牛海軍 王歌 李明虎

?

·論著·

GeneXpert MTB/RIF 檢測在肺結(jié)核診斷中的價值評估

牛海軍 王歌 李明虎

目的 評估GeneXpert MTB/RIF檢測方法對結(jié)核分枝桿菌(MTB)及其利福平耐藥性檢測的準確性和可行性。方法 于2012年11月至2015年11月，收集來自河南省南陽市第六人民醫(yī)院和轄區(qū)11個縣(區(qū))結(jié)核病防治機構(gòu)的1154例疑似肺結(jié)核患者的痰標本。患者痰標本均于河南省南陽市第六人民醫(yī)院分別進行涂片鏡檢、固體培養(yǎng)、比例法藥敏試驗和GeneXpert MTB/RIF檢測，分析比較GeneXpert MTB/RIF方法與傳統(tǒng)方法檢測MTB及利福平耐藥性的檢測效能。結(jié)果 以固體培養(yǎng)結(jié)果為金標準，GeneXpert MTB/RIF方法檢測MTB的敏感度和特異度分別為90.0% (522/580)和89.5% (418/467)；以傳統(tǒng)比例法藥敏試驗結(jié)果為金標準，GeneXpert MTB/RIF方法檢測MTB利福平耐藥的敏感度和特異度分別為87.7% (64/73)和96.6% (460/476)。結(jié)論 GeneXpert MTB/RIF檢測MTB有較高的敏感度和特異度，在肺結(jié)核快速早期診斷及利福平耐藥性檢測方面有較好的應(yīng)用前景。

分枝桿菌，結(jié)核； 核酸擴增技術(shù)； 利福平； 抗藥性

結(jié)核病由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起，仍然是嚴重危害人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。耐藥結(jié)核病已經(jīng)成為全球結(jié)核病疫情急劇上升的原因之一。一方面，缺乏敏感度高的診斷方法，延誤了患者的診斷和治療；另一方面，作為金標準的MTB培養(yǎng)檢查方法耗時較長，滯后于臨床診治需要，導(dǎo)致耐藥結(jié)核病傳播的機會增加。因此，如何快速完成對肺結(jié)核特別是涂陰和耐藥肺結(jié)核的確診對于結(jié)核病的防控具有十分重要的意義。

GeneXpert MTB/RIF檢測技術(shù)依據(jù)熒光定量PCR的原理，針對MTB的rpoB基因81 bp利福平耐藥核心區(qū)間(RRDR)設(shè)計引物、探針，檢測其是否發(fā)生突變，能直接從患者新鮮痰液里同時檢測MTB及其是否對利福平耐藥(rpoB序列存在突變)，整個檢測時間約為2 h。國內(nèi)外研究均表明該方法檢測的敏感度和特異度都高于現(xiàn)有的檢測方法[1-3]，為MTB的檢出及其利福平耐藥性的檢測提供了快速、準確的診斷依據(jù)。另外，此項技術(shù)整合了傳統(tǒng)PCR檢測所需的步驟，并將其自動化，使得操作簡便，適于臨床應(yīng)用。在結(jié)核病高發(fā)和耐藥形勢嚴峻的地區(qū)，對于快速診斷耐藥結(jié)核病、指導(dǎo)臨床合理用藥，GeneXpert MTB/RIF檢測方法不失為一種有應(yīng)用價值的檢測手段。但該方法在國內(nèi)應(yīng)用較晚，目前在縣、市級結(jié)核病防治機構(gòu)大規(guī)模應(yīng)用的可行性研究較少。本研究即應(yīng)用GeneXpert MTB/RIF檢測河南省南陽市1154例疑似肺結(jié)核患者的痰標本，并與固體培養(yǎng)和傳統(tǒng)比例法藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結(jié)果進行對比，評估其檢測效能，為進一步在基層實驗室推廣該技術(shù)提供參考。

資料和方法

1.對象：于2012年11月至2015年11月收集來自河南省南陽市第六人民醫(yī)院和轄區(qū)11個縣(區(qū))結(jié)核病防治機構(gòu)的1154例疑似肺結(jié)核患者的痰標本?；颊咛禈吮揪诤幽鲜∧详柺械诹嗣襻t(yī)院分別進行涂片鏡檢、固體培養(yǎng)、比例法藥敏試驗和GeneXpert MTB/RIF檢測。

2.方法：(1)痰涂片：參照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》[4]痰萋-尼染色法要求，并按照文獻規(guī)定的光學(xué)顯微鏡報告標準進行報告。(2)痰培養(yǎng)：參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[5]制備酸性羅氏培養(yǎng)基。采用4%NaOH法對涂片后剩余的標本處理15 min，取0.1 ml無菌操作接種于酸性羅氏培養(yǎng)基斜面，放置于35～37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。每周觀察結(jié)果并及時報告陽性結(jié)果，若滿8周仍未有菌落生長，則報告培養(yǎng)陰性[5]。(3)比例法藥敏試驗：用接種環(huán)取培養(yǎng)基上的菌落，研磨后與標準麥氏管比對，制成1 mg/ml菌懸液，梯度稀釋為10-2mg/ml和10-4mg/ml，接種到含利福平(40 μg/ml)的羅氏固體培養(yǎng)基和空白對照管培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果[5]。(4)rpoB耐藥核心區(qū)間測序：測序上游引物為5′-CTTGCACGAGGGTCAGACCA-3′；下游引物為5′-ATCTCGTCGCGCTAACCACGCC-3′[6]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。(5)GeneXpert MTB/RIF核酸擴增檢測：按照GeneXpert MTB/RIF(美國Cephied公司)操作說明書上的步驟，取1 ml痰標本放置到有螺旋蓋的前處理管中，然后加入相當(dāng)于2倍痰標本體積的GeneXpert 樣品試劑(SR)，旋緊前處理管，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使痰標本充分液化。打開反應(yīng)盒，使用試劑盒內(nèi)提供的專用無菌吸管，取2 ml處理后樣品由加樣孔緩慢加入反應(yīng)盒，然后將反應(yīng)盒放置到檢測模塊，儀器開始自動化檢測。反應(yīng)結(jié)束后，在檢測系統(tǒng)窗口下可直接觀察測試結(jié)果。結(jié)果的判斷依照探針的循環(huán)閾值(Ct值)，當(dāng)內(nèi)對照探針Ct值≤38即為陽性，5個探針中至少2個探針Ct值≤38即為檢測到MTB。該方法檢測利福平耐藥的基礎(chǔ)在于MTB特異性分子信標早期Ct值和晚期Ct值之差，即ΔCt值，當(dāng)ΔCt>3.5時提示對利福平耐藥，當(dāng)ΔCt≤3.5時提示對利福平敏感。

3.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 13.0軟件進行分析，計算GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感度和特異度；并對GeneXpert MTB/RIF檢測與固體培養(yǎng)法進行一致性檢驗(Kappa檢驗)，Kappa值≥0.75認為兩者一致性較好。

結(jié) 果

1.基本情況：1154例疑似肺結(jié)核患者經(jīng)檢測，涂陽401例(34.7%)，涂陰753例(65.3%)；涂陰患者中最后確診為肺部腫瘤、肺炎、支氣管擴張者41例。401例涂陽患者中，20例GeneXpert MTB/RIF檢測MTB結(jié)果為無效，無效率為5.0%；經(jīng)實驗室查找，涂片陽性級別1+及以下18例，2+級別2例，6例檢測結(jié)果為無法判斷。753例涂陰患者中，73例 GeneXpert MTB/RIF檢測MTB結(jié)果為無效，8例檢測結(jié)果為無法判斷。最終可進行GeneXpert MTB/RIF對比分析者1047例；其中，痰培養(yǎng)陽性580例，31例GeneXpert MTB/RIF檢測利福平耐藥結(jié)果無法判斷，最終可進行對比分析者549例。

2.GeneXpert MTB/RIF對MTB的檢測結(jié)果：使用GeneXpert MTB/RIF檢測1047例疑似肺結(jié)核患者，其中，涂陽375例(35.8%)，涂陰672例(64.2%)。以固體培養(yǎng)結(jié)果為金標準，GeneXpert MTB/RIF檢測涂陽患者MTB的敏感度為97.8%(353/361)，特異度為14.3%(2/14)；檢測涂陰患者MTB的敏感度為77.2%(169/219)，特異度為91.8%(416/453)；全部患者檢測的敏感度為90.0%(522/580)，特異度為89.5%(418/467)，見表1。在肺部腫瘤、肺炎、支氣管擴張的41例非結(jié)核患者中，有2例GeneXpert Mtb檢測陽性，特異度為95.1%(39/41)。對GeneXpert MTB/RIF和固體培養(yǎng)進行Kappa檢驗，Kappa值為0.815，兩者具有較好的一致性。

表1 GeneXpert MTB/RIF法對痰標本中MTB的檢測效能分析(例)

表2 GeneXpert MTB/RIF法對痰標本中MTB利福平耐藥情況的檢測效能(例)

3.GeneXpert MTB/RIF檢測MTB耐藥性分析：使用GeneXpert MTB/RIF方法檢測培養(yǎng)陽性549例患者痰標本中的MTB對利福平的耐藥性，其中涂陽353例(64.3%)，涂陰196例(35.7%)。以比例法藥敏結(jié)果為金標準，GeneXpert MTB/RIF檢測涂陽患者利福平耐藥的敏感度為89.1%(49/55),特異度為97.3%(290/298)；檢測涂陰患者利福平耐藥的敏感度為83.3%(15/18)，特異度為95.5%(170/178)；檢測全部患者的敏感度為87.7%(64/73)，特異度為96.6%(460/476)，見表2。對GeneXpert MTB/RIF和比例法藥敏試驗進行Kappa檢驗，Kappa值為0.811，兩者具有較好的一致性。

討 論

結(jié)核病的早期診斷和耐藥性檢測對于更好地控制耐藥結(jié)核病的傳播具有十分重要的意義。目前，我國肺結(jié)核診斷所依據(jù)的實驗室檢查中，細菌學(xué)檢查仍是診斷的金標準，主要包括痰涂片和培養(yǎng)2種方法。但是，痰涂片直接鏡檢法陽性率不高，且受痰標本質(zhì)量的影響較大；而培養(yǎng)方法檢測需要5～8周時間，明顯滯后于臨床醫(yī)師對肺結(jié)核早期診斷的期望。此外，傳統(tǒng)的藥敏試驗受到許多因素的影響，并且耗時過長。因此，建立和推廣特異度、敏感度高的MTB檢測和耐藥性檢測方法至關(guān)重要。

GeneXpert MTB/RIF是近年迅速發(fā)展的基因診斷技術(shù)，與傳統(tǒng)檢測方法相比，敏感度和特異度均有明顯提高。本研究中，GeneXpert MTB/RIF對痰標本MTB檢測的敏感度為90.0%，特異度為89.5%；對利福平耐藥檢測的敏感度為87.7%，特異度為96.6%，與國內(nèi)文獻報道一致[7]。此外，由于大部分(約86%)利福平耐藥株同時對異煙肼耐藥[8]，故在利福平耐藥的情況下，一定程度上可作為耐多藥結(jié)核病的篩查和監(jiān)測指標。

GeneXpert MTB/RIF雖然對涂陽培陽的樣本陽性檢出率較高，但對涂陰培陰的檢出率仍不高。本研究中有107例患者的傳統(tǒng)固體培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF檢測MTB的結(jié)果不一致，經(jīng)查證，49例培養(yǎng)陰性而GeneXpert MTB/RIF檢測MTB結(jié)果為陽性患者中，29例為復(fù)治肺結(jié)核，這主要是由于培養(yǎng)法敏感度低所致，也可能與培養(yǎng)前應(yīng)用抗結(jié)核藥物導(dǎo)致標本內(nèi)MTB生長能力下降或形成死菌有關(guān)；401例涂陽患者中，20例GeneXpert MTB/RIF檢測MTB結(jié)果無效，考慮為陽性級別較低標本中MTB濃度低所致。上述結(jié)果均提示該方法的可靠性依賴于樣本中的細菌載量，且與正確的樣本采集、處理和存儲有關(guān)。

總之，GeneXpert MTB/RIF具有快速、高效的特點，且只需2 h即可完成，極大地縮短了檢測的時間，有助于對患者盡快確診并及時采取治療手段。其作為集MTB檢測和MTB利福平耐藥檢測為一體的新型檢測技術(shù)，檢測診斷準確率高，應(yīng)用價值大；作為安全、快速的臨床檢查手段，對于肺結(jié)核的早期診斷和耐藥性檢測具有積極意義。因此，在結(jié)核病高發(fā)和耐藥形勢嚴峻的地區(qū)，對于快速診斷耐藥結(jié)核病、指導(dǎo)臨床合理用藥，GeneXpert MTB/RIF不失為一種有應(yīng)用價值的檢測手段，值得在縣、市級結(jié)核病防治機構(gòu)推廣應(yīng)用。

[1] 陳子芳, 孫義軍, 孫本海. GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)在肺結(jié)核診斷及利福平耐藥檢測中的應(yīng)用價值. 中華臨床感染病雜志, 2014, 7(4): 351-353.

[2] 劉亞芹, 楊振斌, 馮東霞, 等. GeneXpert法檢測結(jié)核分枝桿菌及其對利福平耐藥性的研究. 中華實驗和臨床感染病雜志(電子版), 2015, 9(4): 524-527.

[3] Boehme CC, Nicol MP, Nabeta P, et al. Feasibility, diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralized use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study. Lancet, 2011, 377(9776): 1495-1505.

[4] 趙雁林, 劉宇紅, 姜廣路, 等. 中國結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊. 北京: 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社, 2009: 5-13.

[5] 中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會. 結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程. 北京: 中國教育文化出版社, 2006: 8-45.

[6] Malhotra S, Cook VJ, Wolfe JN, et al. A mutation inMycobacteriumtuberculosisrpoBgene confers rifampin resistance in three HIV-TB cases. Tuberculosis (Edinb), 2010, 90(2): 152-157.

[7] 張治國, 歐喜超, 孫倩, 等. 利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(shù)檢測痰標本中結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的研究. 中國防癆雜志, 2013, 35(1): 13-16.

[8] 尹青琴, 申阿東. Xpert MTB/RIF試驗在結(jié)核病診斷中的研究現(xiàn)狀. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2012, 35(5): 363-365.

(本文編輯：李敬文)

Assessment of GeneXpert MTB/RIF test for diagnosis of pulmonary tuberculosis

NIUHai-jun，WANGGe,LIMing-hu.

NanyangTuberculosisControlInstitute，Nanyang473001，China

NIUHai-jun，Email：154573539@qq.com

Objective To evaluate the accuracy and feasibility of GeneXpert MTB/RIF test in detectingMycobacteriumtuberculosis(MTB) and rifampin resistance. Methods From November 2012 to November 2015, the sputum samples of 1154 suspected cases from Nanyang Sixth People’s Hospital and tuberculosis control institutions in 11 counties (districts) in Nanyang city, Henan province, were collected. The smear microscopy, solid culture, traditional proportion method of drug susceptibility test and GeneXpert Mtb/RIF test were conducted in Nanyang Sixth People’s Hospital. This study aimed to compare the GeneXpert MTB/RIF method and traditional method to detect MTB and rifampicin resistance. Results Considering the solid culture method as gold standard, the sensitivity and specificity of GeneXpert MTB/RIF test in detecting MTB were 90% (522/580) and 89.5% (418/467), respectively. Considering the traditional proportion method as gold standard, the sensitivity and specificity of GeneXpert MTB/RIF test in detecting rifampin resistance were 87.7% (64/73) and 96.6% (460/476), respectively. Conclusion GeneXpert MTB/RIF detects MTB with high sensitivity and specificity, and has good prospects in early diagnosis of tuberculosis and detection of rifampicin resistance.

Mycobacteriumtuberculosis; Nucleic acid amplification techniques; Rifampin; Drug resistance

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.008

473001 河南省南陽市結(jié)核病防治所

牛海軍，Email：154573539@qq.com

2017-05-15)