黃 磊，鄒孝強，鄭 莉，金青哲，王興國

(江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇省食品營養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

綜合利用

酸解巴沙鯰魚油制備富含OPO的人乳替代脂

黃 磊，鄒孝強，鄭 莉，金青哲，王興國

(江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇省食品營養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

以巴沙鯰魚油為原料、高油酸葵花籽油來源的游離脂肪酸為酰基供體，采用Lipozyme RM IM脂肪酶為催化劑催化酸解反應制備富含OPO的人乳替代脂。并采用液質聯(lián)用對巴沙鯰魚油、酸解巴沙鯰魚油、市售BetapolTM的sn-OPO含量進行分析。結果表明，最佳制備條件為：底物摩爾比1∶6，酶用量12%，反應溫度60℃，水分含量3.5%(基于酶質量)，反應時間3 h。在最佳條件下，酸解產物中sn-2棕櫚酸分布和sn-1，3油酸含量分別為73.18%和71.11%。酸解產物中sn-OPO含量從23.35%提高到34.28%，高于市售BetapolTM的33.24%。

1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(OPO)；巴沙鯰魚油；酸解；Lipozyme RM IM

母乳在嬰幼兒成長發(fā)育過程中扮演著非常重要的角色，像一個“營養(yǎng)池”幾乎提供了嬰幼兒生長所需的所有營養(yǎng)物質。乳脂肪被認為是最重要的組成成分，其含量只有3%～5%，但提供了50%～60%能量。乳脂肪主要成分為甘油三酯，占到總量的98%[1-2]，與植物油相比，乳脂肪具有特殊的脂肪酸結構[3-4]，超過60%的棕櫚酸分布在sn-2位，油酸等不飽和脂肪酸主要分布在sn-1,3位。所以乳脂肪中甘油三酯以USU(U不飽和，S飽和)構型為主。大量文獻證實，母乳中sn-OPO含量高，且和嬰幼兒消化、吸收、代謝和發(fā)育息息相關[5-7]。

乳脂肪進入小腸，在胰脂肪酶(sn-1,3特異性脂肪酶)作用下，大部分甘油三酯被水解成sn-2單甘酯和游離脂肪酸。sn-2單甘酯直接被小腸吸收，而高熔點的長鏈飽和脂肪酸容易與鈣、鎂離子結合形成皂，引起能量和鈣丟失，導致嬰兒產生便秘等不良反應[8-9]。因此，乳脂肪中大多數棕櫚酸在sn-2 位可以避免這些情況發(fā)生。正如Aoe等[10]報道，sn-OPO在嬰幼兒體內的吸收運輸速率要高于sn-OOP。

母乳的特殊結構給奶粉市場帶來了巨大商機，許多廠家致力于模擬母乳成分。OPO能夠改善嬰兒對配方奶粉中各營養(yǎng)成分的吸收情況，也對嬰兒胃腸功能成熟等方面有一定的促進作用[11]。文獻中合成OPO報道很多，原料可以分為3種：棕櫚硬脂，豬油，巴沙鯰魚油。對于棕櫚硬脂，雖然sn-2棕櫚酸含量高，但其sn-1,3的棕櫚酸含量也很高，合成時需要很多的油酸來取代sn-1,3棕櫚酸，增加了成本。衛(wèi)生部批準的唯一進入我國市場的產品BetapolTM正是通過此方法合成。豬油在其脂肪酸組成上和母乳有很多相似之處，且OPO含量也較為豐富[12]，是作為人乳脂替代品的天然原料。但伊斯蘭信徒不食用豬油，在應用覆蓋面上存在一定的局限性。巴沙鯰魚是湄公河流域中一種特有的優(yōu)質經濟魚，也是越南水產品中加工出口量最大的品種。早前，實驗室[13]對巴沙鯰魚油采用先分提后酸解的方式得到了富含OPO的產品。只使用了產品固脂部分，液脂部分未被使用；另一方面，由于OPO熔點較低，相當一部分OPO存在于液脂之中，造成了資源利用率低的情況。同時，實驗室利用巴沙鯰魚油與植物油進行混合，制備了與母乳相近的人乳脂替代品[14]。事實證明巴沙鯰魚油由于其特殊的脂肪酸組成及分布是制備人乳替代脂的良好原料。

本文以巴沙鯰魚油為原料、高油酸葵花籽油來源的游離脂肪酸為?；w，采用Lipozyme RM IM脂肪酶為催化劑催化酸解反應制備富含OPO的人乳替代脂。之后采用液質聯(lián)用技術對OPO中同分異構體進行定量分析，確定其sn-OPO含量，同時與市售的BetapolTM進行對比分析，以期為母乳替代脂生產實踐提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

巴沙鯰魚油(BCFO)，重慶巴沙鯰魚油有限公司；高油酸葵花籽油，益海嘉里集團；Lipozyme RM IM，諾維信(中國)投資有限公司；豬胰脂酶、Supelco 37種脂肪酸甲酯混標、sn-OOP標品、sn-OPO標品，Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司；60GTLC硅膠板(10 cm×20 cm)；正己烷、異丙醇、甲醇，色譜純；乙醚三氟化硼溶液、濃硫酸、冰醋酸、乙醚。

AR2140電子精密天平， SHA-CA水浴恒溫振蕩器， HH-4數顯恒溫水浴鍋， XW-80A微型旋渦混合儀， RE-52旋轉蒸發(fā)器，SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵，TGL-16B離心機，GC-14B氣相色譜儀(日本Shimadzu公司)，KDL1型分子蒸餾設備(德國UIC公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 游離脂肪酸的制備

游離脂肪酸的制備參考Senanayake等[15]的方法。25 g高油酸葵花籽油中加入5.75 g 氫氧化鉀、11 mL蒸餾水和66 mL 95%乙醇，在80℃和200

r/min下冷凝回流反應1 h。冷卻后向體系中加入50 mL蒸餾水和100 mL正己烷，充分振蕩后除去含有不皂化物的有機相。采用3 mol/L鹽酸溶液調節(jié)含有皂化物的無機相至pH為1，釋放脂肪酸。最后采用無水Na2SO4對所得游離脂肪酸進行脫水處理。

1.2.2 人乳替代脂的制備

將巴沙鯰魚油和由高油酸葵花籽油制備的游離脂肪酸以一定的摩爾比混合，加入脂肪酶Lipozyme RM IM，以及占酶質量3.5%的水分，在磁力攪拌500 r/min、一定溫度下反應一定時間后，得到含有產物和游離脂肪酸的混合物。

1.2.3 產物的分離

分子蒸餾除去反應后體系中的游離脂肪酸得到最終產物。分子蒸餾條件為：蒸發(fā)器溫度185℃；冷凝器溫度40℃；換熱器溫度60℃；旋轉刮膜速率120 r/min；進料速度2 mL/min，絕對壓力2 Pa。蒸發(fā)器的加熱源來自夾套中循環(huán)的加熱硅油。

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 脂肪酸組成分析

取樣品50 μL點板，在展開劑為正己烷-乙醚-乙酸(體積比80∶20∶1)條件下進行薄板分離，用2,7二氯熒光素乙醇溶液顯色，在紫外照射條件下把甘油三酯條帶刮下，用乙醚提取2次，向氮氣濃縮后的油樣加入2 mL正己烷及500 μL KOH-甲醇溶液(2 mol/L)，用旋渦振蕩儀振蕩2 min，多次振蕩，靜置。取出上層有機相并采用無水Na2SO4進行脫水處理，10 000 r/min離心3 min，取上層進氣相色譜分析。

脂肪酸組成分析采用配備火焰離子化檢測器的GC-14B氣相色譜儀，分析柱為熔融石英毛細管柱(PEG-20M，30 m×0.32 mm×0.5 μm)。色譜條件為：100℃保留4 min，并以15℃/min升溫至180℃，保留4 min，并最終以4℃/min升溫至215℃；進樣口溫度及檢測器溫度均為250℃。通過標準品的保留時間鑒定脂肪酸種類。

1.2.4.2 sn-2脂肪酸組成分析

根據Zou等[16]的方法，對薄層色譜法分離獲得的甘油三酯進行水解獲得sn-2單甘酯。用2 mL乙醚提取1.2.4.1所得的甘油三酯帶2次，并用氮氣進行濃縮。向甘油三酯中加入1 mL 1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)、0.25 mL 0.05%膽鹽、0.1 mL 2.2%氯化鈣以及10 mg胰脂肪酶，在40℃下振蕩反應3 min，向體系中加入1 mL 6 mol/L的鹽酸和2 mL乙醚，振蕩后以10 000 r/min離心5 min。取出乙醚層，并用無水Na2SO4對其進行脫水處理，采用氮氣將其濃縮至200 μL。將水解產物上樣至薄板，并用正己烷-乙醚-乙酸(體積比50∶50∶1)的擴展液分離獲得sn-2單甘酯。sn-2單甘酯的甲酯化參照1.2.4.1所述進行。

1.2.4.3 液質聯(lián)用定性測定甘油三酯組成

超高效液相色譜(UPLC)條件：色譜柱為Acquity UPLC BEH C18分析柱(2.1 mm×50 mm, 1.9 μm)；流動相A為乙腈-異丙醇(體積比1∶9)，流動相B為乙腈-水(體積比4∶6)，同時流動相A、B中均添加乙酸銨(每升流動相加入10 mmol乙酸銨)；進樣量1.0 μL；柱溫45℃，樣品室溫度4℃。流動相洗脫條件如表1所示。

表1 UPLC洗脫程序

MS條件：ESI電離源，正離子模式；毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓30 V；離子源溫度100℃，脫溶劑溫度400℃；碰撞氣體為氬氣，去溶劑化氣體(氮氣)流速700 L/h；掃描時間間隔0.2 s，掃描范圍(m/z)200～1 500；碰撞電壓35 V。

1.2.4.4 高效液相色譜定量測定甘油三酯含量

色譜條件：檢測器溫度55℃，空氣流速1.8 mL/min，增益為1；樣品質量濃度10～20 mg/mL；Lichrospher C18分析柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相A乙腈，流動相B異丙醇-正己烷(體積比1∶1)，洗脫程序為0～20 min，60%A；20～60 min，60%～56%A；60～70min，56%～60%A；流速0.8 mL/min。

2 結果與討論

2.1 巴沙鯰魚油脂肪酸組成

巴沙鯰魚油脂肪酸組成分析結果如表2所示。

從表2可以看出，巴沙鯰魚油中棕櫚酸和油酸含量較高，其中，棕櫚酸含量為27.26%，油酸為44.01%，同時sn-2棕櫚酸含量高達44.27%，這是其構建高含量OPO的基礎。而sn-2棕櫚酸分布(表示sn-2棕櫚酸占總棕櫚酸的比值)為54.13%。然而據文獻報道，母乳中sn-2棕櫚酸分布最低值為60%[17]，所以巴沙鯰魚油并不符合要求，這就意味著在用巴沙鯰魚油制備人乳替代脂時需要降低其sn-1，3棕櫚酸含量。

表2 巴沙鯰魚油脂肪酸組成分析 %

注：sn-2脂肪酸分布=sn-2脂肪酸含量/(3×脂肪酸含量)，sn-1，3脂肪酸含量=(3×脂肪酸含量-sn-2脂肪酸含量)/2。

2.2 巴沙鯰魚油甘油三酯的種類和含量

為確定巴沙鯰魚油甘油三酯組成和含量，采用液質聯(lián)用和高效液相色譜技術分別對巴沙鯰魚油進行測定。結合液質聯(lián)用出峰時間、高效液相色譜出峰時間以及高效液相色譜甘油三酯出峰規(guī)律(碳當量小的先出峰；碳當量相同時，不飽和程度高的先出峰)，判斷甘油三酯類型，結果見表3，高效液相色譜圖如圖1所示。

表3 巴沙鯰魚油的甘油三酯組成

注：M，(肉)豆蔻酸；P，棕櫚酸；Po，棕櫚油酸；S，硬脂酸；O，油酸；L，亞油酸。下同。

圖1 巴沙鯰魚油甘油三酯組成的HPLC譜圖

從表3可以看出，巴沙鯰魚油中主要甘油三酯組成為OPO (32.18%)、PPO (11.60%)、OOO (8.35%)、OPL (13.12%)、SOO (5.46%)、OOL (7.17%)等，這些甘油三酯均為母乳的組成成分。巴沙鯰魚油sn-2棕櫚酸含量高，所以OPO、PPO、POS多數以sn-2棕櫚酸的甘油三酯形式存在，在后續(xù)反應中PPO和POS均可以轉變?yōu)镺PO，既可以提高OPO含量，又可以降低這些飽和度高的甘油三酯，更有利于嬰幼兒生長發(fā)育。

2.3 酸解巴沙鯰魚油制備人乳替代脂

實驗將巴沙鯰魚油和從高油酸葵花籽油中制備的游離脂肪酸(棕櫚酸3.96%，硬脂酸3.03%，油酸81.53%，亞油酸10.55%)反應。選擇反應過程中的棕櫚酸含量、油酸含量、sn-2棕櫚酸含量、sn-2油酸含量作為衡量指標確定反應的最適條件，從而提高OPO含量的同時提高sn-2棕櫚酸分布來達到人乳替代脂要求。根據文獻報道[18-20]，水分含量對產品的特性影響很小，但高水分反而會加劇反應過程中的酰基轉移，從而降低sn-2棕櫚酸含量的同時增多甘油二酯的含量，綜合考慮，選擇水分含量為酶質量的3.5%作為反應條件。

2.3.1 底物摩爾比的影響

此酶法酸解反應是可逆反應[21]，底物摩爾比決定著反應達到平衡的時間。實驗選用反應條件為酶用量(以底物質量計)10%，反應溫度50℃，水分含量為酶質量的3.5%。底物摩爾比(游離脂肪酸與巴沙鯰魚油摩爾比)對棕櫚酸含量、油酸含量、sn-2棕櫚酸含量、sn-2油酸含量的影響如圖2所示。

從圖2可以看出，當底物摩爾比在1∶4和1∶2時，反應平衡時間為3 h；底物摩爾比為1∶8和1∶6時，反應平衡時間為5 h。對于底物摩爾比為1∶2和1∶4來說，棕櫚酸被油酸取代的速度較慢，當反應達到平衡時，油酸含量明顯低于1∶6和1∶8條件下的油酸含量。因為酰基轉移的存在，隨著反應時間的延長，sn-2棕櫚酸含量呈下降趨勢。另一方面，隨著底物摩爾比的增加導致酰基轉移增加，在底物摩爾比1∶6和1∶8時，反應平衡時得到的產品棕櫚酸含量分別為20.21%和19.80%，sn-2棕櫚酸含量分別為40.10%和39.51%，油酸含量分別為58.47%和58.69%，sn-2油酸含量分別為31.22%和32.34%，經過計算sn-2棕櫚酸分布分別為66.14%和66.52%，sn-1，3油酸含量分別為72.09%和71.87%。因此，底物摩爾比1∶6和1∶8在結果上差別并不是很大，但是1∶6條件下反應耗用了更少的脂肪酸，選擇底物摩爾比1∶6作為進一步研究的條件。

2.3.2 酶用量的影響

高酶用量可以減少反應達到平衡的時間來減少?；D移，也會使得體系中甘油二酯含量增加導致酰基轉移增加[22]。實驗條件選擇底物摩爾比為1∶6、反應溫度為50℃、水分含量為酶質量的3.5%。酶用量對棕櫚酸含量、油酸含量、sn-2棕櫚酸含量、sn-2油酸含量的影響如圖3所示。

從圖3可以看出，當酶用量為8%和10%時，平衡時間為5 h；當酶用量為12%和14%時，平衡時間為3 h。8%和10%的酶用量下產物油酸含量低于12%和14%的油酸含量。隨著反應時間的延長，sn-2油酸含量增加而sn-2棕櫚酸含量降低；另一方面，隨著酶用量的增多，這種變化速率不斷增加。當反應達到平衡時，12%和14%酶用量下sn-2油酸含量分別為30.25%和30.95%，sn-2棕櫚酸含量分別為40.35%和39.72%。計算得到sn-1,3油酸含量分別為69.69%和69.32%；sn-2棕櫚酸分布分別為72.97%和73.04%。12%和14%酶用量得到的反應結果相近，12%酶用量成本更低。綜合考慮，選擇12%酶用量作為后續(xù)反應的條件。

2.3.3 反應溫度的影響

在酶法酸解反應中，高溫可以降低體系的黏度，增加反應物的有效碰撞，從而提高反應速率。然而，高溫也可以提高?；D移速率，從而降低反應產物的純度，甚至可能破壞酶的結構，導致其不可逆的失活[23]。實驗條件為底物摩爾比1∶6、酶用量12%、水分含量為酶質量的3.5%。反應溫度對棕櫚酸含量、油酸含量、sn-2棕櫚酸含量、sn-2油酸含量的影響如圖4所示。

從圖4可以看出，反應溫度50、60、70℃下反應達到平衡時間為3 h，而40℃下反應達到平衡時間超過5 h。隨著反應溫度升高，?；D移速率明顯提高。當反應達到平衡時，計算可得在反應溫度40、50、60、70℃下對應的sn-1，3油酸含量和sn-2棕櫚酸分布分別為66.50%, 70.60%, 71.11%和69.50%；69.02%, 70.60%, 73.18%和72.96%。在60℃下，sn-1，3油酸含量和sn-2棕櫚酸分布明顯優(yōu)于其他條件。因此，選擇60℃為實驗的反應溫度。

2.4 酸解巴沙鯰魚油的甘油三酯組成

綜合選擇實驗條件為：底物摩爾比1∶6，酶用量12%，反應溫度60℃，水分含量為酶質量的3.5%，反應時間3 h。采用上述條件進行大規(guī)模反應，反應產物通過分子蒸餾去除游離脂肪酸，最終產品得率為93.7%(得率=產品/巴沙鯰魚油)。產品的甘油三酯組成見表4。產物sn-1，3油酸含量從 54.89% 增長到71.11%，sn-2棕櫚酸含量為40.35%，sn-2棕櫚酸分布從54.13%提高到73.18%，OPO含量也增加到43.95%(見表4)。

表4 酸解后巴沙鯰魚油主要甘油三酯組成

2.5 OPO同分異構體分離測定

高效液相色譜難以對同分異構體進行分離，色譜圖中OPO峰為sn-OPO和sn-OOP混合物。在質譜體系中，sn-OPO產生[OP]+離子能力大于sn-OOP[24]。文獻報道，將sn-PPO和sn-POP按照不同比例混合，測定在不同混合條件下[OP]+和[OO]+的相對豐度的變化。實驗結果同sn-PPO和sn-POP單獨分析產生[OP]+和[OO]+的相對豐度所計算的理論值進行比較，在沒有校正因子的情況下，實驗值同理論值之間的差異為1%～2%[25-27]。因此，采用液質聯(lián)用可以對sn-OPO進行定量。表5為sn-OOP和sn-OPO在不同混合條件下質譜后產生的[OO]+/[OP]+比值，sn-OPO純度越高，[OO]+/[OP]+的比值就越小。

表5 液質聯(lián)用測定不同比例sn-OOP和

根據這種出峰特點得到sn-OOP定量標準曲線方程：y=333.8x-113.1，R2=0.997(式中：x為[OO]+/[OP]+比值，y為sn-OOP比例)。對巴沙鯰魚油、酸解反應產物、BetapolTM的sn-OPO進行定量，結果見表6。

表6 BetapolTM、巴沙鯰魚油、酸解巴沙鯰魚油、

注：a指數據來源于文獻[28]。

從表6可以看出，酸解后巴沙鯰魚油產品的sn-OPO 含量高達34.28%，高于市售BetapolTM，同時其PPO和POS含量更接近母乳水平。

3 結 論

本文通過直接酶法酸解巴沙鯰魚油合成了富含sn-OPO的人乳替代脂。通過單因素實驗得到最佳反應條件為：底物摩爾比1∶6，酶用量12%，反應溫度60℃，水分含量為酶質量的3.5%，反應時間3 h。在最佳條件下，sn-2棕櫚酸、sn-1，3油酸含量以及sn-2棕櫚酸分布分別為40.35%、71.11%和73.18%，sn-OPO含量達34.28%。直接利用巴沙鯰魚油進行合成反應，簡單直接，可有效緩解棕櫚硬脂的成本問題和豬油使用的宗教問題，同時其sn-OPO含量高于市售BetapolTM，且PPO、POS等甘油三酯含量更接近母乳水平，在人乳替代脂市場具有廣闊的前景。

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Production of structured lipids rich in 1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol from basa catfish oil as human milk fat substitutes by enzymatic acidolysis

HUANG Lei, ZOU Xiaoqiang, ZHENG Li, JIN Qingzhe, WANG Xingguo

(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

Lipozyme RM IM-catalyzed acidolysis of basa catfish oil with free fatty acids from high oleic acid sunflower seed oil to increase the content of OPO was conducted. The sn-OPO contents of basa catfish oil, enzymatic product and BetapolTMwere determined by UPLC-MS. The results showed that the optimal preparation conditions were obtained as follows: molar ratio of substrate 1∶6, enzyme dosage 12%, reaction temperature 60℃, water content 3.5%(on the basis of enzyme mass) and reaction time 3 h. Under these conditions, the distribution of sn-2 palmitic acid and the content of sn-1，3 oleic acid in the acidolysis product were 73.18% and 71.11%, respectively. The content of sn-OPO in the acidolysis product increased from 23.35% to 34.28%, higher than 33.24% in BetapolTM.

1, 3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol(OPO); basa catfish oil; acidolysis; Lipozyme RM IM

2016-09-20；

2017-03-09

國家自然科學基金(31601433)；江蘇省自然科學基金(BK20140149)

黃 磊(1992)，男，在讀碩士，研究方向為脂質科學與技術(E-mail)jndx_huanglei@163.com。

鄒孝強，副教授(E-mail)xiaoqiangzou@163.com。

TS225.1；TS222

A

1003-7969(2017)05-0116-07