惠亞玲 何勇 郭麗

1.武警工程大學(xué)武警醫(yī)院急診科，陜西 西安 710032 2.武警工程大學(xué)武警醫(yī)院口腔中心，陜西 西安 710032 3.西安市第九人民醫(yī)院口腔科，陜西 西安 710038

骨質(zhì)疏松具有較高的發(fā)病率，尤其是女性絕經(jīng)后因雌激素的缺乏可導(dǎo)致每年骨量丟失達(dá)到3%～5%，嚴(yán)重影響中老年女性患者的生活。骨質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的變化是骨髓干細(xì)胞生物學(xué)活性變化的結(jié)果。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 是目前研究較多的成體干細(xì)胞之一，在適宜的誘導(dǎo)下具有向骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)等多向分化潛能，也是組織工程中較理想的種子細(xì)胞[1,2]。

大量資料提示雌性大鼠去除卵巢后機體雌激素和骨密度將迅速下降，在短時間內(nèi)極好地模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis postmenopausal，OPM)的病理生理變化，是較為理想的動物觀察模型[3]；有學(xué)者發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松對頜骨的影響在程度和時效上均弱于全身其他骨骼[4]，這種差異是否也表現(xiàn)在干細(xì)胞的生物學(xué)活性尚不確切。本實驗通過構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型進(jìn)行頜骨和股骨來源的BMSCs增殖和成骨分化能力的比較研究，旨在觀察骨質(zhì)疏松對不同部位骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和材料

1.1.1實驗動物：健康雌性未孕SD大鼠40只(購于第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心)，18 w齡，體質(zhì)量(160.12±7.12) g，同等條件下分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w 后，隨機分為對照組及實驗組。實驗過程嚴(yán)格遵照第四軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會準(zhǔn)則。

1.1.2實驗試劑及儀器：DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；地塞米松(Sigma，美國)；L-谷氨酰胺(Gibco, 美國)；抗壞血酸(Sigma，美國)；0.25%胰蛋白酶(Amresco，美國)；青、鏈霉素(Gibco，美國)；CCK-8 檢測試劑盒 (博士德生物工程有限公司，武漢)。

超凈工作臺(蘇州 SW-CJ-1SD)；酶聯(lián)免疫檢測儀(南京華東DG5032)；二氧化碳恒溫孵箱(Forma，美國)；離心機(Kubota，日本)；六孔培養(yǎng)板(Nunc公司, 美國)；96孔培養(yǎng)板(Nunc公司, 美國)；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)((Olympus,日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型的建立：清潔級SD大鼠20只，經(jīng)2%戊巴比妥鈉麻醉腹腔注射麻醉生效后，消毒鋪巾, 自背部切開，完整摘除雙側(cè)卵巢，關(guān)閉術(shù)區(qū)。術(shù)后定量喂食, 自由飲水, 飼養(yǎng)溫度20～25℃, 相對濕度為40%～70%。

1.2.2實驗分組：16只未去卵巢大鼠和術(shù)后10 w建模成功的16只去卵巢大鼠分成4組各8只分別用于提取原代頜骨及股骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。4只未去卵巢大鼠用于體內(nèi)實驗。

1.2.3大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分離及培養(yǎng)：采用全骨髓貼壁法分別培養(yǎng)去卵巢大鼠和健康大鼠的頜骨骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(mBMSCs)和股骨骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(fBMSCs)。大鼠處死后即刻浸泡于75%乙醇中10 min，于超凈工作臺下剝離下頜骨，拔出牙齒，暴露骨髓腔；切取雙側(cè)股骨，清理骨表面組織，去除股骨兩端，露出骨髓腔，用DMEM 培養(yǎng)基經(jīng)2 mL注射器反復(fù)沖洗骨髓腔，轉(zhuǎn)移沖洗液至離心管中，1000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)離心2次，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基輕輕吹打制備單細(xì)胞懸液，并接種于60 mm2培養(yǎng)皿中，標(biāo)記，于37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)48 h，貼壁細(xì)胞即為BMSCs，原代細(xì)胞鋪滿瓶底約85%時即常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.4骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖能力

1.2.4.1CCK-8 實驗：調(diào)整四組第二代細(xì)胞以每孔100 μL，2×103個/孔密度接種于96孔板，各組分別于接種后第1、3、5、7d加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育4 h后酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度。操作嚴(yán)格按照CCK-8試劑盒的步驟說明進(jìn)行。

1.2.4.2MTT分析：將四組干細(xì)胞分別以2×103/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，按0.2 mL/孔加入培養(yǎng)液，37℃下5%CO2孵箱中連續(xù)培養(yǎng)7d，隔日換液。連續(xù)6 d每組每日定時測量6個孔，加入20 μL 5 mg/mL的MTT液，繼續(xù)孵養(yǎng)4 h。去除孔內(nèi)培養(yǎng)液上清液，每檢測孔加入150 μL的DMSO，低速震蕩10 min，確保結(jié)晶物充分融解。酶聯(lián)檢測儀測量490 nm波長處各孔吸光度(OD)，分別以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.5骨髓基質(zhì)干細(xì)胞膜片的制備與體內(nèi)移植

1.2.5.1體內(nèi)異位移植實驗：將增殖狀態(tài)良好的第3代BMSCs胰酶消化5 min，調(diào)整細(xì)胞懸液密度，以5×105個數(shù)量分別均勻接種于直徑90 mm培養(yǎng)皿，加入10 mL DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS、50 μg/mL 抗壞血酸)，隔日換液，連續(xù)孵育10 d后培養(yǎng)皿出現(xiàn)底部貼合緊密，邊緣微卷的乳白色膜樣物質(zhì)，此即為成熟的BMSCs單層細(xì)胞膜片。

1.2.5.2體內(nèi)異位移植實驗：A 網(wǎng)膜下移植：4只SD大鼠經(jīng)2%苯巴比妥鈉麻醉，固定、腹部脫毛、消毒鋪巾，腹部橫切口暴露大網(wǎng)膜，于網(wǎng)膜中份分離兩層網(wǎng)膜制備移植囊，分別將4種干細(xì)胞膜片與TCP復(fù)合置于植床內(nèi)，適度內(nèi)折固定，復(fù)位網(wǎng)膜，關(guān)閉創(chuàng)口。B 組織學(xué)評價：觀察6 w處死動物，完整切取移植物，10%福爾馬林固定，沖洗，脫鈣，系列脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型

本組20只去卵巢大鼠因4只出現(xiàn)手術(shù)并發(fā)癥先后死亡，其余16只大鼠在去卵巢后體質(zhì)量2w內(nèi)平均增加37+8.1g，術(shù)后8w時經(jīng)股骨骨密度檢測顯示BMD平均降低了97%，證實了模型的建立。

2.2 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察

本實驗健康及骨質(zhì)疏松狀態(tài)下原代BMSCs均貼壁迅速，二者貼壁速度及形態(tài)學(xué)特征均未見顯著性差異。4組細(xì)胞接種6 d后倒置相差顯微鏡下均分布較為均勻，貼壁細(xì)胞形態(tài)呈多樣化，以紡錘形為主，短梭形、多角形、星形等均可察見。8d后可見梭形細(xì)胞呈漩禍狀集落生長，其間散在少許圓形細(xì)胞，集落間呈現(xiàn)融合趨勢。頜骨和股骨BMSCs間以及健康與骨質(zhì)疏松狀態(tài)下BMSCs間細(xì)胞貼壁及增殖速度未見明顯差異，傳代后4類細(xì)胞均生長均勻，胞體明顯增加，傾于均一的長梭形。

2.3 4種骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖情況

采用CCK-8法檢測OD值，比較不同部位及全身骨狀況對BMSCs的影響，結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，BMSCs的增殖活性呈升高趨勢；骨質(zhì)疏松狀態(tài)下頜骨及股骨BMSCs的增殖速度初期與健康狀態(tài)下的細(xì)胞無顯著性差異(P>0.05)，3d后增殖速度則逐漸緩慢于健康組(P<0.05)；健康組頜骨和股骨不同部位間兩種BMSCs的OD值比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，骨質(zhì)疏松狀態(tài)下頜骨來源BMSCs后期的增殖能力明顯優(yōu)于股骨來源的BMSCs(P<0.05)。見圖1。

2.4 MTT分析

4組細(xì)胞不同時間段的單因素方差分析結(jié)果顯示，去卵巢組在同等時間條件下與未去卵巢組比較，1d時總體均數(shù)差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義，2d后各時段均數(shù)差異具有顯著統(tǒng)計學(xué) 意義(P<0.05)。由此可見，骨質(zhì)疏松對BMSCs的增殖的影響具有時間依賴性。頜骨和股骨BMSCs在健康骨質(zhì)環(huán)境下，細(xì)胞的OD值各時間段均未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，骨質(zhì)疏松狀態(tài)下頜骨的增殖速度初期與股骨BMSCs無顯著性差異(P>0.05)，48h后增殖速度則逐漸快于對照組(P<0.05)；提示骨質(zhì)疏松對BMSCs的增殖可能存在著部位因素影響。見表1。

表1 不同部位及骨質(zhì)狀況培養(yǎng)的BMSCs的吸光度(OD)值Table 1 Optical density of cultured BMSCs in different location and bone condition

注：去卵巢組內(nèi)比較，aP<0.05；去卵巢股骨BMSCs與未去卵巢股骨BMSCs比較，bP<0.05；去卵巢頜骨BMSCs與未去卵巢頜骨BMSCs比較，cP<0.05； 未去卵巢股骨BMSCs 與去卵巢頜骨BMSCs比較，dP<0.05

2.5 不同來源BMSCs細(xì)胞膜片的性能

4類細(xì)胞采用低密度接種法均能獲取骨髓基質(zhì)干細(xì)胞膜片，膜片的成熟時間為7～10 d，去卵巢組BMSCs的成膜及成熟時間略慢于未去卵巢組。動態(tài)觀察顯示，從成骨誘導(dǎo)第三天開始就能觀察到細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，相對而言未去卵巢組BMSCs基質(zhì)分泌量及分布較骨髓基質(zhì)干細(xì)胞更為迅速、均勻，后期鏡下觀察未見顯著差異。4種膜片隨孵育時間增長，細(xì)胞外基質(zhì)大量分泌，細(xì)胞極性化排列更為整齊緊密、胞體更豐滿，細(xì)胞的梭形外形變得相對圓潤，細(xì)胞突起伸展自然且完整，細(xì)胞間有序地連接，細(xì)胞復(fù)層化趨勢更為明顯。成熟的膜片厚度上未見明顯差異，剝離后均能迅速收縮。

4種膜片的大網(wǎng)膜移植結(jié)果，顯示體內(nèi)移植6w后，在TCP誘導(dǎo)下均可形成不均質(zhì)的礦化物沉積和纖維樣組織穿通，似牙周膜/牙骨質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)；去卵巢組BMSCs膜片組再生的纖維束更為粗大，走形不一致，僅見少量的礦化物質(zhì)的生成，頜骨來源BMSCs組較股骨來源BMSCs再生礦化物能力強；未去卵巢組頜骨來源BMSCs組較股骨來源BMSCs組纖維穿通性更明顯，表面礦化沉積更均衡，有滿意的牙骨質(zhì)/牙周膜樣復(fù)合體的形成(見圖2)。

圖1 不同部位及骨質(zhì)狀況對BMSCs增殖能力的影響Fig.1 The effect different location and bone condition on the proliferation of cultured BMSCs

3 討論

骨質(zhì)疏松是一種以骨量減少為特征的骨代謝性疾病，其發(fā)病因素眾多,各種誘因?qū)е碌牟±須w宿均為骨組織成骨能力弱于破骨能力、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨量丟失、骨強度下降，增加患者骨折的風(fēng)險[5-7]。骨組織的健康是骨形成與骨吸收之間動態(tài)平衡的結(jié)果，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的生物學(xué)活性及狀態(tài)直接影響著骨組織的轉(zhuǎn)歸。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于全身骨髓組織和松質(zhì)骨內(nèi)，作為成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有成骨、成脂、成軟骨等多向分化能力，對于調(diào)控骨吸收和骨形成的相對平衡起著至關(guān)重要作用[8,9]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的深入運用，大量資料證明BMSCs的異常表現(xiàn)與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病密切相關(guān)。干細(xì)胞的生物學(xué)活性極大程度上受骨髓局部微環(huán)境的調(diào)控，機體激素水平、營養(yǎng)狀況以及局部應(yīng)力和炎癥變化等因素均可使微環(huán)境中細(xì)胞因子發(fā)生改變，繼而通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的生存時間及狀態(tài)來適應(yīng)內(nèi)環(huán)境的變化，當(dāng)BMSCs的功能異常導(dǎo)致骨吸收-骨形成的偶聯(lián)失調(diào)時將導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生[10,11]。對OPM的BMSCs生物學(xué)狀態(tài)的研究尚存爭議，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)OPM患者BMSCs對成骨誘導(dǎo)分化的敏感性和鈣沉積程度均明顯下降；也有學(xué)者觀察到OPM患者因雌激素缺乏，BMSCs的多向分化和增殖能力適應(yīng)性增強以滿足骨吸收而代償性地增加骨形成，進(jìn)而導(dǎo)致骨重建的失衡。這些研究結(jié)果均提示在骨質(zhì)疏松狀態(tài)下BMSCs的生物學(xué)活性異常，其活性對于疾病的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸具有重要意義。

膜片技術(shù)通過細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積進(jìn)而有序地將細(xì)胞連接成一種不需要外源性材料，完全由細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)組成的片狀結(jié)構(gòu)。膜片內(nèi)這些精細(xì)構(gòu)建的復(fù)雜的信號及結(jié)構(gòu)系統(tǒng)可以提高細(xì)胞的生物學(xué)活性，更便于對干細(xì)胞的生長、發(fā)育及分化過程進(jìn)行全方位的調(diào)控及干預(yù)，是干細(xì)胞移植定向分化的一個重要的研究方向[12]。

目前關(guān)于骨質(zhì)疏松對全身骨組織和口腔骨組織的影響是否具有差異性尚存爭議，但多數(shù)數(shù)據(jù)顯示由雌激素缺乏所引起的骨質(zhì)疏松對全身骨組織與頜骨的作用是不同步的，頜骨結(jié)構(gòu)在骨質(zhì)疏松早期尚無明顯改變，相對滯后于全身骨組織[13]。頜骨發(fā)育于顱神經(jīng)嵴源外胚間充質(zhì)，具有獨特的膜內(nèi)成骨機制，這些資料均提示頜骨來源的BMSCs具有BMSCs的生物學(xué)特性，但依然可能存在著一定的部位差異性。本組將4種細(xì)胞膜片與骨替代物的異位移植擬觀察四種BMSCs在成骨分化方面的性能差異，結(jié)果顯示頜骨來源的BMSCs能夠形成不均質(zhì)的礦化物沉積和纖維樣組織穿通，再生類牙周膜/牙骨質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)的能力較股骨來源的BMSCs相對較強，這證實了BMSCs分化潛能的區(qū)域性，頜骨來源的BMSCs傾向于向頜面部組織細(xì)胞分化，更有利于牙源性組織工程的應(yīng)用。在礦物質(zhì)的誘導(dǎo)下骨質(zhì)疏松狀態(tài)的股骨來源的BMSCs的成骨活性有所降低，移植6w未見顯著的礦物質(zhì)沉積，僅有大量的無序的成纖維組織的再生，但在同等骨條件下其頜骨來源的BMSCs依然表現(xiàn)出一定的成骨分化能力；細(xì)胞實驗也提示健康和去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)未見形態(tài)學(xué)的顯著差異；但BMSCs的增殖實驗發(fā)現(xiàn)接種初期去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠與健康狀態(tài)下的細(xì)胞增殖速度無顯著性差異，隨培養(yǎng)時間的延長，各類BMSCs的增殖活性均出現(xiàn)顯著差異性，骨質(zhì)疏松狀態(tài)下干細(xì)胞的活性顯著弱于健康組，但骨質(zhì)疏松狀態(tài)下頜骨來源的干細(xì)胞后期的增殖能力雖然較健康組有所減弱，但明顯強于股骨來源的BMSCs，本組結(jié)果部分印證了上述研究，但這是否提示骨質(zhì)疏松狀態(tài)下頜骨來源的BMSCs的生物學(xué)活性受影響的程度相對較小，尚待進(jìn)一步探討。