謝光杰，葉碧霞，左勇*，張晶

(1.四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000)

甜面醬中黑曲霉的分離及制曲條件的優(yōu)化

謝光杰1，葉碧霞2，左勇2*，張晶2

(1.四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000)

對(duì)從甜面醬中分離的黑曲霉進(jìn)行初步鑒定，采用Box-Behnken法優(yōu)化制曲條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取制曲溫度、濕度及時(shí)間為響應(yīng)因素，以成曲的糖化酶活力為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的分析試驗(yàn)，建立回歸模型，獲得最佳制曲工藝條件為：溫度31 ℃、濕度90%、時(shí)間57.5 h，在此條件下糖化酶活力達(dá)到717.42 U/g干曲。

甜面醬；黑曲霉；制曲條件；響應(yīng)面試驗(yàn)

甜面醬作為一種傳統(tǒng)釀造調(diào)味品，是以面粉為主要原料，經(jīng)蒸煮后在微生物代謝產(chǎn)生的糖化酶作用下將淀粉水解為還原糖，在蛋白酶的作用下將蛋白質(zhì)水解為小分子多肽及氨基酸[1]。因其具有特殊的滋味和體態(tài)，深受廣大消費(fèi)者青睞。

甜面醬生產(chǎn)主要經(jīng)過通風(fēng)制曲、低鹽固態(tài)發(fā)酵等階段制成[2]。制曲階段主要是通過米曲霉等微生物生長(zhǎng)繁殖代謝產(chǎn)生多種酶類，從而在拌鹽水發(fā)酵階段利用多種酶對(duì)原料進(jìn)行降解[3]。目前，甜面醬的生產(chǎn)菌種主要采用米曲霉3.042[4]，米曲霉在固態(tài)制曲時(shí)，能夠分泌較多酶系[5,6]。程會(huì)欣[7]、李保英等[8]研究多曲種混合釀制醬油中，利用米曲霉和黑曲霉共同作用可以提高原料的蛋白利用率以及醬油品質(zhì)。金華勇[9]研究了不同曲霉菌種用于甜面醬接種制曲工藝，結(jié)果表明黑曲霉制曲具有可行性。付雯等[10]研究了黑曲霉、根霉雙菌種制曲工藝，與米曲霉分別制曲后混合發(fā)酵，提高了曲料糖化酶活力。大量的研究[11-13]表明：豐富制曲菌種可以提高曲料糖化酶活力。黑曲霉作為生產(chǎn)糖化酶的主要工業(yè)菌株，具有較大的應(yīng)用潛力[14-17]，因而篩選優(yōu)良的黑曲霉糖化菌株具有現(xiàn)實(shí)意義。

本研究擬從甜面醬中分離篩選獲得黑曲霉，并對(duì)其固態(tài)制曲條件進(jìn)行優(yōu)化，其研究結(jié)果可豐富甜面醬的制曲菌種選擇，并為進(jìn)一步擴(kuò)大甜面醬的產(chǎn)業(yè)化，提高產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

甜面醬樣品：來源于四川省自貢市某食品廠。

培養(yǎng)基：分離單菌落采用PDA培養(yǎng)基；菌落形態(tài)學(xué)鑒定采用查氏培養(yǎng)基；種子液采用液體PDA培養(yǎng)基。

1.2 主要儀器

AR1140電子天平 奧豪斯公司；TW-2000W可調(diào)溫電爐 成都市永興電器廠；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HL MJ-250恒溫恒濕箱；SKY-2012C恒溫?fù)u床 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的分離與純化

無菌條件下，稱取10 g甜面醬樣品于盛有90 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，35 ℃，270 r/min條件下振蕩30 min。采用無菌水進(jìn)行梯度稀釋。選取適宜的梯度稀釋液，涂布于PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度接種3個(gè)平板，將其置于28 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行觀察，挑選培養(yǎng)基上菌落形態(tài)不同的單菌落各自進(jìn)行多次劃線分離，直至獲得純培養(yǎng)物。獲得的純化菌種同時(shí)進(jìn)行斜面保藏，保存菌種備用。

1.3.2 菌落形態(tài)特征的觀察

對(duì)所分離純化的菌株點(diǎn)樣接種于平板，培養(yǎng)后觀察菌株在固體培養(yǎng)基上的形態(tài)特征[18]。

1.3.3 霉菌的鑒定

采取插片培養(yǎng)法[19]：將無菌蓋玻片以45°左右的角度插入平板培養(yǎng)基中，插入深度為蓋玻片的1/3左右。用無菌接種環(huán)挑取霉菌孢子，劃線接種于蓋玻片與瓊脂培養(yǎng)基的交界線上。放置于28 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5天。用無菌鑷子將長(zhǎng)有菌體的蓋玻片取出，放置在干凈的載玻片上，在顯微鏡下用低倍鏡找準(zhǔn)觀察區(qū)域，再在高倍鏡下觀察霉菌形態(tài)。

1.3.4 酶活力測(cè)定方法

采用斐林試劑標(biāo)準(zhǔn)糖液反滴定法測(cè)定[20]。糖化酶活力定義：1.0 g干曲在40 ℃，pH 4.6的條件下，1 h分解可溶性淀粉生成1 mg葡萄糖，為1個(gè)酶活力單位，用U/g表示。

1.3.5 種子液制備

斜面活化的純種黑曲霉，用無菌接種環(huán)挑取1～2環(huán)孢子接入滅菌的裝有玻璃珠的PDA液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)至孢子數(shù)為107個(gè)/mL。

1.3.6 制曲工藝

面粉經(jīng)蒸煮后，按照孢子數(shù)為8×108個(gè)/g干基的接種量接入熟料中，充分拌勻后平鋪，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，依據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)，視情況翻曲1～2次。

1.3.7 單因素試驗(yàn)

影響黑曲霉產(chǎn)酶活力的因素有多種，主要考察制曲溫度、濕度以及時(shí)間對(duì)黑曲霉產(chǎn)糖化酶活力的影響。

1.3.8 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以糖化酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)的設(shè)計(jì)、模型建立以及數(shù)據(jù)采用Design-Expert[21]軟件分析，從而確定最優(yōu)制曲工藝參數(shù)。

1.3.9 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了確定通過響應(yīng)面分析所建立的模型與試驗(yàn)結(jié)果是否吻合，以優(yōu)化后的最佳制曲條件進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌的形態(tài)學(xué)觀察

霉菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3天的菌落形態(tài)特征見圖1。

圖1 霉菌菌株的菌落形態(tài)

由圖1可知，通過肉眼觀察微生物生長(zhǎng)于PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)菌落最初為白色，菌落形態(tài)近似圓形，表面粗糙，呈粉狀，菌絲為白色，孢子為黑色，從培養(yǎng)基上觀看正面為黑色，背面為白色。

插片培養(yǎng)結(jié)束后，無菌鑷子夾取蓋玻片放置于10×10倍顯微鏡下觀察分生孢子頭的形態(tài)，顯微鏡檢結(jié)果見圖2。

圖2 霉菌菌株的形態(tài)特征

由圖2可知，分生孢子頭的頂囊近似球形，小梗雙層，第一層粗大，第二層相對(duì)短小，呈放射排列，布滿整個(gè)頂囊，呈現(xiàn)黑色，頂端有鏈形孢子。再結(jié)合圖1菌落形態(tài)觀察結(jié)果，判斷其為曲霉科，屬于黑曲霉(Aspergillusniger)。

2.2 產(chǎn)酶條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 制曲溫度對(duì)甜面醬曲中糖化酶活力的影響

控制濕度為90%，培養(yǎng)時(shí)間為60 h及其他條件相同的情況下，比較在28，30，32，34，36 ℃不同溫度培養(yǎng)下的糖化酶活力，確定菌株的適宜產(chǎn)酶溫度。制曲溫度對(duì)所產(chǎn)糖化酶活力的影響見圖3。

圖3 制曲溫度對(duì)糖化酶活力的影響

由圖3可知，溫度的設(shè)置水平對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)糖化酶活力的影響均表現(xiàn)為顯著性差異。隨著溫度的升高，黑曲霉產(chǎn)糖化酶活力逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)到32 ℃時(shí)，糖化酶的活力最大，制曲溫度繼續(xù)升高，酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。分析可能的原因在于，前期隨著溫度的增加，微生物生長(zhǎng)旺盛，菌絲體大量繁殖，產(chǎn)酶量增加；超過32 ℃后，溫度過高可能產(chǎn)生了燒曲現(xiàn)象，導(dǎo)致酶活力開始下降。故選擇制曲溫度30～34 ℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平。

2.2.2 制曲濕度對(duì)甜面醬曲中糖化酶活力的影響

在溫度為30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為60 h以及其他培養(yǎng)條件相同的條件下，比較在75%，80%，85%，90%，95%不同濕度梯度條件下黑曲霉產(chǎn)糖化酶活力，確定合適的產(chǎn)酶濕度。制曲濕度對(duì)所產(chǎn)糖化酶活力的影響見圖4。

圖4 制曲濕度對(duì)糖化酶活力的影響

由圖4可知，不同濕度的選擇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著。在一定濕度范圍內(nèi)，酶活力隨著制曲濕度的升高而增加，達(dá)到最大值時(shí)濕度為90%；隨著濕度的繼續(xù)增大，酶活力逐漸降低?？赡艿脑蛟谟冢捌谖⑸锏纳L(zhǎng)需要一定的濕度維持，微生物在前期大量生長(zhǎng)產(chǎn)熱的同時(shí)使得物料水分流失，此時(shí)隨著濕度的補(bǔ)充，微生物能夠大量生長(zhǎng)產(chǎn)酶，超過一定濕度后，曲料濕度過大影響氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞，酶分泌的界面消失使得酶活力下降。故選擇制曲濕度85%～95%作為響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平。

2.2.3 制曲時(shí)間對(duì)甜面醬曲中糖化酶活力的影響

控制培養(yǎng)溫度為30 ℃，濕度為90%的條件下，分別考察36，48，60，72，84，96 h的糖化酶活力，確定最佳產(chǎn)酶時(shí)間。制曲時(shí)間對(duì)糖化酶活力的影響見圖5。

圖5 制曲時(shí)間對(duì)糖化酶活力的影響

由圖5可知，隨著制曲時(shí)間的延長(zhǎng)，糖化酶活力逐漸增大，達(dá)到峰值的時(shí)間為60 h，隨著制曲時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，糖化酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。分析可能的原因在于，微生物生長(zhǎng)與時(shí)間密切相關(guān)，制曲時(shí)間的選擇關(guān)系到糖化酶活力的高低。培養(yǎng)時(shí)間過短，菌絲沒有得到大量生長(zhǎng)，分泌的糖化酶含量較低；時(shí)間過長(zhǎng)，霉菌大量生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)孢子，原料更多地用于微生物的生長(zhǎng)繁殖，最后分泌的酶也相對(duì)較少[22]。前期主要是微生物菌絲萌芽及其分泌酶的階段，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，微生物開始大量產(chǎn)孢子，分泌的酶相對(duì)減少，酶活力下降。因此，選擇制曲時(shí)間在48～72 h之間。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化制曲條件

響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素及水平的設(shè)定見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

續(xù) 表

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

方差分析驗(yàn)證模型及其各參數(shù)的顯著性情況見表3。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of regression equation

注：“*”表示影響顯著(P<0.05)；“**”表示影響極顯著(P<0.01)。

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行整理分析，通過回歸擬合后，得到回歸方程預(yù)測(cè)模型方程：

Y=707.8-38.75A-9.5B-15.5C+21AB+19AC-4BC-45.15A2-94.15B2-60.65C2。

由表3可知，模型P<0.0001，表明回歸模型達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.1179>0.05，不顯著。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9948，RAdj2=0.9880。模型信噪比為30.78，通常認(rèn)為模型的可接受信噪比大于4，表明該回歸模型擬合程度以及可信程度較高。響應(yīng)值的變化有99.48%來源于所考察的變量因素，也就是制曲溫度、濕度以及時(shí)間。故回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，能夠利用該回歸模型方程確定最佳制曲條件。結(jié)合回歸模型的方差分析看，A，C，AB，AC，A2，B2，C2為極顯著性影響因素(P<0.01)，B為顯著性影響因素(P<0.05)。

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

依據(jù)二次方程模型所得的試驗(yàn)因素間交互作用的三維立體響應(yīng)曲面和等高線圖，見圖6～圖8。

圖6 溫度與濕度交互作用影響糖化酶活力的響應(yīng)面及等高線

圖7 時(shí)間與濕度交互作用影響糖化酶活力的響應(yīng)面及等高線

圖8 時(shí)間與溫度交互作用影響糖化酶活力的響應(yīng)面及等高線

為了進(jìn)一步分析相關(guān)變量間的交互作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，通過等高線圖能較為直觀地分析出兩因素的交互作用對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表示兩因素交互作用不顯著[23]。由圖6～圖8可知，3個(gè)因素在所選擇的范圍內(nèi)均存在響應(yīng)極值，AB，AC交互作用顯著，而BC交互作用不顯著，結(jié)果與方差分析所得結(jié)果相一致。

對(duì)回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，該模型存在極大值點(diǎn)。當(dāng)糖化酶活力達(dá)到最大估計(jì)值719.442 U/g干曲時(shí)，模型預(yù)測(cè)條件為：溫度(A)31.01 ℃、濕度(B)89.49%、時(shí)間(C)57.57 h。

2.3.4 回歸模型的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證回歸模型的擬合程度以及回歸方程的合適性與有效性，選取糖化酶活力最大響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的響應(yīng)因素進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際操作情況對(duì)響應(yīng)因素值進(jìn)行修正，溫度(A)為31 ℃，濕度(B)為90%，時(shí)間(C)為57.5 h，平行試驗(yàn)3次，糖化酶活力為±717.42 U/g干曲，與預(yù)測(cè)結(jié)果(719.442 U/g干曲)相對(duì)偏差為0.28%。

3 結(jié)論

本研究從甜面醬中篩選出的霉菌經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為黑曲霉，并對(duì)其固態(tài)制曲條件進(jìn)行了優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken試驗(yàn)獲得其制曲的最優(yōu)工藝條件為：溫度31 ℃、濕度90%、時(shí)間57.5 h，在此條件下糖化酶活力達(dá)到±717.42 U/g干曲。通過Box-Behnken試驗(yàn)建立的回歸模型擬合度較好，能夠用來預(yù)測(cè)設(shè)定條件范圍內(nèi)的制曲工藝參數(shù)的響應(yīng)值。

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Separation of Aspergillus niger from Sweet Flour Paste and Optimization of the Koji-making Conditions

XIE Guang-jie1, YE Bi-xia2, ZUO Yong2*, ZHANG Jing2

(1.Sichuan Vocational College of Chemical Technology, Luzhou 646000, China；2.College of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000，China)

Aspergillusnigerseparated from sweet flour paste is primarily identified and then the koji-making conditions are optimized by Box-Behnken test. Based on single-factor experiments, koji-making temperature, humidity and time are chosen as the independent variables, and saccharifying enzyme activity is as the response variable. Subsequently, Box-Behnken design principle of response surface experiment is applied to establish a mathematical model with three factors-three levels design. As a result, the optimal koji-making conditions for sweet flour paste are determined as temperature of 31 ℃, humidity of 90% and time of 57.5 h. Under the optimal conditions, the saccharifying enzyme activity reaches up to 717.42 U/g.

sweet flour paste;Aspergillusniger;koji-making conditions;response surface experiment

2017-01-17 *通訊作者

四川省教育廳重大培育項(xiàng)目(15CZ0022)；2015大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(y2015011)

謝光杰(1980-)，男，講師，主要從事生物工程方面的研究； 左勇(1972-)，男，教授，主要從事發(fā)酵食品方面的研究。

TS264.24

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.017

1000-9973(2017)07-0076-06