浪萬英 王亞軍 宋亞文 張來舉 宋凱

甘肅中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，甘肅 蘭州 730000

目前，骨質疏松癥的發(fā)病率逐年上升，且以其嚴重的臨床癥狀引起醫(yī)學界的廣泛關注[1-3]。醫(yī)學界專業(yè)研究人員致力于探索有效的治療方法來攻克這一臨床難題，主要通過探索西醫(yī)西藥、中醫(yī)中藥的作用機制，尋求最能緩解患者臨床癥狀，解除病痛的治療方法。針灸以獨特的治療優(yōu)勢被廣大患者接受，能有效緩解患者的癥狀{4,5]。為此，臨床科研人員開始對針灸治療骨質疏松癥的效果及其機理進行研究[6,7]。本文研究了電針刺對去卵巢大鼠的全身骨密度及其骨形成和骨吸收活性進行了研究，為電針刺治療骨質疏松癥的效果及其機理的研究提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

電針(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司)；雙能X線骨密度測定儀(美國GE公司)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：199A3)；兔IgG-免疫組化試劑盒SABC即用型(博士德生物工程有限公司，批號：11C31C SA1022)；OPG(ab183910，批號：GR154990-29)；RANKL(ab9957，批號：GR262704-1)；大鼠成骨細胞專用培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CM-R091)；PBS液(北京雷根生物技術有限公司，批號：0111/A16)；通用細胞凍存液(北京雷根生物技術有限公司，批號：0111A16)；過氧化物酶阻斷液(博士德生物工程有限公司，批號：11C17B08)；DAB顯色試劑盒(博士德生物技術有限公司，批號：11B23C22)； 載玻片(中國制造，批號：7105)；顯微鏡蓋玻片(中國制造，批號：10212020C)；針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠，Ф0.35 mm×13 mm)。

1.2 方法

1.2.1骨質疏松癥模型大鼠的制備方法：選取SPF級2月齡SD雌性大鼠40只，隨機分為空白組、模型組、藥物組和電針組，后3組采用手術方法切除雙側卵巢。將大鼠以0.3 mL/100 g的10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，在其最末肋骨下一橫指且旁開脊柱有一小的隆起處，并剃去此處鼠毛，鋪無菌洞巾，以碘酊消毒。切開皮膚、背部肌肉、腹膜，以小鑷子輕輕將白色發(fā)亮脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，便可見到粉色菜花樣卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結扎，然后摘除卵巢。切口縫合后，對皮，碘酊消毒，同法摘除另一側卵巢，造成骨質疏松癥模型大鼠。造模后飼養(yǎng)13 w，檢測骨密度和骨礦物含量。

1.2.2動物分組：空白組：不予任何處理，常規(guī)飼養(yǎng)。模型組：灌服與藥物組同體積的蒸餾水，常規(guī)飼養(yǎng)。藥物組：按照1 mL/100 g標準灌胃給予0.02 mg/mL戊酸雌二醇水溶液(大鼠給藥劑量按照人與大鼠體表面積比值折算而得)[8,9]，1次/1 d，連續(xù)治療5 d，間隔2 d。20 d1療程，治療3療程。電針組：“三陰交”穴位于后肢內踝尖直上10 mm，直刺5 mm；“足三里”穴位于膝關節(jié)下側，腓骨小頭下緣5 mm處，直刺5 mm；“脾俞”穴位于第十一胸椎棘突下旁開1.5寸，直刺5 mm；“腎俞”穴位于第2腰椎棘突下旁開1.5寸，直刺5 mm。以大鼠腳趾中指和同身寸法確定旁開位置和針刺深度剃去背部鼠毛，應用針具及穴位常規(guī)消毒后，用30號0.5寸不銹鋼毫針快速刺入皮下一定深度，接入電針，頻率為2 Hz，斷續(xù)波[10,12]，刺激強度1.0 mA，以局部見肌肉輕微收縮為佳，每次15 min，同時灌服與藥物組同體積的蒸餾水。1次/1 d，連續(xù)治療5 d，間隔2 d。20 d1療程，治療3療程。

1.2.3全身骨密度檢測：治療3個月后，采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉各組大鼠。待至大鼠處于全身迷醉狀態(tài)下(用拇指和食指掐其尾端，如果大鼠沒有甩尾動作，顯示達到最佳測定時段)，將其依次置于骨密度測定儀器。將大鼠置于測定板上，使四肢，尾部全部集中于測定板上，使頭部，軀體和尾部處于測定板的縱端中線上，避免偏移，并使全身處于伸展狀態(tài)。掃描全身，采用計算機顯示大鼠全身骨影像，保存掃描圖片，抄錄檢測數(shù)據[13-15]。

1.2.4大鼠成骨細胞的體外培養(yǎng)：將乳鼠置于75%酒精中浸泡處死，無菌條件下取其顱骨并去除骨膜及結締組織，PBS 清洗3 次； 將骨片剪碎(大小約1 mm×1 mm×1 mm)，轉移至培養(yǎng)瓶中，0.25%胰酶消化2 次(37℃，每次10 min)，棄去上清液，0.1% 的Ⅱ型膠原酶消化10 min，棄上清；再用0.1% 的Ⅱ型膠原酶消化4 次(37℃，每次20 min)，收集合并上清液，加入5 mL 含血清的培養(yǎng)基中止酶消化，150 目濾網過濾3次，1 000 r /min 離心10 min；棄上清，加入培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基，內含10% PBS)，吹打均勻并計數(shù)。原代細胞懸液以3×104/mL 接種于大皿(Nunc) 中培養(yǎng)，每皿10 mL，37 ℃、5% CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每3 d換液1 次。待細胞鋪滿80%培養(yǎng)皿后進行爬片培養(yǎng)。

1.2.5成骨細胞的血清處理方法：采用10%水合氯醛(0.03 mL/100 g)麻醉各組大鼠，待大鼠麻醉充分后，用5 mL真空采血針對準心臟部位扎取一定量血清，冷置1 h，離心(2 500 r/min，25 min)，棄去沉淀物，保留上層血清。將上層血清采用56℃水浴滅活30 min，并用0.22 um的濾網抽濾除菌。將各組制備血清依10%的比例加入爬片培養(yǎng)的成骨細胞3 d后，4%多聚甲醛固定10 min。采用免疫細胞化學染色法處理各組細胞爬片，并通過圖像分析處理軟件選取恰當視野，提取灰度值，結果采用積分光密度(IOD)表示。

1.2.6免疫細胞化學染色方法：各組成骨細胞經4%多聚甲醛固定10 min后，PBS清洗3次(每次3 min)，0.1% Triton X-100透膜10 min，清洗3次后加入30% H2O2滅活內源性過氧化物酶。蒸餾水清洗3次，加入BSA封閉20 min，清洗后加入OPG 和RANKL一抗(1∶500稀釋)，4℃過夜處理。PBS清洗3次(每次3 min)，滴加生物素化二抗，37℃孵育20 min，PBS清洗3次(每次3 min)，滴加SABC試劑并37℃孵育20 min，PBS清洗3次(每次3 min)。使用DAB顯色后流水清洗，乙醇梯度脫水，樹脂封片，拍照采集照片。通過圖像分析處理軟件選取恰當視野，采用Image-Pro Plus 6.0掃描光密度(IOD)。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 大鼠全身骨密度BMD檢測結果

如表1所示，與空白組相比，模型組骨密度顯著降低(P<0.05)，說明去卵巢骨質疏松大鼠模型建立成功。經過藥物或針刺處理后，骨密度顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2 大鼠全身骨礦物含量BMC檢測結果

如表2所示，與空白組相比，模型組骨礦物含量顯著降低(P<0.05)，說明去卵巢骨質疏松大鼠模型建立成功。經過藥物或針刺處理后，骨礦物含量顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠全身BMD比較Table 1 Comparison of the whole body BMD in

注：*與空白組比較，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。
**與模型組比較，P<0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。

表2 各組大鼠全身BMC含量的比較Table 2 Comparison of the whole body

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.01

2.3 大鼠血清處理后成骨細胞OPG蛋白表達結果

如圖1、2所示，空白組OPG表達量最高，模型組最低，經過藥物或針刺處理后，OPG表達顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 大鼠血清處理后成骨細胞OPG蛋白表達Fig.1 The expression of osteoblasts OPG protein after processing of rat serum

圖2 大鼠血清處理后成骨細胞OPG蛋白表達與模型組比較，**P<0.01Fig.2 The expression of osteoblasts OPG protein after processing of rat serum

2.4 大鼠血清處理后成骨細胞RANKL蛋白表達結果

如圖3、4所示，空白組RANKL表達量最低，模型組最高，經過藥物或針刺處理后，RANKL表達顯著下降，與模型組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖3 大鼠血清處理后成骨細胞RANKL蛋白表達Fig.3 The expression of osteoblasts RANKL protein after processing of rat serum

圖4 大鼠血清處理后成骨細胞RANKL蛋白表達與模型組比較，**P<0.01Fig.4 The expression of osteoblasts RANK protein after processing of rat serum

3 討論

以往一系列實驗[16-18]都對骨質疏松大鼠有關于骨質變化的各項指標進行了詳細的研究，結果均表明：針灸在骨質疏松癥的預防或是治療方面均能起到良好改善作用。本實驗結果提示：針刺治療骨質疏松癥可能是通過調控成骨細胞內OPG、RANKL蛋白的表達，從而調節(jié)OPG-RANKL-RANK信號通路，以此調節(jié)破骨細胞骨破壞和成骨細胞骨重建系統(tǒng)的平衡，達到預防和治療骨質疏松癥的效果，亦進一步證實臨床上采用針灸治療多種原因導致的骨質疏松癥均能取得良好效果的實踐經驗。

中醫(yī)認為，腎主骨生髓，脾主四肢肌肉，肝主筋。如《素問·六節(jié)臟象論》記載“腎者,封藏之本,精之處也,其華在發(fā),其充在骨?！笨梢姡I中精氣能夠化生為營養(yǎng)物質，潤養(yǎng)全身骨骼，保證骨骼的正常生長代謝。同時，腎中精氣的后天充養(yǎng)有賴于后天脾胃的不斷補充才能延續(xù)生命。如《素問·生氣通天論》云“是故謹和五味,則骨正筋柔,氣血以流,胰理以密,如是則骨氣以精,謹?shù)廊绶?長有天命?！痹僬?，中醫(yī)理論認為肝氣的條達、順暢有助于脾胃的正常運化，從而腐熟水谷等精微物質，不斷補充、滋養(yǎng)先天之臟。如《素問·上古天真論》云“肝氣衰則筋不能動”；《經脈別論》曰“食氣入胃,散精于肝,淫氣于筋”。所以本研究依據動物實驗針灸學選取了與肝脾腎三臟聯(lián)系最為密切的穴位，同時設立陽性藥物組與之作對比。研究結果進一步證實了以往研究結果：藥物和電針治療去卵巢大鼠骨質疏松癥均能取得療效，但是單純電針和藥物療效相比，前者略微較后者好。該研究為針灸學術界再添一項具有說服力的結果，亦能更好地為臨床采用針灸推拿治療骨質疏松癥提供事實依據。同時，希望該研究領域的研究人員能更一步深入探索運用針灸骨質疏松癥的實質性內容[19-21]。