCC分析 16s rRNA 的 434bp片段損傷,以及引物 27f: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和 1492r: GGTTACCTTGTTACGACTT分析16s rRNA的1450bp 片段損傷.實(shí)驗(yàn)采用引物 recA-f: GTTGGACTGCTTCAGGTTAC 和 recA-r: AGGTAAAACCTGTGCGTTTA分析SOS損傷修復(fù)機(jī)制相關(guān)的RNA的損傷.PCR反應(yīng)體系:2μL DNA或 cDNA,0.25μL的 Ex Taq (Takara,中國(guó)),2.5μL 的 10×Ex Taq Buffer, 2μL dNTP Mixture, 400nM 的上游和下游引物,加去離子水使總體系達(dá)到25μL.反應(yīng)程序?yàn)?起始95℃ 5min 95℃ 30s,不同退火溫度(引物U968/L1401: 58℃,引物 27f/1492r:54℃,引物 recA-f/recA-r: 60℃) 30s,72℃延伸1min,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸4min.PCR產(chǎn)物采用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)DuRed核酸染料染色后,利用凝膠成像儀對(duì)擴(kuò)增;結(jié)果進(jìn)行分析.

1.6 數(shù)據(jù)分析

紫外線消毒過(guò)程,大腸桿菌的去除率按下式計(jì)算

利用復(fù)活百分比來(lái)衡量已被紫外線殺滅的大腸桿菌中,復(fù)活的大腸桿菌所占的比例,公式如下

式中:N0為紫外線照射前水樣中的大腸桿菌數(shù)量, CFU/mL; N為紫外線照射后水樣中的大腸桿菌數(shù)量, CFU/mL); NP為光復(fù)活或暗修復(fù)后水樣中的大腸桿菌數(shù)量, CFU/mL.

2 結(jié)果

2.1 紫外線消毒對(duì)大腸桿菌的滅活

紫外線消毒對(duì)大腸桿菌的滅活如圖 1所示.隨紫外劑量的增加,大腸桿菌迅速被滅活,當(dāng)紫外劑量達(dá)到水處理常用的20mJ/cm2,大腸桿菌的平均去除率達(dá)到了 5.63-log.隨紫外劑量增加,紫外線對(duì)大腸桿菌的滅活進(jìn)入拖尾階段,拖尾主要是由于微生物表面性質(zhì)發(fā)生變化產(chǎn)生的自我聚集現(xiàn)象引起的[17].當(dāng)達(dá)到歐盟飲用水處理標(biāo)準(zhǔn)[18]的40mJ/cm2以及美國(guó)環(huán)保署規(guī)定的中水回用技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[19]的 80mJ/cm2時(shí),大腸桿菌的平均去除率分別達(dá)到6.2-log和6.25-log,幾乎完全被滅活.

圖1 紫外線消毒對(duì)大腸桿菌的滅活Fig.1 Inactivation of E. coli under UV disinfection

2.2 紫外線消毒后大腸桿菌的復(fù)蘇現(xiàn)象

消毒后的水樣在進(jìn)入下游水域,在自然光的條件下具有光復(fù)活現(xiàn)象,此外在黑暗條件下也存在一定的暗修復(fù)現(xiàn)象,因此本研究進(jìn)一步調(diào)查了紫外線消毒后大腸桿菌的復(fù)蘇現(xiàn)象,結(jié)果如圖 2所示.

圖2 紫外線消毒后E. coli的復(fù)蘇Fig.2 Reactivation of E. coli after UV disinfection

隨時(shí)間延長(zhǎng),大腸桿菌濃度明顯增加,光復(fù)活百分比(表 1)和暗修復(fù)百分比(表 2)明顯增加,然而光復(fù)活的程度明顯高于暗修復(fù)的程度,例如經(jīng)5mJ/cm2紫外線輻射后,復(fù)蘇時(shí)間長(zhǎng)達(dá) 24h,大腸桿菌的光復(fù)活達(dá)到最大值 5.06×105CFU/mL,復(fù)活百分比達(dá)到 10.5%,大腸桿菌暗修復(fù)達(dá)到最大值1.2×105CFU/mL,暗修復(fù)百分比達(dá)到了1.98%,由于日光燈為復(fù)蘇現(xiàn)象提供一定的能量,更有利于消毒后大腸桿菌的復(fù)蘇.經(jīng) 20mJ/cm2紫外線輻射后24h,大腸桿菌的復(fù)活百分比為0.018%,與郭等[20]低日光燈復(fù)活光強(qiáng)下復(fù)活 72h的 0.02%一致,但明顯低于高日光燈復(fù)活光強(qiáng) 43 μW/cm2下的光復(fù)活百分比 5.97%,因此復(fù)活光強(qiáng)作為光復(fù)活的一個(gè)重要因素具有不可忽視的作用.

表1 不同時(shí)間下E. coli的光復(fù)活百分?jǐn)?shù)(%)Table 1 Photo-reactivation percentage (%) of E. coli after different light exposure times

表2 不同時(shí)間下E. coli暗修復(fù)百分?jǐn)?shù)(%)Table 2 Dark repair percentage (%) of E. coli after different dark repair times

紫外線消毒復(fù)活的原因主要是紫外線消毒產(chǎn)生亞致死或處于活的但不可培養(yǎng)狀態(tài)的菌株的復(fù)蘇[21].隨紫外線輻射劑量的增加,光復(fù)活和暗修復(fù)百分比明顯減少,當(dāng)紫外線輻射劑量達(dá)到40和80mJ/cm2,在較短的恢復(fù)時(shí)間下(0～8h),幾乎不存在光復(fù)活現(xiàn)象,如表1所示,延長(zhǎng)光復(fù)活時(shí)間,光復(fù)活百分比仍然較低僅為 0.0037%～0.0059%.相似的高的紫外劑量下(40和80mJ/cm2),隨暗修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng),大腸桿菌的濃度基本保持不變(圖 2b),暗修復(fù)百分比僅為 0.000009%～0.0013% (表 2),因此水處理過(guò)程中使用較高的紫外劑量(40和 80mJ/cm2)有利于控制紫外線消毒后的復(fù)蘇現(xiàn)象,高紫外劑量下對(duì)大腸桿菌的損傷較嚴(yán)重,亞致死的細(xì)胞數(shù)目明顯減少.

2.3 紫外線消毒對(duì)大腸桿菌的作用機(jī)制

2.3.1 紫外線消毒對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的損傷對(duì)紫外線消毒前后大腸桿菌進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果如圖3所示.P2區(qū)代表細(xì)菌的細(xì)胞膜未受損傷(PI染色陰性),P3+P4表示細(xì)菌的細(xì)胞膜受到損傷(PI染色陽(yáng)性).未經(jīng)處理的水樣中完整細(xì)胞膜細(xì)胞的數(shù)目占總數(shù)目的 86.3%,經(jīng)95℃熱處理 15min后,采用流式細(xì)胞儀分析,有95.6%的細(xì)胞膜受到損傷,因此流式細(xì)胞儀能用來(lái)判斷細(xì)胞膜的損傷.然而紫外線消毒過(guò)程未導(dǎo)致更嚴(yán)重細(xì)胞膜的損傷,細(xì)胞膜未受損傷的細(xì)胞百分比保持在 84.3%～89%范圍,即使紫外劑量增加至300mJ/cm2仍有84.3%的細(xì)胞膜保持其完整性.因此水處理常用的紫外消毒劑量對(duì)大腸桿菌的細(xì)胞膜的損傷微乎其微.Cho和李等[22-23]采用TEM透射顯微鏡和OPNG降解分析紫外線消毒對(duì)大腸桿菌的損傷,結(jié)果表明消毒后大腸桿菌的細(xì)胞膜仍保持一定的完整性,細(xì)胞通透性略微增加,胞內(nèi)物質(zhì)出現(xiàn)一定的固縮現(xiàn)象.

圖3 采用流式細(xì)胞儀分析紫外線消毒中E. coli膜完整性Fig.3 FCM detection of the membrane integrity of E. coli during UV disinfection

2.3.2 紫外線消毒對(duì)ATP的損傷 三磷酸腺苷(ATP)是微生物代謝活動(dòng)的主要能源,因此 ATP的濃度能近似的反應(yīng)微生物的活性和新陳代謝能力[24-25].該研究進(jìn)一步探索了紫外線消毒過(guò)程對(duì)大腸桿菌總ATP含量的影響,結(jié)果如圖4所示.在低紫外劑量下(＜100mJ/cm2),紫外線對(duì)大腸桿菌ATP含量無(wú)明顯影響,有輕微的增加趨勢(shì).隨紫外線劑量進(jìn)一步增加(＞100mJ/cm2) ATP含量呈下降趨勢(shì),大腸桿菌丟失其代謝能力.

2.3.3 紫外線消毒對(duì)大腸桿菌 DNA的損傷 過(guò)去研究表明紫外線消毒主要引起微生物核酸的損傷,本研究采用分子生物學(xué)的 PCR檢測(cè)方法分析了紫外線消毒過(guò)程對(duì)大腸桿菌16s rRNA基因的損傷.從圖 5a可見(jiàn),紫外線消毒對(duì)大腸桿菌的 434bp長(zhǎng)度的核酸損傷不明顯,300mJ/cm2的紫外劑量仍有較明顯的DNA條帶.增加PCR檢測(cè)過(guò)程中16s rRNA片段長(zhǎng)度到1450bp時(shí),盡管整個(gè)檢測(cè)過(guò)程均能檢測(cè)到明顯的DNA條帶,值得注意的是隨紫外劑量的增加條帶亮度明顯減少(圖 5b),因此紫外線消毒導(dǎo)致了微生物16s rRNA的損傷,片段長(zhǎng)度越長(zhǎng)損傷越明顯,低片段長(zhǎng)度由于捕獲的DNA發(fā)生的損傷機(jī)率較低,檢測(cè)結(jié)果不明顯.Trombert等[26]研究表明 REP-PCR能在分子水平上分析紫外線消毒對(duì)微生物的滅活以及暗修復(fù)機(jī)制.我們研究表明,盡管紫外線消毒能導(dǎo)致DNA的損傷,然而當(dāng)紫外劑量達(dá)到＞80mJ/cm2時(shí),微生物完全被滅活,DNA仍有明顯的條帶,因此采用PCR檢測(cè)DNA的損傷無(wú)法判斷微生物的失活狀態(tài).

圖4 紫外線消毒對(duì)E. coli總ATP的影響Fig.4 Effect of UV disinfection on total ATP of E. coli

圖5 紫外線消毒后E. coli的DNA損傷Fig.5 DNA damage of E. coli after UV disinfection M, DL2000marker; 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300紫外劑量分別為0, 50, 100, 150, 200, 250, 300mJ/cm2

2.3.4 紫外線消毒對(duì) RNA損傷 有研究表明RNA的半衰期較短,與DNA相比RNA更能反應(yīng)細(xì)胞的活性.我們研究進(jìn)一步對(duì)紫外線消毒前后RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析,并選用SOS基因修復(fù)相關(guān)的recA引物,從分子水平分析紫外線消毒過(guò)程可能存在的修復(fù)過(guò)程.如圖 6所示,相對(duì) DNA而言,紫外線消毒對(duì) RNA的損傷更嚴(yán)重,隨紫外劑量增加,條帶亮度明顯減弱,當(dāng)紫外劑量達(dá)到污水處理廠常用的 40mJ/cm2時(shí),仍存在較弱的RNA條帶.聯(lián)系微生物的復(fù)蘇過(guò)程,隨紫外線劑量增加,暗修復(fù)能力明顯減弱,與該結(jié)果一致.盡管40mJ/cm2時(shí)光復(fù)活和暗修復(fù)百分比較低.然而PCR結(jié)果顯示40mJ/cm2仍有一定的損傷修復(fù)的能力,因此水處理過(guò)程中應(yīng)考慮加大紫外劑量(＞40mJ/cm2),或采用紫外-氯聯(lián)用的方式來(lái)抑制復(fù)蘇現(xiàn)象.紫外-氯聯(lián)用方式能提供持續(xù)性消毒效果有利于控制復(fù)蘇現(xiàn)象[27],提高消毒效果[28].當(dāng)紫外線劑量達(dá)到 50mJ/cm2時(shí),RNA擴(kuò)增條帶完全消失,失去了 SOS損傷修復(fù)能力,因此高劑量的80mJ/cm2時(shí),大腸桿菌的復(fù)蘇幾乎為零.

圖6 紫外線消毒后E. coli的RNA損傷Fig.6 RNA damage of E. coli after UV disinfection M, 100bp DNA ladder; 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50紫外劑量分別為0, 5, 10, 20, 30, 40, 50mJ/cm2; N, 空白對(duì)照

2.4 紫外線消毒損傷機(jī)制和復(fù)蘇能力的對(duì)比分析

紫外線消毒過(guò)程中對(duì)細(xì)胞膜的損傷能力微乎其微,保證了細(xì)胞的完整性,為復(fù)蘇過(guò)程提供保障;此外對(duì)總ATP含量的影響較小,微生物進(jìn)入了亞致死狀態(tài)或處于活性但非可培養(yǎng)的狀態(tài)(VBNC),微生物仍存在一定的代謝活性,為復(fù)蘇過(guò)程提供一定 ATP;盡管紫外線消毒引起一定的DNA損傷,導(dǎo)致嘧啶二聚體(CPD)和6-4光產(chǎn)物的形成,經(jīng)過(guò)相關(guān)的修復(fù)機(jī)制,能導(dǎo)致微生物的復(fù)蘇;然而隨紫外線劑量的增加,大腸桿菌的 RNA損傷越來(lái)越嚴(yán)重,與修復(fù)相關(guān)的途徑受到嚴(yán)重的破壞,高劑量下的大腸桿菌復(fù)蘇能力明顯減弱,且大腸桿菌完全被滅活,因此recA相關(guān)的RNA的消失可用于指示微生物發(fā)生了不可逆的損傷.

3 結(jié)論

3.1 80mJ/cm2紫外線劑量下,大腸桿菌的去除率6.25-log,幾乎完全被滅活. 經(jīng)20mJ/cm2紫外線輻射后 24h,大腸桿菌的復(fù)活百分比和暗修復(fù)百分比分別達(dá)到 0.018%和 0.00042%,光復(fù)活能力明顯大于暗修復(fù)能力.經(jīng)80mJ/cm2紫外線輻射后 24h,大腸桿菌的光復(fù)活和暗修復(fù)百分比明顯降低,僅為0.0059%和0.000009%.

3.2 紫外線消毒過(guò)程 DNA的降解過(guò)程取決于片段長(zhǎng)度,1450bp的 16s rRNA的基因損傷較434bp的16s rRNA的基因損傷更明顯,水處理常規(guī)的紫外線消毒劑量(＜100mJ/cm2),對(duì)總 ATP含量和細(xì)胞膜的損傷作用很小.

3.3 紫外線消毒對(duì)大腸桿菌的 RNA損傷較嚴(yán)重,紫外線劑量達(dá)到50mJ/cm2時(shí),失去了SOS損傷修復(fù)的能力,因此80mJ/cm2大腸桿菌的復(fù)蘇能力較弱,recA相關(guān)的RNA的消失可用于指示微生物發(fā)生了不可逆的損傷.

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Studies on the injury and reactivation of Escherichia coli under ultraviolet disinfection.

XU Li-mei, XU Peng-cheng, ZHANG Chong-miao*, WANG Xiao-chang**(Key Laboratory of Northwest Water Resource, Environment and Ecology, Department of Environmental and Municipal Engineering, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055, China). China Environmental Science, 2017,37(7)：2639～2645

In this study, the photoreactivation and dark repair of Escherichia coli (E. coli) was investigated. The effects of ultraviolet (UV) disinfection on membrane integrity, adenosine triphosphate (ATP) and nucleic acid (DNA, RNA) were further analyzed. The aim of our study was to explore the response pattern of E. coli to UV disinfection by combination of SOS response mechanism of recA gene. The results showed that the inactivation efficiency of E. coli reached 5.63-log at a UV dose of 20mJ/cm2. When the light exposure time and dark repair time was prolonged to 24h after a UV dose of 20mJ/cm2, the percentages of photoreactivation and dark repair observed for E. coli were 0.018% and 0.00042%, respectively. The ability of photoreactivation of E. coli was higher than that of dark repair. The DNA damage depended on the fragment length of genes during UV disinfection. The longer the 16s rRNA gene was, the more seriously damage occurred. Conventional UV doses in wastewater treatment did not affect the amount of total ATP and membrane integrity, which provided basic guarantee for the reactivation of E. coli after UV disinfection. UV disinfection caused serious damage in recA RNA. When UV dose reached 50mJ/cm2, E. coli lost the SOS response mechanism. Hence, little reactivation was observed using the culture method at a UV dose of 80mJ/cm2. The lost of recA RNA could be used as an indicator for the occurrence of the irreversible injury to microorganism.

UV；reactivation；membrane integrity；ATP；DNA；RNA

X52,X505

A

1000-6923(2017)07-2639-07

徐麗梅(1987-),女,山東威海人,博士,主要研究方向?yàn)樗胁≡⑸锏目刂?發(fā)表論文4篇.

2016-11-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51578441);陜西省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目(15JK1442);國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2013ZX07310-001);陜西省污水處理與資源化重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2013KCT-13)

* 責(zé)任作者, 教授, zhangchongmiao@163.com; ** 責(zé)任作者, 教授, xcwang@xauat.edu.cn