洪 磊, 周繼紅, 李 偉, 陳余清△, 蔣 鵬, 袁娜娜, 王效靜, 朱茂祥, 楊陟華
(1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,安徽呼吸系病臨床基礎(chǔ)省級實驗室, 安徽 蚌埠 233004;2蚌埠醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室, 安徽 蚌埠 233002; 3軍事醫(yī)學科學院放射與輻射研究所, 北京 100850)
·論 著·
Hes1在煙草誘導人支氣管上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用*
洪 磊1, 周繼紅2, 李 偉1, 陳余清1△, 蔣 鵬1, 袁娜娜1, 王效靜1, 朱茂祥3, 楊陟華3
(1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,安徽呼吸系病臨床基礎(chǔ)省級實驗室, 安徽 蚌埠 233004;2蚌埠醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室, 安徽 蚌埠 233002; 3軍事醫(yī)學科學院放射與輻射研究所, 北京 100850)
目的: 探討轉(zhuǎn)錄因子發(fā)狀分裂相關(guān)增強子1(hairy and enhancer of split,Hes1)在香煙煙氣凝集物(cigarette smoke condensate,CSC)誘導永生化人支氣管上皮細胞BEP2D惡性轉(zhuǎn)化中的作用。方法: CSC (1L空氣中點燃1支香煙)慢性染毒BEP2D細胞至第70代,軟瓊脂集落形成實驗檢測CSC誘導的細胞惡性轉(zhuǎn)化表型;采用RT-PCR和Western blot法檢測各代細胞的Hes1表達;MTT法、細胞集落形成實驗和流式細胞術(shù)檢測Notch通路阻斷劑DAPT或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hes1-siRNA對CSC染毒BEP2D細胞增殖與凋亡的影響。檢測吸煙大鼠外周小氣道組織中Hes1的表達;采用免疫組化法和RT-PCR法檢測非小細胞肺癌組織及正常氣道組織中Hes1的表達。結(jié)果: 第70代BEP2D細胞具備惡性轉(zhuǎn)化表型;Hes1在CSC染毒BEP2D細胞中的表達總體呈逐漸增高的趨勢;DAPT和Hes1-siRNA均能通過下調(diào)Hes1顯著抑制第70代BEP2D細胞的增殖,誘導其凋亡;Hes1在卷煙煙氣暴露大鼠氣道黏膜1月和6月組的表達較同期對照組顯著增高;吸煙顯著誘導肺癌組織和正常氣道表達Hes1。結(jié)論: Hes1可能通過促進凋亡與增殖失衡,參與吸煙誘導的肺癌發(fā)生。
肺癌; 吸煙; 轉(zhuǎn)錄因子Hes1; 香煙煙氣凝集物
肺癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,全球每年大約有1 600萬新確診肺癌患者[1]。吸煙與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)[2],香煙煙霧中有69種致癌物,包括尼古丁、尼古丁衍生的亞硝胺酮[nicotine-derived nitrosamine ketone,NNK; 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone]和多環(huán)芳烴等[3],這些成分可通過多種途徑影響肺癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移[4]。但煙草致癌的具體分子機制尚未闡明。轉(zhuǎn)錄因子發(fā)狀分裂相關(guān)增強子1(hairy and enhancer of split 1,Hes1)是Notch信號通路中重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,參與干細胞自我更新能力的維持,可抑制干細胞的不對稱有絲分裂[5],因此Hes1的異常表達會對腫瘤的生長與分化產(chǎn)生重要影響。Hes1在包括橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌等多種腫瘤中異常表達[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)Hes1高表達于非小細胞肺癌細胞中[8]。但其在煙草致癌中的作用目前國內(nèi)外尚無報道。
1 動物、細胞和組織標本
1.1 動物分組與模型的制備 清潔級雄性Wistar大鼠72只,體重(180±20)g,由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為2組,一組在正常呼吸空氣條件下飼養(yǎng),注意給予基礎(chǔ)飼料和充足的水;另一組給予煙霧吸入,采用市售某品牌香煙(焦油量 14 mg,煙氣煙堿量 1 mg),將大鼠置入70 cm×50 cm×50 cm密閉染毒裝置中被動吸煙,每日2次,每次連續(xù)燃燒10支香煙,共持續(xù)約30 min,每周7 d,連續(xù)6個月。2組動物分別于飼養(yǎng)1、3、6月各處死12只,取肺組織標本石蠟包埋進行實驗。
1.2 細胞 永生化人支氣管上皮細胞BEP2D由軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所朱茂祥教授饋贈。
1.3 組織標本 收集蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科2013年6月~2016年1月非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)手術(shù)存檔標本(石蠟包埋)50例。所有患者采集標本前均未經(jīng)過放療、化療和靶向治療。所有標本均有完整的臨床及病理資料。男性占37例,女性占13例;年齡<60歲的14例,≥60歲的36例;肺癌的病理診斷標準參照2004年WHO肺腫瘤組織學分類標準。按組織學分級Ⅰ級占12例,Ⅱ級占22例,Ⅲ級占16例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例;詳細記錄每例患者吸煙時間、每天吸煙量(包)和戒煙時間。吸煙指數(shù)(包×年)=每天吸煙的包數(shù)(每包20支)×吸煙年數(shù)。按患者吸煙狀況分類:從不吸煙者21例,重度吸煙29例(從不吸煙者定義為終生吸煙劑量少于100支;重度吸煙的定義為吸煙指數(shù)>20包×年)。篩查2013 年4 月~2015 年12 月蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)鏡中心接受氣管鏡檢查的重度吸煙人群,所有患者經(jīng)過病理和隨訪最終確定為非腫瘤患者。最終篩選出10 例重度吸煙患者(病理證實7 例為中到重度不典型增生,3 例為鱗狀化生)和10 例不吸煙患者(該20例患者中結(jié)核4例,炎癥13例,間質(zhì)性肺炎3例)。本實驗經(jīng)過蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準后進行的。
2 主要試劑
RIPA裂解液和BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天);Trizol和PCR試劑盒(北京天根);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo);抗Hes1單克隆抗體、抗Notch1及Notch的活化形式Notch胞內(nèi)段(Notch intracellular domain,NICD)多克隆抗體(Abcam); HRP標記的羊抗兔IgG(博士德);DAPT(Notch阻斷劑)購于Sigma;超敏即用型二步法免疫組化試劑盒和DBA顯色試劑盒(中杉金橋);單通道吸煙機(型號HRH-SM120,北京慧榮和科技公司);卷煙煙氣染毒柜(軍事醫(yī)學科學院研制)。
3 主要方法
3.1 香煙煙氣凝集物(cigarette smoke condensate,CSC)的制備及細胞培養(yǎng) 用北京慧榮和科技公司生產(chǎn)的HRH-SM120型單通道吸煙機制備CSC,用LHC-8培養(yǎng)液稀釋到實驗設計濃度處理細胞直接進行細胞染毒,CSC在一定程度上代表了主流煙氣中的主要成分。正常對照組(BEP2D細胞)、乙醇對照組及CSC(每升空氣點燃1支香煙)處理后的P10、P20、P30、P40、P50、 P60、P70細胞組(分別代表第10~70代染毒細胞),使用LHC-8無血清培養(yǎng)液,在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
3.2 軟瓊脂細胞集落形成實驗 采用LHC-8培養(yǎng)液配制1.4%的瓊脂糖,高溫高壓滅菌后,稍冷卻后放入41 ℃水浴鍋中保溫;加入預溫的LHC-8培養(yǎng)液稀釋至0.7%,繼續(xù)保溫;以每皿3 mL 0.7%瓊脂糖倒進直徑60 mm培養(yǎng)皿中,鋪制底層,待其凝固后備用。將常規(guī)消化呈指數(shù)生長的9組細胞,制備相應細胞培養(yǎng)液懸液與保溫的0.7%瓊脂糖1∶1混勻,稀釋為0.35%細胞瓊脂混合液,加在含0.7%瓊脂糖膠培養(yǎng)皿上(細胞密度為每皿1.5×104),待細胞瓊脂混合液凝固后,每皿中加入2 mL LHC-8培養(yǎng)液。每組設5皿;在5% CO2、37 ℃和飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng),3 d換液1次;4周后行鏡下計數(shù),細胞多于50個為1個集落,按以下公式計算集落形成率(clony formation efficiency,CFE):CFE(%)=(集落數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。
3.3 Western blot實驗 提取各不同染毒代數(shù)細胞蛋白,以100 ℃煮沸5 min,使蛋白充分變性,10% SDS-PAGE分離目的蛋白,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;裁剪后的膜用封閉液室溫封閉1.5 h,加入稀釋后的 I 抗(Notch1、NICD、Hes1和β-actin抗體分別用 I 抗稀釋液以1∶500、1∶1 000、1∶1 000和1∶400 稀釋),4 ℃孵育過夜;次日用TBST緩沖液洗膜3次,采用HRP標記的 II抗37 ℃ 孵育20 min,繼而室溫下孵育80 min 左右(60 r/min);再用TBST緩沖液洗膜3次,配置化學發(fā)光試劑。實驗重復3次,應用AlphaView軟件對目的條帶進行灰度分析。數(shù)據(jù)使用目標蛋白的灰度值/內(nèi)參照(β-actin)灰度值表示。
3.4 RT-PCR實驗 采用Trizol法提取處理后各組細胞總RNA,根據(jù)說明書進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增。實驗設置3個復孔并至少重復2次。β-actin表達量作為內(nèi)參照。數(shù)據(jù)使用目標基因mRNA/內(nèi)參照(β-actin)灰度值表示。Hes1的上游引物序列為5′-CCCTCCTCCTAAACTCCC-3′,下游引物序列為5′-TCAAACATCTTTGGCATCA-3′。內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′,下游引物序列為 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。
3.5 MTT實驗檢測細胞活力 將CSC染毒的P70細胞分成4組,分別加入0 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L的DAPT,分別處理24 h、48 h和72 h。收集對數(shù)生長期細胞制成細胞懸液,并調(diào)整細胞懸液濃度為1×107/L;在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至孔底細胞鋪滿單層,加入200 μL含上述濃度梯度抑制劑的培養(yǎng)液,毎個梯度設5個復孔,同時設置調(diào)零孔(不含細胞和藥物,只添加培養(yǎng)基);37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至設定時間后,每孔加入20 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h;培養(yǎng)終止,輕輕吸去96孔板內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO,置于低速搖床上振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解;測量各孔在波長490 nm處的吸光度并記錄。同樣方法檢測Hes1干擾后的細胞活力,實驗設立3組: 實驗組(siRNA-Hes1組)、陰性對照組(siRNA-NC組)和空白組(control組)。siRNA合成及轉(zhuǎn)染方法見3.9。
3.6 細胞集落形成檢測 準備感染后的細胞,將處于對數(shù)生長期的各實驗組細胞胰酶消化,完全培養(yǎng)基重懸,制成細胞懸液,計數(shù)。于6孔培養(yǎng)板中每孔接種400~1 000 個細胞(根據(jù)細胞生長情況確定),每個實驗組設3個復孔。將接種好的細胞于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)到14 d或絕大多數(shù)單個集落中細胞數(shù)大于50 為止,中途每隔3 d進行換液并觀察細胞狀態(tài)。實驗終止前熒光顯微鏡下對細胞集落進行拍照,PBS 洗滌細胞1 次。每孔加入1 mL 4%多聚甲醛,固定細胞30~60 min,PBS 洗滌細胞1 次。每孔加入潔凈、無雜質(zhì)Giemsa 染液500 μL,染細胞10~20 min。ddH2O 洗滌細胞數(shù)次,晾干,集落計數(shù)。
3.7 Annexin V-PI雙染法檢測細胞凋亡 采用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測不同濃度(10 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)DAPT及DAPT作用不同時間(24 h、48 h和72 h)后P70細胞的凋亡。操作步驟參照碧云天公司Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書。同樣方法檢測Hes1沉默后的細胞凋亡,實驗分為siRNA-Hes1組、siRNA-NC組和control組。
3.8 免疫組化實驗 所有標本經(jīng)4%中性甲醛固定,石蠟包埋,4 μm連續(xù)切片,HE染色。60 ℃烤箱烘片4 h,然后脫蠟至水,梯度乙醇脫水,隨后水洗;采用檸檬酸抗原修復液煮沸10 min進行抗原修復,其余步驟嚴格按照說明書進行,DAB顯色后,用蘇木精復染,封片。結(jié)果判定采用雙盲法,由2位病理科醫(yī)師分別觀察切片。Hes1陽性顯色主要定位于細胞核。采用半定量積分法判定結(jié)果。首先按照著色強度評分,標本無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;再按照陽性細胞在所觀察細胞中所占比例評分,陽性細胞數(shù)≤10%為1分,11%~50%為2分,51%~75%為3分,≥75%為4分。每張切片最后的得分為2次評分的乘積(1~12分)。
3.9 siRNA合成及轉(zhuǎn)染 參考文獻[9]并通過基因BLAST,挑選一條特異性寡核苷酸序列(由上海吉瑪制藥有限公司合成)。同時合成一條與目的RNA無同源性的片段作為陰性對照。Hes1序列為5′-CCGGCTTCAGCGAGTGCATGA-3′;陰性對照序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。以熒光標記的siRNA(FAM siRNA)進行優(yōu)化。以1.5×108cells/L接種細胞于含無菌小圓玻片的24孔培養(yǎng)板中,每孔500 μL(保證在轉(zhuǎn)染前細胞的匯合度在90%左右)。24 h后按照Lipofectamine 2000說明書的條件轉(zhuǎn)染細胞,轉(zhuǎn)染后6 h,換新鮮培養(yǎng)基。設立若干個siRNA濃度組,每組Opti-MEM用量為500 μL。24 h觀察細胞生長情況,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。確定1 μL Lipofectamine 2000配50 nmol/L siRNA為最佳轉(zhuǎn)染濃度。實驗分為siRNA-Hes1組、siRNA-NC組和control 組。
3.10 實時熒光定量PCR法檢測Hes1基因表達 采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應檢測干擾效率。細胞按照上面優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件進行下一步的轉(zhuǎn)染,分組同上;提取細胞總RNA;按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的反應步驟及反應條件(65 ℃ 5 min, 42 ℃ 60 min, 70 ℃ 5 min)獲得cDNA;熒光定量PCR使用Quantace qPCR Mix的PCR試劑盒,反應液配制按說明書操作,建立RT-qPCR反應體系,RT-qPCR反應條件為: 42 ℃ 60 min; 95 ℃ 10 min; 95 ℃ 20 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 45次循環(huán)。Hes1上游引物序列為5′-AAGAAAGATAGCTCGCGGCAT-3′,下游引物序列為5′-CCAGCACACTTGGGTCTGT-3′;內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′,下游引物序列為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。用2-ΔΔCt值表示 Hes1的mRNA相對表達水平。
4 統(tǒng)計學處理
采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,兩組之間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣品t檢驗,多組之間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,若總體均數(shù)有差異,進行組間的兩兩比較的q檢驗,計數(shù)資料采用行×列表資料的χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
1 CSC對各代細胞形態(tài)的影響
與對照組(正常對照組和乙醇組)相比,CSC誘導P10~P70支氣管上皮細胞的生長速度逐漸加快,以P50和P70細胞變化明顯,細胞體積變大,開始呈復層生長,排列紊亂,細胞群體出現(xiàn)無序的團塊狀或條索狀生長,無明顯的密度抑制和接觸性抑制,見圖1。
2 CSC誘導對各代細胞軟瓊脂細胞集落形成的影響
軟瓊脂集落形成實驗是檢測細胞在雙層軟瓊脂中集落形成的能力,是檢測細胞是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的重要指標。P10和P20細胞的集落形成率較低,P30以后細胞,軟瓊脂細胞的集落形成顯著升高,且所形成的集落形態(tài)明顯增大,以P70細胞的集落形成率最高,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖2。
Figure 1.The images of the cells exposed to CSC in different generations.
圖1 CSC誘導的各代細胞圖
Figure 2.The images of the soft agar cell colony formation experiment for each group (×200).
圖2 各組細胞的軟瓊脂細胞集落形成實驗結(jié)果
3 Hes1 mRNA在CSC誘導各代細胞中的表達
乙醇組、P10、P20、P30、P40、P50、P60和P70細胞Hes1的mRNA表達量較正常對照組高(P<0.01);P20、P30、P40、P50、P60和P70細胞中Hes1的mRNA表達量較P10細胞高(P<0.05)。Hes1的mRNA表達量隨著染毒代數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢,見圖3A。
4 Hes1 蛋白在CSC誘導各代細胞中的表達
Hes1蛋白在9種不同代數(shù)細胞中的表達量之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與正常對照組相比,乙醇組、P10、P20、P30、P40、P50、P60和P70細胞中的Hes1 蛋白表達量升高(P<0.01);與P10相比,P20、P30、P40、P50、P60和P70細胞中的Hes1蛋白表達量升高(P<0.05)。Hes1蛋白表達量隨著染毒代數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢,見圖3B。
Figure 3.The expression of Hes1 at mRNA and protein levels in the BEP2D cells with the malignant transformation at different stages. A: the mRNA expression of Hes1 in the BEP2D cells; B: the results of Western blot and the quantitative analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsP10.
圖3 CSC誘導BEP2D惡性轉(zhuǎn)化不同階段Hes1 mRNA和蛋白表達的變化
5 吸煙對大鼠小氣道黏膜Hes1表達的影響
如圖4及表1所示,正常1、3、6月組大鼠小氣道組織Hes1表達陽性率的差異無統(tǒng)計學意義;煙熏1、3、6月大鼠Hes1表達陽性率的組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),Hes1表達陽性率隨著大鼠煙熏時間的增加而升高。煙熏1月大鼠Hes1表達陽性率與對照組無顯著性差異,而煙熏3、6月大鼠小氣道組織Hes1表達的陽性率顯著高于對照組(P<0.05)。
Figure 4.The protein expression of Hes1 in small airway epithelial cells of the rats with different smoking levels (×400). A: normal group; B: 1-month smoking group; C: 3-month smoking group; D: 6-month smoking group.
圖4 不同煙熏程度的大鼠小氣道上皮細胞Hes1表達
表1 正常及煙熏大鼠不同月份Hes1表達陽性率的比較
Table 1.The positive rate of Hes1 expression in the normal and smoking rats in different months (n=12)
TimeTreatmentHes1positive(%)1monthNormal0(0)Smoking3(25)3monthsNormal1(8.33)Smoking7(58.33)*6monthsNormal3(25)Smoking10(83.33)*
*P<0.05vsnormal.
6 人氣道黏膜中Hes1的mRNA表達水平與吸煙程度的關(guān)系
Hes1的mRNA表達在重度吸煙者明顯高于非吸煙者(P<0.05),見圖5。
7 Hes1蛋白表達與非小細胞肺癌患者吸煙程度的關(guān)系
非小細胞肺癌患者中重度吸煙者的Hes1蛋白表達明顯高于輕度吸煙者,其表達水平與吸煙程度呈正相關(guān)(2=4.583,P<0.05),見圖6。
Figure 5.The mRNA expression of Hes1 in the airway mucosa of heavy smokers and non-smokers. M: marker; 1~10: the group of never smoking; 11~20: the group of severe smoking. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsnever smoking group.
圖5 人重度吸煙者和人非吸煙者氣道粘膜Hes1的mRNA表達
Figure 6.The protein expression of Hes1 in non-small-cell lung cancer patients detected by immunohistochemecal staining and the relationship between the expression level and the degree of smoking. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsnever smoking group.
圖6 Hes1蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達與吸煙程度的關(guān)系
8 DAPT及Hes1-siRNA對CSC誘導的P70細胞增殖和凋亡的影響
10 μmol/L DAPT作用細胞24 h后,細胞的存活率降低(88.90%),且隨著DAPT的濃度升高及作用時間延長,下降越明顯,各組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),50 μmol/L DAPT處理細胞72 h后,細胞的存活率僅為45.67%,見圖7A;集落形成實驗結(jié)果顯示,25 μmol/L DAPT能夠顯著抑制P70細胞的集落形成能力(P<0.01),見圖7B。隨著DAPT濃度和作用時間的增加,P70細胞的凋亡率均逐漸增加,呈濃度和時間依賴性(P<0.05),見圖8。熒光染色結(jié)果顯示,1 μL Lipofectamine 2000配50 nmol/L siRNA的轉(zhuǎn)染效率超過95%,見圖9。MTT法檢測結(jié)果顯示,與control組和siRNA-NC組相比,Hes1基因沉默的BEP2D-P70細胞增殖在24~72 h范圍內(nèi)均受到明顯抑制(P<0.05);Annexin V-PI染色結(jié)果顯示,與control組和siRNA-NC組相比,Hes1基因沉默的BEP2D-P70細胞凋亡明顯增加(P<0.05),見圖10。
Figure 7.The effects of DAPT on the BEP2D-P70 cell viability (A) and colony formation rate (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vs24 h or 48 h;#P<0.05vscontrol.
圖7 MTT實驗和克隆形成實驗檢測DAPT對BEP2D-P70細胞增殖的影響
9 DAPT及Hes1基因沉默對P70細胞Notch1、Hes1和NICD表達的影響
根據(jù)上述細胞增殖及凋亡實驗,為了能夠保持細胞的增殖及藥物作用很好的發(fā)揮,我們選擇DAPT終濃度為25 μmol/L作用細胞48 h。DAPT組中Notch1蛋白的表達高于對照組(P<0.05),而Hes1和NICD蛋白的表達明顯低于對照組(P<0.05),見圖11。與其它處理組比較,siRNA-Hes1組Hes-1的mRNA表達量顯著下降,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖12。
Figure 8.The effects of DAPT on the apoptosis of the BEP2D-P70 cells. A: the BEP2D-P70 cells treated with different concentrations of DAPT for 48 h and the apoptotic rates were analyzed by flow cytometry; B: the BEP2D-P70 cells were treated with DAPT at concentration of 25 μmol/L and the apoptotic rates were analyzed by flow cytometry at different time points. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L;△P<0.05vs25 μmol/L;#P<0.05vs24 h.
圖8 DAPT對BEP2D-P70細胞凋亡的作用呈現(xiàn)濃度和時間依賴性
香煙煙霧不僅可以通過煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)來調(diào)控細胞的增殖與凋亡,而且可以通過促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路、Ca2+通路、Akt信號通路等途徑發(fā)揮促進增殖作用。有研究表明,CSC可誘導正常乳腺上皮細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,增加神經(jīng)纖毛蛋白1(neuropilin-1,NRP-1)的表達[10]。我們前期研究證實CSC可以誘導IκB激酶ε表達,促進支氣管上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化[11],但對于煙草致肺癌的復雜分子機制目前還知之甚少。
Figure 9.Transfection efficiency of siRNA (1 μL Lipo fectamine 2000, 50 nmol/L siRNA) of the cells under fluorescence microscope.
圖9 熒光顯微鏡下細胞的siRNA轉(zhuǎn)染效率
Hes1基 因 定 位 于 3q28-q29, 屬于前神經(jīng)元堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)基因家族,幾乎表達于所有的未分化細胞中[12],與細胞的增殖和分化密切相關(guān)。有研究證實,在T 細胞急性淋巴細胞白血病中,Hes1被異常激活后可通過 PTEN/PI3K/Akt/mTOR 信號通路阻止細胞凋亡[13]。Hes1在口腔鱗癌中的表達高于癌前病變[14]。Hes1能通過抑制cyclin依賴性激酶抑制因子p27Kip1的轉(zhuǎn)錄而促進細胞增殖[15]。已知Hes1是Notch信號通路下游的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,它與Notch信號通路相伴隨共同表達于多個物種。Notch蛋白由胞外區(qū)(Notch extracellular domain,NECD)和跨膜片段(Notch transmembrane fragment,NTM)2 個亞單位組成,在通路激活時腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)換酶切割該蛋白S2 位點,釋放 Notch 蛋白的活化形式NICD,NICD 轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi),通過連接普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子、CBF1等調(diào)控Hes1基因最初的表達[16],Hes1激活后,調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化、遷移、侵襲過程[17]。
Figure 10.The apoptosis (A) and proliferation (B) of BEP2D-P70 afterHes1 gene silencing. Control: BEP2D-P70 cells without transfection; siRNA-NC: BEP2D-P70 cells were transfected with plasmid without Hes1-siRNA; siRNA-Hes1: BEP2D-P70 cells were transfected with plasmid with Hes1-siRNA. Mean±SD.n=3.△P<0.05vssiRNA-NC group.
圖10Hes1基因沉默后BEP2D-P70細胞的凋亡和增殖情況
Figure 11.The protein expression of Notch1, NICD and Hes1 in the BEP2D-P70 cells before and after treated with DAPT. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖11 DAPT作用前后Notch1、NICD和Hes1蛋白表達的變化
Figure 12.The mRNA expression of Hes1 after RNA interfe-rence. Mean±SD.n=3.*P<0.01vssiRNA-NC group.
圖12 RNA干擾Hes1后Hes1 mRNA表達的變化
本實驗模擬了人類吸煙后支氣管上皮細胞向腫瘤細胞演變的歷程,更能貼近吸煙對支氣管、肺長期作用的實際情況。首次探索進行CSC長期誘導實驗,誘導至P70細胞。顯微鏡下觀察到P70細胞體積變大,開始呈復層生長,排列紊亂,細胞群體出現(xiàn)無序的團塊狀或條索狀生長,無明顯的密度抑制和接觸性抑制。經(jīng)過軟瓊脂細胞克隆實驗證實CSC誘導的永生化正常支氣管上皮細胞發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化,表明支氣管上皮惡性轉(zhuǎn)化細胞模型構(gòu)建成功。RT-PCR和Western blot實驗結(jié)果表明,煙草誘導支氣管上皮惡性轉(zhuǎn)化過程中存在Hes1表達上調(diào);煙熏大鼠的氣道粘膜檢測證實隨著大鼠煙熏時間的延長,Hes1蛋白表達呈現(xiàn)增高趨勢;為了進一步證實吸煙對人氣道Hes1表達在吸煙誘導肺癌發(fā)生中的作用,我們采用RT-PCR及免疫組化法分別檢測了重度吸煙程度的正常氣道黏膜組織及NSCLC組織中Hes1的表達情況,結(jié)果顯示重度吸煙人群中氣道黏膜Hes1的表達水平顯著增高,Hes1表達可能與吸煙導致肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。結(jié)合體內(nèi)外實驗結(jié)果,我們推測Hes1可能參與煙草相關(guān)肺癌的發(fā)生。
Hes1是Notch信號通路下游重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,其活化可能與Notch信號通路的活化相關(guān),本研究利用Notch通路阻斷劑DAPT及Hes1-siRNA,結(jié)果均顯示染毒P70細胞的增殖明顯受到抑制,同時凋亡增加;進一步的功能實驗證實,DAPT能夠使染毒P70細胞的集落形成率明顯降低,表明DAPT對細胞的惡性表型有一定的逆轉(zhuǎn)作用,這種作用與下調(diào)Hes1表達,進而抑制細胞增殖、促進細胞凋亡有關(guān)。有研究表明,DAPT特異性較強,治療結(jié)腸癌過程中發(fā)現(xiàn)在有效劑量范圍內(nèi)導致毒副作用的可能性小[18]。同時有研究證實,DAPT或Hes1-siRNA能夠抑制胰腺癌腫瘤干細胞的生長[19]。本實驗結(jié)果為DAPT用于肺癌高危人群的早期干預提供了實驗依據(jù),但Hes1參與吸煙誘導肺癌發(fā)生的具體分子機制尚需要進一步深入研究。
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(責任編輯: 林白霜, 羅 森)
Role of Hes1 in malignant transformation of human bronchial epithelial cells induced by tobacco
HONG Lei1, ZHOU Ji-hong2, LI Wei1, CHEN Yu-qing1, JIANG Peng1, YUAN Na-na1, WANG Xiao-jing1, ZHU Mao-xiang3, YANG Zhi-hua3
(1DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,BengbuMedicalCollege,ProvincialKeyLaboratoryofRespiratoryDisease,Bengbu233004,China;2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BengbuMedicalCollege,Bengbu233002,China;3InstituteofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100850,China.E-mail:bbmccyq@126.com)
AIM: To investigate the role of transcription factor hairy and enhancer of split 1 (Hes1) in the malignant transformation of human bronchial epithelial cell line BEP2D induced by tobacco. METHODS: The BEP2D cells were chronically exposed to cigarette smoke condensate (CSC) at 1 cigarette per L until the 70th generation. The phenotype of malignant transformation of the cells induced by CSC was detected by soft agar clony formation assay. RT-PCR and Western blot were used to determined the expression of Hes1 at mRNA and protein levels in each generation of the cells. The proliferation and apoptosis of the BEP2D cells exposed to CSC were analyzed with the methods of MTT assay, flow cytometry and cell colony formation assay after treatment with Notch pathway bloker DAPT or liposome transfection with Hes1-siRNA. The expression of Hes1 in the peripheral small airway tissues of the smoking rats was evaluated by immunohistochemical staining. The expression of Hes1 in non-small-cell lung cancer and normal airway tissues was also detected by the methods of immunohistochemistry and RT-PCR. RESULTS: The BEP2D cells in the 70th generation had a malignant transformation phenotype. The expression of Hes1 in the BEP2D cells exposed to CSC for different time showed an increa-sing trend. DAPT and liposome transfection with Hes1-siRNA down-regulated the expression of Hes1, inhibited the cell proliferation and induced cell apoptosis. The expression of Hes1 in the airway mucosa of the rats exposed to cigarette smoke for 1 month and 6 months was significantly higher than that in control group. Cigarette smoking induced the expression of Hes1 in lung cancer and normal airway tissues. CONCLUSION: Hes1 may be involved in smoking-induced lung cancer by promoting the imbalance between apoptosis and proliferation.
Lung cancer; Smoking; Transcription factor Hes1; Cigarette smoke condensate
1000- 4718(2017)07- 1153- 10
2016- 08- 25
2017- 04- 19
國家自然科學基金資助項目(No. 81172213);安徽省自然科學基金資助項目(No. 1408085MH14);安徽省高等學校自然科學基金重點項目(No. KJ2016A487);安徽省重點實驗室績效考核補助項目(No. 1506c085013);安徽高校自然科學研究重點項目(No. KJ2017A241)
R730.231; R734.2
A
10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.001
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