李天清 王軍 馮亞非 張揚 馬真勝 嚴亞波 雷偉

第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院骨科，陜西 西安 710032

隨著顯微成像技術(包括μCT，μMRI)廣泛應用于實驗研究和臨床初期研究，研究者們已經能夠獲得骨骼的微觀三維空間結構。通過μCT采集后的數據，可以保存為標準的醫(yī)學數字通信圖像格式(the digital imaging and communications in medicine，DICOM)。圖像為斷層圖像格式，層與層之間間隔一定距離(層距)。通過閾值分割，提取出μCT圖像中的骨骼部分。計算松質骨的結構學指標。傳統(tǒng)的參數評價方法主要評估：骨體積分數(BV/TV)，骨表面積體積比(BS/BV)，骨小梁平均寬度(Tb.Th)，骨小梁數量(Tb.N)，骨小梁平均間隙(Tb.Sp)等。顯微CT(micro computer tomography，μCT)掃描結合顯微有限元(large-scale finite element, LSFE)模型是一種無創(chuàng)的在體檢測骨生物力學特性的手段[1]，可以用來輔助骨質疏松骨折風險預測和評價藥物治療效果。然而，目前關于準確測量松質骨的結構參數和在臨床實踐中應用結構參數的研究很少。本研究的目的是探討人體脊柱松質骨骨骼顯微結構和力學性能的區(qū)域性差異。

本研究采集了6具人體頸椎椎體松質骨標本，進行顯微CT掃描后，應用結構參數測量、顯微有限元分析、力學參數計算方法，研究人椎體內解剖部位對于結構參數和力學參數測量結果的影響。

1 材料和方法

1.1 標本制備

采集6個人頸椎C5椎體標本(表1)。標本來自第四軍醫(yī)大學解剖學教研室。在進行μCT掃描前，通過對標本進行篩查排除可能的代謝性骨病、骨腫瘤。拍攝X線平片，以確保沒有骨骼損壞或者其他骨病。應用口腔鋸切除側塊和后方結構(包括椎弓根、橫突、后弓、棘突，圖1)。

表1 標本年齡和性別Table 1 The age and sex of the specimen

圖1 椎體分離過程 Fig.1 The separation process of vertebral bodyA.頸椎椎體的分離；B.第五頸椎；C和D:切除后方結構的示意圖。

1.2 μCT掃描

椎體放置在圓形的掃描杯中，周圍用泡沫塑料填充，以防止在掃描過程中標本移動。在第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院全軍骨科研究所，應用臨床前圓錐光束CT掃描儀(Healthcare Explore Locus, GE Medical Systems, Milwaukee, USA)進行μCT掃描。該μCT是一個基于CCD的攝像頭，通過固定的角速度采集平片圖像。其旋轉角度因掃描方式的不同而變化，一般為180°到360°。掃描儀的視窗為一個邊長為4 cm的立方體。調整標本在掃描儀中的位置，確保整個標本落入視窗范圍內。掃描參數包括：①球管電壓為80 kV；②電流為250 μA；③快門速度為2500 ms；④重建因子為2；⑤旋轉角度為180°。在進行濾波和空氣校正后，應用濾波反向投影算法進行重建，重建結果為立體分辨率為42 μm的圖像。

圖2 μCT掃描后選擇ROI并進行三維重建Fig.2 ROI selection and three-dimensional reconstruction after CT scanA.μCT下椎體的矢狀位切片；B.ROI；C和D.ROI的三維重建圖

1.3 椎體子區(qū)域提取結構參數

對掃描所得的μCT圖像進行三維重建后，每個椎體的幾何結構被劃分為12個邊長為4.6 mm的立方體子域。每個椎體子域的編號方法如圖3所示。依據位置的不同，12個子域被劃分為6個不同的位置組，每個位置組中包含不同的子域。6個位置組包括外側子域組(包括5、6、11、12子域)，內側子域組(包括1、2、3、4、7、8、9、10子域)，腹側子域組(包括1、3、7、9子域)，背側子域組(包括2、4、5、6、8、10、11、12子域)，頭側子域組(包括1、2、3、4、5、6子域)，尾側子域組(包括7、8、9、10、11、12子域)。

在圖像處理領域，Nyquist采樣率規(guī)定了圖像樣本的最低空間采樣率。依據Nyquist采樣率法則，樣本體積至少是所要采取的目標樣本的最小特征的2倍。在松質骨，骨骼的最小特征是由兩個結構參數來表達的，包括模型的骨小梁厚度和骨小梁分割度(Tb.Th和Tb.Sp)，因此子域的最小尺寸應該是2倍的Tb.Th+Tb.Sp長度。依據Hildebrand等的研究結果，Tb.Th和Tb.Sp的平均值分別為0.3 mm和0.8 mm。因此，在本研究中，掃描分辨率42 μm時，子域的一邊長度包括110個體素(對應為4.6 mm)，大約包含4個Tb.Th和Tb.Sp。

1.4 結構參數和個體化骨小梁分割方法

松質骨標本的結構參數包括骨體積分數BV/TV、骨表面積體積比(BS/BV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)，在本試驗中應用μCT自帶的軟件MicroView (Healthcare Explore Locus, GE Medical Systems, Milwaukee, USA)來測量這些標準參數。

個體化骨小梁分割方法(individual trabeculae segmentation, ITS)是用來從μCT掃描得到的三維圖像中提取出單個骨小梁，分析不同的骨小梁結構類型(板狀或者桿狀)對整個組織結構的貢獻。在松質骨中，板狀骨小梁和桿狀骨小梁是決定松質骨力學特點的兩種重要的顯微結構特征。ITS方法可以用來評價子域中的骨小梁方向和結構特點。ITS方法最早由哥倫比亞大學的Liu等[2]提出，在本研究中，我們用17個松質骨結構參數來評價每個子域的骨小梁結構。子域的骨骼分割方法應用大津法[3]所獲得全局閾值。如前所述，大津法是目前最成熟、應用最廣的圖像分割方法。在圖像提取完后，應用ITS方法(ITS, Columbia University, Milwaukee, USA)計算子域的結構參數。本方法中，關于每個參數的計算方法見表2。

圖3 頸椎椎體子域編號方法Fig.3 Regional numbers of the cervical vertebral bone

1.5 顯微有限元模型計算的正交各向異性的彈性模量

應用Simpleware(Simpleware Ltd., Exter, UK)軟件將子域的每個體素直接轉化為8節(jié)點6面體單元。設置松質骨的組織屬性是各項同性的，線性彈性材料，其彈性模量為15GPa，泊松比為0.3.應用ANSYS(ANSYS Inc., Canonsburg, PA, USA)軟件中的預設共軛梯度求解器(preconditioned conjugate gradient solver, PCG)求解。每個模型進行6次仿真計算，沿著3個正交軸(x軸, y軸和z軸)模擬3個軸向壓縮實驗和3個剪切試驗。從模擬壓縮試驗中，可以得到一般各向異性材料的剛度矩陣，然后通過優(yōu)化方法來計算材料的最佳正交軸。通過將各向異性剛度矩陣轉換一定的角度獲得正交矩陣。整理彈性模量和剛度矩陣，在本研究中，Eyy代表最低軸向模量的方向，Ezz代表最高軸向模量的方向。然后從正交矩陣中，計算出正交彈性張量的3個彈性模量(Eyy，Exx，Ezz)和3個剪切模量(Gxy,Gxz,Gyz)。

表2 ITS方法計算的17個結構參數的描述和算法Table 2 Characterizations of the 17 parameters calculated with ITS method

1.6 統(tǒng)計學處理

應用配對t檢驗比較結構參數和松質骨的表觀剛度在不同部位的差異，以P<0.05為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

從表3 來看，腹側和背側的結構參數僅有rBV/TV、R-R junc、tBV/TV存在差異，外側和內側的結構參數僅有pTb.Th、rTb.Th、P-P Junc、R-P Junc、lBV/TV不存在差異，頭側和尾側的結構參數均存在明顯差異。代表骨質增多的指標，在尾側均大于頭側，比如BV/TV、rBV/TV、pBV/TV、Tb.Th、Tb.N。

從表4來看，腹側和背側的表觀彈性模量沒有差異，表觀剪切模量存在差異；外側和內側的表觀彈性模量在非主方向上存在顯著差異，在主方向上無顯著差異，表觀剪切模量無顯著差異；頭側和尾側的表觀彈性模量在主方向上存在顯著差異。

表3 頸椎椎體松質骨不同解剖部位的結構參數及差異Table 3 Microarchitectural parameters of different anatomical regions in the cervical vertebral bone

表4 不同解剖部位的表觀彈性模量及差異Table 4 Apparent elastic modulus values of different anatomical regions in the cervical vertebral bone

3 討論

在本研究中，我們探討了在人體椎體松質骨中，結構參數和表觀強度在不同解剖部位的差異。發(fā)現(xiàn)這些指標均在頭側和尾側有顯著性差異。說明結構參數和表觀強度在人體脊柱的椎體松質骨存在顯著的區(qū)域性差異。而常規(guī)的文獻報道只是模糊的報道了某個解剖部位的μCT研究。在本研究中，應用顯微CT研究了常規(guī)的5個結構參數和17個應用ITS方法測量的特殊結構參數在人體頸椎不同解剖部位的差異。我們主要的結果是：①在頸椎椎體松質骨，頭側和尾側的結構參數均存在顯著差異，其余部位的結構參數無顯著差異。②在頸椎椎體松質骨，頭側和尾側的表觀彈性模量在主方向上存在顯著差異；此外外側和內側的表觀彈性模量在非主方向上存在顯著差異，在主方向上無顯著差異，表觀剪切模量無顯著差異。

本研究中觀察到，頭側和尾側的結構參數和力學參數的區(qū)別均有統(tǒng)計學意義。頭-尾方向是椎體松質骨承受載荷的主要方向[4]。也是骨小梁分布的主要方向。在椎體的頭側或者尾側采樣會導致測量結果的顯著不同。這個差異在臨床應用中具有實際的指導意義，提示在影像學檢查或者活檢采樣中應該盡量采集沿頭-尾側長度的樣本。如果采集的樣本尺寸過小，不能同時覆蓋頭側和尾側的組織，可能會帶來較大的采樣誤差。

對這種區(qū)域性差異的一種合理的解釋就是局部的生物力學環(huán)境的不同。尤其是對于椎體松質骨部分。在日程生活中，人體無論在運動或者靜止的狀態(tài)下，負載主要沿著椎體部分垂直傳播。因此，越靠近尾側的松質骨，承受的壓力負載越大。依據Wolff定律：骨質量和結構總是適應力學載荷的形式[5]。此外，骨小梁的結構參數與組織水平的力學屬性相一致[6]。因為椎體的骨小梁部分大約承受60%的軸向載荷，骨小梁結構也與周圍的局部環(huán)境相適應。事實上，在尾側區(qū)域的骨小梁的厚度更大，其孔隙率更小，密度更大，各向異性更大。這個研究結果也與腰椎的研究結果相似[7]。

與一般的總體的顯微結構研究相比，關于顯微結構區(qū)域性差異的分析也具有重要的應用價值。例如，在典型的椎體軸向暴力導致的爆裂性骨折中，應力沿著椎體向下傳遞，從而導致在椎體的薄弱部位產生高的應變能密度[8]。這個與本研究顯微結構的研究結果相吻合。尤其對于老年女性，骨折多發(fā)生于骨骼結構比較薄弱的部位[9]。局部骨骼屬性的區(qū)域差異性分析結合動力學分析，可以為骨折的預防方法提供重要參考。

本研究表明骨骼結構在空間上不是均勻分布的。在尾側有較優(yōu)的結構參數和較高的彈性模量。隨著年齡的增大，松質骨結構逐漸疏松，這種差異會變得更加明顯。這種情況在絕經后的女性可能更加嚴重，因為雌激素水平的降低會導致骨量丟失，反映在μCT上就是BV/TV、 Tb.Th和Tb.N的降低和Tb.Sp的增高[10]。我們的研究結果與之前Ito等[11]發(fā)表的動物實驗的研究結果一致。

本研究的局限性在于對子域的劃分具有隨意性。但是，由于人體的椎體松質骨是正交各向異性的，因此這個劃分方法與解剖系統(tǒng)和人體的載荷方位相一致。測量的部位從椎體的核心向周圍擴展，這么做的主要目的是盡量選擇松質骨而不會接觸到皮質骨殼而造成誤差。我們下一步的研究希望能夠建立一個松質骨結構參數和力學參數之間的關系，并研究這個關系的區(qū)域性差異，為臨床診斷和活檢提供進一步參考。