鄭錦暢 康銀輝 魏波 祝兆波 王朝軍 林顥 李廣盛 郭偉雄 荊凱鵬 孫欣 彭智恒

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科中心，廣東 湛江 524001

糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids, GCs)被廣泛用來治療過敏性、自身免疫性和炎癥性疾病，但長時間應(yīng)用會不同程度的引起骨量丟失，甚至?xí)l(fā)生骨壞死[1,2]。這可能與激素抑制成骨細(xì)胞的分化、增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞的凋亡等相關(guān)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)激素作用后的股骨頭內(nèi)骨細(xì)胞胞質(zhì)中有大量的脂質(zhì)沉積[4,8]。是何種原因?qū)е略摤F(xiàn)象發(fā)生，目前尚無明確解釋，為闡明這一現(xiàn)象本文擬用皮質(zhì)酮以不同濃度、時間作用于成骨細(xì)胞，觀察細(xì)胞中脂質(zhì)沉積現(xiàn)象及脂質(zhì)合成相關(guān)基因與下游酶的表達(dá)特點(diǎn)，從而分析可能機(jī)制的所在。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：新生24 h內(nèi)SD胎鼠，購于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

1.1.2主要藥物及試劑：皮質(zhì)酮(日本梯希愛)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR?Green qPCR熒光染料(大連寶生物公司)；SDS(Sigma公司)；Tweenn20(BIOSHARP公司)；蛋白Marker(Thermo Science)；SREBP1一抗兔抗鼠，SREBP2一抗兔抗鼠，HMGCR一抗兔抗鼠，F(xiàn)AS一抗兔抗鼠(SANTA CRUZ公司)；HRP標(biāo)記的驢抗山羊二抗，蛋白酶抑制劑(上海碧云天公司)；蛋白酶裂解液(上海貝博公司)；化學(xué)發(fā)光試劑盒(天根公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(北京中杉金橋公司)； Nile Red(上海源葉科技公司)；茜素紅S(上海華東試劑公司)。

1.1.3主要儀器設(shè)備：LightCycler480熒光定量PCR儀[羅氏(上海)有限公司]；激光共聚焦顯微鏡[羅氏(上海)有限公司]；CO2培養(yǎng)箱(Thermo賽默飛世爾科技公司)；OLYMPUS光學(xué)倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；SDS-PAGE凝膠電泳儀(BIO-RAD)。

1.2 實驗方法

1.2.1皮質(zhì)酮溶液配制：將34.6 mg皮質(zhì)酮粉劑溶入10 mL的DMSO(二甲基亞砜，dimethyl sulfoxide)中，充分混勻，配成10 μmol/mL的貯存液，存放于4 ℃，使用前用培養(yǎng)基逐級稀釋成100、10、1、0.1、0.01 μmol/L的溶液進(jìn)行實驗。

1.2.2成骨細(xì)胞的分離：提取SD胎鼠(出生24 h內(nèi))成骨細(xì)胞，無菌取下胎鼠顱骨，放入無菌PBS中浸泡并剔去骨膜等物質(zhì)，然后用剪刀將顱骨頭剪成1×1 mm3大小的組織塊，移至15 mL離心管中，加入5mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴消化30 min，去掉胰蛋白酶后加入含0.2%的Ι型膠原酶的消化液消化，消化6個循環(huán)，每次在37 ℃水浴消化30 min，取第3、4、5、6次消化的細(xì)胞懸液，1 300 r/min離心10 min，棄上清，沉淀的細(xì)胞用不含血清的高糖DMEM洗劑離心1次，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸吹打均勻后，以1×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中，放入5%CO2,、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h換液, 以后每2～3 d換液并在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況， 待細(xì)胞長至半?yún)R合鋪滿瓶底時， 用0. 25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、 傳代。

1.2.3成骨細(xì)胞的鑒定：①成骨細(xì)胞形態(tài)觀察：每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長。②將傳到第三代的細(xì)胞以2×105個/mL接種到鋪有蓋玻片的六孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，3～4 d后將蓋玻片撈出進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶染色，倒置顯微鏡下觀察。③茜素紅染色：稱取0.1 g茜素紅粉劑溶于100 mL蒸餾水中配成0.1%的茜素紅溶液，將細(xì)胞爬片10～14 d后的蓋玻片撈出，用PBS輕輕沖洗兩遍，用0.1%的茜素紅溶液染色30 min后蒸餾水沖洗兩遍，封片，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4成骨細(xì)胞增殖能力分析：將傳到第三代的細(xì)胞以5×104/mL密度接種于96孔板，在37 ℃，95%O2，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，使細(xì)胞完全貼壁。以0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的皮質(zhì)醇作用24、48、72 h后，以CCK-8法測定細(xì)胞存活率。

1.2.5實驗分組：實驗隨機(jī)分為A、B、C、D組(皮質(zhì)酮作用濃度分別為0、0.1、1、10 μmol/L)，每組作用24、48、72 h三個時間段，作用后各組細(xì)胞Nile Red脂質(zhì)染色，實時熒光定量PCR法測定各組細(xì)胞SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS的mRNA表達(dá), Western blot測SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS蛋白表達(dá)。

(1)Nile Red染色：將A、B、C、D組爬片成骨細(xì)胞用PBS沖洗兩遍，每個蓋玻片避光滴一滴0.1%Nile Red的溶液于37 ℃的水浴箱中染色10 min，10 min后取出玻片PBS沖洗，開啟激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

(2)mRNA檢測： 以 105/孔的密度將細(xì)胞接于 6孔板中, 加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，再加入皮質(zhì)酮作用濃度分別為0、0.1、1、10 μmol/L培養(yǎng)液, 培養(yǎng)24，48，72 h后提取總RNA，經(jīng)過濃度測定、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后行實時熒光定量PCR反應(yīng)。SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS和內(nèi)參β-actin引物序列見表1。反應(yīng)條件為首先95 ℃變性30 s；然后按95 ℃ 5s，60 ℃ 20 s擴(kuò)增40個循環(huán)。每個組的標(biāo)本重復(fù)3次。在反應(yīng)的第二階段，在每個循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號強(qiáng)度，60～95 ℃間進(jìn)行融解曲線分析，以分析反應(yīng)中引物的特異性。測得的Ct值來計算每個樣本目的基因的相對表達(dá)量。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR.

注：F: Forward Sequence R: Reverse Sequence

(3)蛋白表達(dá)檢測：采用Western blot法。提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)法測定蛋白濃度，與5×緩沖液混合，100 ℃變性5 min。各種一抗以1∶1000稀釋，內(nèi)參(β-actin)按1∶2000稀釋，二抗按1∶5000的比例稀釋。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均先進(jìn)行正態(tài)性與方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，擬P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞分離與鑒定

成骨細(xì)胞倒置顯微鏡觀察：原代細(xì)胞培養(yǎng)1 d后貼壁，細(xì)胞呈梭形、多角形，7～10 d單層鋪滿瓶壁。傳代細(xì)胞多為梭形。(圖1 A、B)

堿性磷酸酶(ALP)染色：取第三代細(xì)胞做堿性磷酸酶(ALP)染色，呈棕黃色為陽性(圖1 C)。

茜素紅(鈣化結(jié)節(jié)染色)染色：細(xì)胞匯合時均呈多層重疊生長，細(xì)胞局部堆集成灶狀，形成鈣結(jié)節(jié)，染色后鈣結(jié)節(jié)呈橘紅色(圖1 D)。

2.2 不同濃度皮質(zhì)醇對成骨細(xì)胞增殖的影響

CCK-8示：高濃度皮質(zhì)酮對細(xì)胞增值有抑制作用，隨著濃度增加，對細(xì)胞增值抑制明顯增加，地塞米松濃度在0.01 μmol/L～100 μmol/L均可抑制細(xì)胞增殖，并呈濃度依賴性。

2.3 不同濃度皮質(zhì)酮作用后成骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)及相關(guān)基因、蛋白表達(dá)的變化

2.3.1Nile Red染色：Nile Red染色提示，皮質(zhì)酮作用成骨細(xì)胞后，成骨細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)染色隨皮質(zhì)酮濃度增高染色增強(qiáng)；同一皮質(zhì)酮濃度在作用24、48、72 h時成骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)染色無明顯差異。

圖2 A：皮質(zhì)醇作用24 h后成骨細(xì)胞的存活率；B：皮質(zhì)醇作用48 h后成骨細(xì)胞的存活率；C：皮質(zhì)醇作用72 h后成骨細(xì)胞的存活率(與對照組比較，*P<0.05)Fig.2 A: The survival rate of osteoblasts conditioned with cortisol after 24 h; B: The survival rate of osteoblasts conditioned with cortisol after 48 h; C: The survival rate of osteoblasts conditioned with cortisol after 72 h. (*Compared with the control group, P<0.05)

圖3 激素對成骨細(xì)胞作用24、48、72 h后 Nile Red染色結(jié)果紅色熒光表示脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的沉積A: 0 B: 0.1 C: 1 D: 10 (μmol/L)Fig.3 The Nile red staining results of osteoblasts conditioned with the hormone after 24 h, 48 h, and 72 h Red fluorescent lipid deposition in a cellA: 0; B: 0.1; C: 1; D: 10 (μmol/L).

2.3.2應(yīng)用皮質(zhì)酮后熒光定量PCR測定成骨細(xì)胞脂質(zhì)調(diào)節(jié)基因與酶表達(dá)：從測定的結(jié)果可以看出當(dāng)不同的濃度的激素分別作用24 h后，細(xì)胞內(nèi)SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS酶的基因表達(dá)量升高(P<0.05)，但當(dāng)作用的時間延長到48、72 h后，脂質(zhì)合成的SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS酶的基因表達(dá)量呈下降趨勢(P<0.05)(圖 4)。

2.3.3蛋白免疫印跡檢測成骨細(xì)胞內(nèi)SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS蛋白的表達(dá)量：皮質(zhì)醇1μmol/L作用24 h后與對照組相比，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的表達(dá)升高；皮質(zhì)醇1μmol/L作用48 h后與對照組相比，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR未見明顯差異；皮質(zhì)醇1μmol/L作用72 h后與對照組相比，SREBP1、FAS表達(dá)降低，SREBP2表達(dá)升高，HMGCR未見明顯差異(圖5)。

3 討論

激素性股骨頭壞死是糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids, GCs)應(yīng)用的嚴(yán)重并發(fā)癥。目前研究表明有關(guān)激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制主要有：一是激素對成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的直接作用，抑制成骨細(xì)胞的分化、增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞的凋亡，延長破骨細(xì)胞的生存期，最終導(dǎo)致骨量丟失，股骨頭塌陷；二是激素的間接作用，通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致血栓形成，抑制血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)使血管修復(fù)及新生血管形成障礙，影響血管收縮和舒張活性物質(zhì)的表達(dá)及脂質(zhì)代謝，抑制性激素的分泌，減少小腸對鈣離子的吸收及促進(jìn)尿中鈣離子的流失等[5]。但就激素如何發(fā)揮作用，其具體的分子作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

近來有關(guān)的研究表明，糖皮質(zhì)激素可以通過脂肪細(xì)胞來間接的影響成骨細(xì)胞的增殖、分化及功能。激素抑制骨髓內(nèi)骨髓間充值干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Cbfa1/Runx2表達(dá)，促使特異性轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的表達(dá)，從而促使骨髓間從質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，抑制其向成骨細(xì)胞的分化，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞數(shù)量/成骨細(xì)胞數(shù)量比例增加[6,7]。

Kawai等[4]發(fā)現(xiàn)在應(yīng)用大劑量甲強(qiáng)龍治療兔子4周后，首先出現(xiàn)高脂血癥和脂肪肝，電子顯微鏡觀察后可發(fā)現(xiàn)股骨頭部位的骨細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)逐漸增大的脂滴，細(xì)胞核被擠壓到無脂滴的一側(cè)，最終出現(xiàn)細(xì)胞裂解，但是他們未能證明激素性股骨頭壞死與骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的相關(guān)性。Maruno等[8]同樣發(fā)現(xiàn)激素作用后出現(xiàn)骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，在同時應(yīng)用克利貝特(一種新型的纖維酸類降脂新藥)后骨細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積降低。

圖4 不同濃度的皮質(zhì)酮對成骨細(xì)胞作用24、48、72 h后對細(xì)胞內(nèi)SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS基因表達(dá)的影響(與對照組比較，*P<0.05)Fig.4 The effects of different concentrations of corticosterone on the osteoblasts of the gene expression in SREBP1, SREBP2, HMGCR and FAS after 24 h, 48 h and 72 h

圖5 蛋白免疫印跡檢測成骨細(xì)胞內(nèi)SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS蛋白的表達(dá)量Fig.5 The expressions of SREBP1, SREBP2, HMGCR and FAS protein in osteoblasts detected by Western blot

就成骨細(xì)胞而言，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素后骨細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)大量脂質(zhì)沉積[4,8]，這是否也是激素性骨損害原因之一，目前未見明確解釋，那么激素影響下成骨細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)的原因到底是如何？因此本研究觀察了成骨細(xì)胞在激素影響后，脂質(zhì)合成相關(guān)的基因與關(guān)鍵酶的表達(dá)，初步探討這一現(xiàn)象。

SREBP是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，分為SREBP1和SREBP2兩型，其中SREBP1主要調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸和甘油三酯的含量，SREBP2主要調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量。FAS由一條多肽鏈構(gòu)成的多功能酶，通常以二聚體形式存在，在體內(nèi)主要催化脂肪酸的合成， HMGCR在體內(nèi)主要促進(jìn)膽固醇的合成。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸、甘油三酯及膽固醇的含量降低時，SREBP1、SREBP2的基因轉(zhuǎn)錄會上升，進(jìn)而促進(jìn)相應(yīng)的FAS、HMGCR的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)脂肪酸、膽固醇的含量增多，相反，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量增高時，會抑制SREBP1、SREBP2的表達(dá)，進(jìn)而減少胞內(nèi)脂質(zhì)的合成[9,10]。盛輝等[11]指出在激素性骨壞死發(fā)生過程中，早期血管外脂肪堆積表現(xiàn)為大量生成的小脂肪細(xì)胞，后期血管外脂肪堆積表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞出現(xiàn)肥大。

本文應(yīng)用多次酶消化法獲得大鼠成骨細(xì)胞，鑒定后用于實驗。不同濃度皮質(zhì)酮作用成骨細(xì)胞后可見細(xì)胞內(nèi)Nile Red脂質(zhì)染色隨皮質(zhì)酮濃度增高染色增強(qiáng)，而相同濃度皮質(zhì)酮在作用成骨細(xì)胞24、48、72 h時細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)染色無明顯差異，提示皮質(zhì)酮可以促使成骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的增加，造成脂質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)過度積聚，這種作用與皮質(zhì)酮濃度相關(guān)。

本文通過對細(xì)胞內(nèi)脂肪酸、膽固醇合成的相關(guān)的限速酶基因表達(dá)觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)皮質(zhì)酮濃度0.1、1、10μmol/L作用24 h后，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的基因表達(dá)升高，但作用時間延長到48、72 h，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的基因表達(dá)量降低，這可能是由于激素通過24 h的作用，使成骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積到一定的量后反饋抑制了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成相關(guān)酶的基因表達(dá)，使脂質(zhì)合成相關(guān)的酶的基因表達(dá)量下降。

通過熒光定量PCR可以發(fā)現(xiàn)在作用24 h后，不同濃度皮質(zhì)酮均可促進(jìn)SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的基因表達(dá)升高，本研究選取皮質(zhì)酮濃度為1μmol/L做蛋白免疫印跡實驗，成骨細(xì)胞在皮質(zhì)酮作用 24 h后，與對照組相比，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的表達(dá)升高；皮質(zhì)醇1μmol/L作用48 h后與對照組相比，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR未見明顯差異；皮質(zhì)醇1μmol/L作用72 h后與對照組相比，SREBP1、FAS表達(dá)降低，SREBP2表達(dá)升高，HMGCR未見明顯差異，這可能是由于激素作用成骨細(xì)胞24 h后細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成的增多，出現(xiàn)SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR表達(dá)的升高；但是在24～48 h的某個時間，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積到一定程度，開始反饋抑制成骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR表達(dá)開始下降，與對照組相比差異不明顯；而在作用的72 h出現(xiàn)了SREBP1、FAS表達(dá)降低，SREBP2表達(dá)升高，HMGCR未見明顯差異，這可能是由于激素對成骨細(xì)胞內(nèi)脂肪酸、甘油三酯、膽固醇合成作用的不同引起。

文獻(xiàn)[12-14]表明生理劑量的激素(≤10-8mol/L)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，然而超生理劑量的激素降低成骨細(xì)胞的活性，抑制成骨細(xì)胞的分化。本研究采用的激素濃度為0.1、1、10μmol/L，為超生理劑量濃度，均能促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常蓄積。

因此，通過目前研究可以得出超生理劑量糖皮質(zhì)激素可能通過促進(jìn)脂質(zhì)合成過程中相關(guān)酶基因及蛋白表達(dá)來促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的沉積，這種作用與激素的濃度明顯相關(guān)。但激素是否通過促進(jìn)其胞內(nèi)脂質(zhì)沉積來對成骨細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面作用，或者能否通過抑制激素作用的成骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成中的某一條通路，從而達(dá)到預(yù)防激素性股骨頭壞死的目的，還有待進(jìn)一步探討。