劉毅 張旭霞 張雨晴 李傳友
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·論著·
結(jié)核分枝桿菌三種蛋白在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的評(píng)價(jià)研究
劉毅 張旭霞 張雨晴 李傳友
目的 對(duì)結(jié)核分枝桿菌相對(duì)分子質(zhì)量為38 000(以下采用38 kD表示)、線粒體通透性轉(zhuǎn)換蛋白64 (mitochondrial permeability transition 64,MPT-64)和肝素結(jié)合血凝素(heparin-binding haemagglutinin,HBHA)蛋白在外周血中抗體的表達(dá)水平進(jìn)行檢測和比較,并對(duì)它們?cè)诮Y(jié)核病血清學(xué)方面的診斷價(jià)值進(jìn)行評(píng)估。方法 選取2012年7月至2013年10月北京胸科醫(yī)院收治的肺結(jié)核患者作為活動(dòng)性肺結(jié)核(ATB)組,共78例;選取同期36例潛伏結(jié)核感染(LTBI)患者作為LTBI組;同期在北京胸科醫(yī)院進(jìn)行體檢的31名健康人群(HC)作為HC組。將本實(shí)驗(yàn)室前期純化的38 kD、MPT64和HBHA作為抗原應(yīng)用于免疫學(xué)的檢測,采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測血清中三種蛋白抗體的表達(dá)水平,經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后,分別比較ATB、LTBI和HC三組之間的差異,并結(jié)合受試者工作特征曲線計(jì)算各蛋白抗原的敏感度和特異度,評(píng)價(jià)三種蛋白血清抗體的臨床診斷價(jià)值。結(jié)果 ELISA檢測ATB組38 kD蛋白抗體的吸光度(A)450 nm處的A值(0.343±0.120)高于LTBI組(0.221±0.102)和HC組(0.143±0.097),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.07,P<0.05); MPT64抗體的A450值(0.234±0.102)高于LTBI組(0.198±0.087)和HC組(0.123±0.075),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.79,P<0.05);HBHA抗體的A450值(0.263±0.113)高于LTBI組(0.188±0.091)和HC組(0.148±0.078),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.70,P<0.05)。以38 kD、MPT64和HBHA蛋白抗體表達(dá)水平從LTBI組鑒別ATB組時(shí)的受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分別為0.78、0.61和0.62,敏感度分別為71.79%、62.82%和52. 56%,特異度為72.22%、58.33%和69.44%;從HC組鑒別ATB組時(shí)的AUC分別為0.91、0.81和0.79,敏感度分別為87.17%、69.23%和73.08%,特異度為80.65%、74.19%和74.19%;從HC組鑒別LTBI組AUC分別為0.63、0.75和0.69,敏感度分別為58.33%、77.78%和63.89%,特異度為64.52%、51.61%和74.19%。結(jié)論 MTB 38 kD、MPT64和HBHA蛋白都有較好的免疫反應(yīng)性,3種蛋白抗體在不同患者人群血清中的表達(dá)水平有差異,對(duì)肺結(jié)核診斷價(jià)值的評(píng)估結(jié)果表明采用ELISA對(duì)外周血中MTB蛋白抗體進(jìn)行檢測可作為結(jié)核病臨床檢測診斷的輔助方法。
分枝桿菌,結(jié)核; 細(xì)菌蛋白質(zhì)類; 酶聯(lián)免疫吸附測定; 抗體; 血清學(xué)試驗(yàn); 評(píng)價(jià)研究
結(jié)核分枝桿菌(MTB)基因組共編碼約4000多種蛋白[1],這其中有很多蛋白顯示了較好的免疫原性和應(yīng)用價(jià)值。這些蛋白包括MTB 相對(duì)分子質(zhì)量為38 000(以下采用38 kD表示)蛋白, 線粒體通透性轉(zhuǎn)換蛋白64 (mitochondrial permeability transition 64, MPT-64)和肝素結(jié)合血凝素(heparin-binding Haemagglutinin, HBHA)蛋白等。這三種蛋白可在結(jié)核病患者的感染和發(fā)病過程中誘發(fā)免疫反應(yīng),對(duì)其臨床診斷價(jià)值的研究成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。
MTB 38 kD蛋白是一種與磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的脂蛋白,含有特異的B 淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞抗原決定簇,能誘導(dǎo)早期反應(yīng)[2]。研究發(fā)現(xiàn)MTB的主要免疫原38 kD蛋白抗原免疫學(xué)活性很強(qiáng),是較理想的血清學(xué)快速診斷抗原[3]。MPT64是MTB生長最早分泌的主要蛋白[4],僅在MTB及牛分枝桿菌中存在,而作為疫苗的BCG中則不表達(dá)。MPT64蛋白能刺激T淋巴細(xì)胞反應(yīng),特異性也較好,可作為血清學(xué)診斷試劑[5]。HBHA是MTB分泌的一種黏附素,是一種糖蛋白,能介導(dǎo)肺結(jié)核和肺外結(jié)核的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn),HBHA誘導(dǎo)產(chǎn)生的γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)可作為潛伏結(jié)核感染的診斷工具,有很好的敏感度和特異度[6]。
另外,MTB的潛伏感染和持留存在是導(dǎo)致結(jié)核病化療療程偏長、療效不佳及化療后易再次復(fù)發(fā)的主要原因之一[7],也是近年來肺結(jié)核卷土重來的重要原因之一[8]。而且對(duì)于潛伏結(jié)核感染 (latent tuberculosis infection, LTBI)的診斷存在嚴(yán)重不足,如何快速區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核(active tuberculosis, ATB)和LTBI是一直存在的難題[9],尋找能夠快速檢測和診斷結(jié)核病的方法和手段一直是廣大研究人員努力的方向[10]。
鑒于MPT64、38 kD和HBHA這3種蛋白的功能和自身的免疫原性,本研究通過對(duì)78例ATB、36例LTBI和31名健康對(duì)照(healthy control, HC)人群中3種蛋白的抗體表達(dá)水平的比較,分析在外周血中3種蛋白抗體的表達(dá)水平是否存在差異,進(jìn)而評(píng)價(jià)3種蛋白對(duì)ATB和LTBI的診斷效能,探討這3種蛋白在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值, 為尋找更精確、更快速的免疫學(xué)檢測方法提供線索,同時(shí)為研究MTB的持留存在奠定基礎(chǔ)。
一、研究對(duì)象
選取2012年7月至2013年10月北京胸科醫(yī)院收治的78例初治活動(dòng)性肺結(jié)核患者作為ATB組;36例LTBI患者作為LTBI組;HC健康體檢者31名作為HC組。所有研究對(duì)象均知情同意,經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)的評(píng)審認(rèn)證。對(duì)三組對(duì)象的性別進(jìn)行卡方檢驗(yàn),年齡進(jìn)行方差分析,提示差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明各組在年齡、性別等方面均具有可比性(表1)。
二、 分組標(biāo)準(zhǔn)
ATB組:按照病史、臨床診斷、體征、胸部X線攝影和病原學(xué)診斷的結(jié)果,初次診斷為活動(dòng)性肺結(jié)核患者,并排除結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腦膜炎、體表結(jié)核和骨關(guān)節(jié)結(jié)核等其他部位的結(jié)核病。 LTBI組:有結(jié)核病患者接觸史,無結(jié)核病臨床癥狀,胸部X線攝影等檢查無異常,詢問BCG接種史并查驗(yàn)卡痕,排除BCG接種;進(jìn)行PPD皮膚試驗(yàn),72 h內(nèi)硬結(jié)的平均直徑≥10 mm,酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT) 檢測陽性,病原學(xué)檢查陰性。HC組:無結(jié)核病臨床癥狀,胸部X線攝影等檢查無異常,詢問BCG接種史,排除BCG接種;進(jìn)行PPD皮膚試驗(yàn),72 h內(nèi)硬結(jié)的平均直徑<5 mm 或ELISPOT 檢測陰性。所有研究對(duì)象均排除HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等病毒感染,排除其他疾病如糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病。
表1 本研究三組人群的一般資料
三、 試驗(yàn)試劑與儀器
酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒(美國BD公司),山羊抗人IgG(北京中杉金橋生物公司),多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司),恒溫?fù)u床(江蘇太倉儀器),離心機(jī)(德國Sigma公司)。
四、蛋白抗原
實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了原核表達(dá)載體,在大腸埃希菌中誘導(dǎo)后大量表達(dá)蛋白,經(jīng)過純化后分離獲得本研究中所需的蛋白,詳細(xì)步驟可參考文獻(xiàn)[11]。
五、ELISA方法檢測血清中的抗體
用蛋白抗原包被ELISA酶標(biāo)板,用3%牛血清白蛋白/磷酸鹽緩沖液(BSA/PBS)封閉(200 μl/孔);向包被好的ELISA酶標(biāo)板加入試劑稀釋液(作為空白對(duì)照)、稀釋后血清(100 μl/孔),37 ℃孵育1 h。向酶標(biāo)板加入1∶2000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG,37 ℃溫箱孵育1.5 h,用吐溫磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌3次。加入底物試劑底物A(H2O2)+底物B[四甲基聯(lián)苯胺(TMB)](100 μl/孔),室溫放置,觀察反應(yīng)的顏色變化,待反應(yīng)明顯時(shí)加入反應(yīng)終止液(2 mol/L硫酸)。反應(yīng)終止后30 min內(nèi),測吸光度(A)450 nm處的A值。
六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
根據(jù)血清抗體濃度A450 nm吸光度值,用GraphPad Prism 5軟件繪散點(diǎn)圖;采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用非參數(shù)獨(dú)立樣本的Kruskal-Wallis單因素ANOVA檢驗(yàn),任意兩組獨(dú)立變量之間的比較用配對(duì)t檢驗(yàn)的方法, 計(jì)量資料采用百分率與構(gòu)成比表示,組間差異的比較采用卡方檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
七、評(píng)價(jià)診斷效能
為評(píng)價(jià)3種蛋白分別對(duì)ATB和LTBI的診斷效能,而且對(duì)LTBI的診斷必須能同時(shí)與ATB和HC組鑒別開,因此將鑒別診斷分析設(shè)計(jì)為3組:從LTBI組鑒別ATB組時(shí)以LTBI組為對(duì)照,從HC組鑒別LTBI組時(shí)以HC組為對(duì)照,從HC組鑒別ATB組時(shí)以HC組為對(duì)照。以SPSS 21.0軟件分別繪制3種蛋白抗原對(duì)上述3組人群進(jìn)行鑒別診斷的受試者工作特征(ROC)曲線,計(jì)算曲線下面積(AUC), 用ROC曲線來描述對(duì)該蛋白抗原檢測的敏感度和特異度之間的關(guān)系,最佳臨界值(cut-off)的選取方法是根據(jù)SPSS提供的曲線上各種可能的cut-off點(diǎn)的敏感度和特異度,計(jì)算Youden指數(shù)(靈敏感度+特異度-1)最大時(shí)對(duì)應(yīng)的A值則為最佳cut-off值;采用該cut-off值判定實(shí)驗(yàn)組血清和對(duì)照組血清中的和陰性和陽性比例,待測標(biāo)本A值≥該值判為陽性,待測標(biāo)本A值<該值判為陰性。敏感度=實(shí)驗(yàn)組中的陽性結(jié)果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%;特異度=對(duì)照組中的陰性結(jié)果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%。
一、三組人群血清中38 kD蛋白抗體水平分布
根據(jù)各組血清ELISA檢測結(jié)果,在A450 mm處的A值分布做出散點(diǎn)圖(圖1)。圖1顯示:ATB組(A值為0.343±0.120)和LTBI組(A值為0.221±0.102)相比,A值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.07,P<0.05);ATB組(A值為0.343±0.120)和HC組(A值為0.143±0.097)相比,A值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=2.70,P<0.01);而在LTBI組(A值為0.221±0.102)和HC組(A值為0.143±0.097)間血清樣本抗體檢測的A值分布相近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.30,P>0.05)。
ATB:活動(dòng)性肺結(jié)核患者組;LTBI:潛伏結(jié)核感染組;HC:健康人群組。圖中橫線代表中位數(shù)的水平圖1 血清中相對(duì)分子質(zhì)量38 000蛋白抗體水平檢測分布散點(diǎn)圖
二、三組人群血清中MPT64蛋白抗體水平分布
根據(jù)各組血清ELISA檢測結(jié)果,在A450 mm處的A值分布做出散點(diǎn)圖(圖2)。圖2顯示:ATB組(A值為0.234±0.102)和LTBI組(A值為0.198±0.087)相比,A值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.79,P<0.05);ATB組(A值為0.234±0.102)和HC組(A值為0.123±0.075)相比,A值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.14,P<0.01);而在LTBI組(A值為0.198±0.087)和HC組(A值為0.123±0.075)間血清樣本抗體檢測的A值分布不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.29,P<0.05)。
ATB:活動(dòng)性肺結(jié)核患者組;LTBI:潛伏結(jié)核感染組;HC:健康人群組。圖中橫線代表中位數(shù)的水平圖2 血清中MPT64蛋白抗體水平檢測分布散點(diǎn)圖
三、三組人群血清中HBHA蛋白抗體水平分布
根據(jù)各組血清ELISA檢測結(jié)果,在A450 mm處的A值分布做出散點(diǎn)圖(圖3)。圖3顯示:ATB組(A值為0.263±0.113)和LTBI組(A值為0.188±0.091)相比,A值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.70,P<0.05);ATB組(A值為0.263±0.113)和HC組(A值為0.148±0.078)相比,A值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.98,P<0.01), 而在LTBI組(A值為0.188±0.091)和HC組(A值為0.148±0.078)間血清樣本抗體檢測的A值分布相近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.69,P>0.05)。
ATB:活動(dòng)性肺結(jié)核患者組;LTBI:潛伏結(jié)核感染組;HC:健康人群組。圖中橫線代表中位數(shù)的水平圖3 血清中HBHA蛋白抗體水平檢測分布散點(diǎn)圖
四、各組血清中38 kD、MPT64和HBHA蛋白抗體水平檢測的敏感度、特異度比較
由表2可見, ATB和LTBI 2個(gè)組比較,以LTBI組為對(duì)照,通過38 kD蛋白抗體濃度檢測,診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的敏感度為71.79%,特異度為72.22%;MPT64的敏感度為62.82%,特異度為58.33%;HBHA的敏感度為52.56%,特異度為69.44%;3種蛋白抗體檢測ROC的(AUC)分別為0.78、0.61和0.62。
由表3可見, LTBI組和HC組比較,以HC組為對(duì)照,抗原38 kD蛋白抗體濃度檢測LTBI的敏感度為58.33%,特異度為64.52%;MPT64的敏感度為77.78%,特異度為51.61%;HBHA的敏感度為63.89%,特異度為74.19%;3種蛋白抗體檢測的AUC面積分別為0.63、0.75和0.69。
表2 不同蛋白抗原在ATB組和LTBI組中的敏感度和特異度比較
注 AUC:ROC曲線下面積;敏感度(%)=ATB組中的陽性結(jié)果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%, 特異度(%)=LTBI組中的陰性結(jié)果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%
表3 不同蛋白抗原在LTBI組和HC組中的敏感度和特異度比較
注 AUC:ROC曲線下面積;敏感度(%)=LTBI組中的陽性結(jié)果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%, 特異度(%)=HC組中的陰性結(jié)果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%
表4 不同蛋白抗原在ATB組和HC組中的敏感度和特異度比較
注 AUC:ROC曲線下面積;敏感度(%)=ATB組中的陽性結(jié)果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%; 特異度(%)=HC組中的陰性結(jié)果數(shù)量/總的樣本數(shù)量×100%
由表4可見,LTBI組和HC組比較,以HC組為對(duì)照,抗原38 kD蛋白抗體濃度檢測LTBI的敏感度為87.17%,特異度為80.65%;MPT64的敏感度為69.23%,特異度為74.19%;HBHA的敏感度為73.08%,特異度為74.19%;3種蛋白抗體檢測的AUC面積分別為0.91、0.81和0.79。
結(jié)核病是危害人類健康的重要疾病,MTB可在人體內(nèi)長期處于持續(xù)感染狀態(tài),形成潛伏結(jié)核感染,這已成為目前在全世界范圍內(nèi)檢測和消滅結(jié)核病的最大阻礙之一。正確快速地檢測結(jié)核病,對(duì)結(jié)核病的控制和治療都具有重要的意義。目前的檢測療法雖有很多種,但是仍然缺乏有效和快速的檢測方法。免疫學(xué)檢測方法是臨床實(shí)驗(yàn)室診斷的重要補(bǔ)充,主要包括ELISA方法檢測MTB抗體[12]和ELISPOT方法檢測細(xì)胞免疫反應(yīng)[13]。筆者通過將表達(dá)純化的蛋白應(yīng)用于免疫學(xué)檢測,分析ATB、LTBI和HC這3組人群之間血清蛋白抗體表達(dá)的差異,尋找可應(yīng)用于臨床診斷分析的方法和策略。
本研究結(jié)果表明38 kD蛋白血清抗體檢測在鑒別ATB和LTBI時(shí)具有較好的敏感度和特異度,而HBHA蛋白血清抗體檢測顯示了較好的特異度但敏感度較差,38 kD蛋白顯示了更好的總體診斷效能(AUC=0.78),只是本研究3種蛋白血清抗體檢測的敏感度和特異度都有待提高。MPT64蛋白血清抗體檢測顯示,在鑒別LTBI和HC組時(shí)具有較好的敏感度但特異度較差,而38 kD和HBHA蛋白血清抗體檢測敏感度均偏低(表3),MPT64蛋白的蛋白血清抗體檢測在區(qū)分LTBI和HC組顯示了較好的總體診斷效能(AUC=0.75)。而在區(qū)分ATB組和HC組的研究中,3種蛋白血清抗體檢測均顯示了較好的診斷效能,尤以38 kD蛋白血清抗體檢測顯示了更好的診斷效能(AUC=0.91),敏感度和特異度分別達(dá)到87.17%和80.65%,MPT64和HBHA蛋白的蛋白血清抗體檢測的敏感度和特異度一般,說明38 kD蛋白的蛋白血清抗體檢測在診斷活動(dòng)性肺結(jié)核上具有較好的臨床診斷和應(yīng)用價(jià)值,這也和研究報(bào)道38 kD蛋白抗體在ATB患者血清中高表達(dá)的結(jié)果相一致[14]。可見,雖然在外周血中3種蛋白抗體表達(dá)水平在ATB和LTBI組比較時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但應(yīng)用到臨床診斷時(shí)的敏感度和特異度卻產(chǎn)生了很大的差異,在區(qū)分LTBI和HC組時(shí)也遇到同樣的問題,這說明不能只看總體的表達(dá)水平差異是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而應(yīng)該詳細(xì)評(píng)估它們?cè)诓煌谓Y(jié)核感染狀態(tài)下的診斷價(jià)值。研究結(jié)果也說明,這3種蛋白在結(jié)核感染和發(fā)病中具有不同的臨床和診斷價(jià)值。
導(dǎo)致敏感度和特異度變化的原因有很多,其中一個(gè)原因可能是患者血清中抗體的表達(dá)水平不夠高,不足以將ATB和LTBI分開,可能需要再另外補(bǔ)加新的檢測抗原[15],或者改變檢測方法和檢測對(duì)象[16]。已有研究表明將多個(gè)蛋白并聯(lián)分析,或者進(jìn)行抗原的不同組合,會(huì)使敏感度和特異度都得到加強(qiáng)[17];有的研究甚至融合了7種蛋白抗原,結(jié)果顯示了很好的敏感度和特異度[18]。未來可以通過將這3種抗原進(jìn)行組合檢測和并聯(lián)分析,通過不同抗原進(jìn)行組合分析提高診斷的敏感度和特異度,可以進(jìn)一步提高蛋白抗原在血清學(xué)中的診斷和應(yīng)用價(jià)值。
本研究在收集標(biāo)本時(shí)雖然缺少非結(jié)核呼吸系統(tǒng)疾病對(duì)照,在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上有不夠完善之處,未能將非結(jié)核呼吸疾病完全排除,但因?yàn)樵撗芯恐羞x取的蛋白均為結(jié)核分枝桿菌中特異表達(dá)的分泌蛋白,只在分枝桿菌屬中表達(dá)[19-20],在其他的細(xì)菌或者病毒中均沒有表達(dá)或者同源性很低,因此對(duì)血清學(xué)檢測特異性的影響不會(huì)很大,所以本研究仍然具有重要的價(jià)值和意義。筆者在后續(xù)的研究中將會(huì)增加非結(jié)核呼吸系統(tǒng)疾病作為對(duì)照,更好地滿足研究的特異性要求。其次,在研究設(shè)計(jì)之初,BCG接種組被排除,是擔(dān)心會(huì)影響真正的LTBI組的研究。有研究表明BCG的接種會(huì)影響機(jī)體的免疫應(yīng)答狀況[21],接種后的免疫狀態(tài)可能和LTBI非常相似,這也會(huì)對(duì)檢測結(jié)果造成影響,因此將BCG接種過的健康對(duì)照者排除。當(dāng)然,最好的設(shè)計(jì)是健康對(duì)照中將BCG接種的人群單獨(dú)作為一組進(jìn)行研究,筆者在以后的研究中將會(huì)注意這方面的設(shè)計(jì)和要求,從而更好地體現(xiàn)BCG接種對(duì)血清學(xué)和免疫學(xué)檢測的影響情況。
綜上所述,本研究通過檢測分析3種蛋白的免疫原性和在血清中抗體的表達(dá)水平,驗(yàn)證了3種蛋白對(duì)于肺結(jié)核的檢測和分析能力,可作為臨床結(jié)核病診斷的重要補(bǔ)充,有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[1] Deng J, Bi L, Zhou L, et al.Mycobacteriumtuberculosisproteome microarray for global studies of protein function and immunogenicity. Cell Rep, 2014, 9(6):2317-2329.
[2] Wilkinson RJ, Haslov K, Rappuoli R, et al. Evaluation of the recombinant 38-kilodalton antigen ofMycobacteriumtuberculosisas a potential immuno diagnostic reagent. J Clin Microbiol, 1997, 35(3):553-557.
[3] 劉忠華,丁元生,畢愛笑,等.結(jié)核分枝桿菌38 kD-16 kD融合蛋白克隆表達(dá)及血清學(xué)診斷價(jià)值. 中國防癆雜志, 2009, 31(10):565-569.
[4] Wang Z, Potter BM, Gray AM, et al. The solution structure of antigen MPT64 fromMycobacteriumtuberculosisdefines a new family of beta-grasp proteins. J Mol Biol, 2007, 366(2):375-381.
[5] Yang H, Liu ZH, Zhang LT, et al. Selection and application of peptide mimotopes of MPT64 protein inMycobacteriumtuberculosis. J Med Microbiol, 2011, 60(Pt 1):69-74.
[6] Sun Z, Nie L, Zhang X, et al. Mycobacterial heparin-binding haemagglutinin adhesion-induced interferon & antibody for detection of tuberculosis. Indian J Med Res, 2011, 133:421-425.
[7] Fox GJ, Dobler CC, Marais BJ, et al. Preventive therapy for latent tuberculosis infection-the promise and the challenges. Int J Infect Dis, 2017, 56:68-76.
[8] Monack DM, Mueller A, Falkow S. Persistent bacterial infections: the interface of the pathogen and the host immune system. Nat Rev Microbiol, 2004, 2(9):747-765.
[9] Sgaragli G, Frosini M. Human Tuberculosis I. Epidemiology, Diagnosis and Pathogenetic Mechanisms. Curr Med Chem, 2016, 23(25):2836-2873.
[10] Zhang X, Su Z, Zhang X, et al. Generation ofMycobacteriumtuberculosis-specific recombinant antigens and evaluation of the clinical value of antibody detection for serological diagnosis of pulmonary tuberculosis. Int J Mol Med, 2013, 31(3):751-757.
[11] 聶理會(huì),任衛(wèi)聰,王敬,等. 重組結(jié)核分枝桿菌黏附素、MPT64、38 kD蛋白在結(jié)核性胸膜炎中的診斷價(jià)值比較. 北京醫(yī)學(xué), 2013, 35(9):760-763.
[12] 趙美芬,劉映霞,彭忠田,等.檢測外周血特異性結(jié)核分枝桿菌抗體對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病的診斷價(jià)值研究. 中國防癆雜志, 2014, 36(5):356-361.
[13] 何秀云,黃香玉,朱傳智,等.PstS1-ESAT-6抗原血清學(xué)和γ-干擾素釋放試驗(yàn)輔助診斷結(jié)核病的價(jià)值. 中國防癆雜志, 2016, 38(10):805-812.
[14] Talavera-Paulin M, Garcia-Morales L, Ruiz-Sanchez BP, et al. Active tuberculosis patients have high levels of IgA anti-alpha-crystallin and isocitrate lyase proteins.Int J Tuberc Lung Dis, 2016, 20(12):1681-1688.
[15] Mendes KR, Malone ML, Ndungu JM, et al. High-throughput Identification of DNA-Encoded IgG Ligands that Distinguish Active and LatentMycobacteriumtuberculosisInfections. ACS Chem Biol, 2017,12(1):234-243.
[16] Suzukawa M, Akashi S, Nagai H, et al. Combined Analysis of IFN-gamma, IL-2, IL-5, IL-10, IL-1RA and MCP-1 in QFT Supernatant Is Useful for Distinguishing Active Tuberculosis from Latent Infection. PLoS One, 2016, 11(4):e0152483.
[17] 林楠,吳小翠,趙平,等.四種結(jié)核抗原用于結(jié)核病血清學(xué)診斷的初步評(píng)價(jià). 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2014, 21(6):655-657.
[18] Feng X, Xiu B, Chen K, et al. Enhanced serodiagnostic utility of novelMycobacteriumtuberculosispolyproteins. J Infect, 2013, 66(4):366-375.
[19] Jiang Y, Liu H, Wang H, et al. Polymorphism of antigen MPT64 inMycobacteriumtuberculosisstrains. J Clin Microbiol, 2013, 51(5):1558-1562.
[20] Lanfranconi MP, Alvarez HM. Functional divergence of HBHA fromMycobacteriumtuberculosisand its evolutionary relationship with TadA from Rhodococcus opacus. Biochimie, 2016, 127:241-248.
[21] Shah JA, Musvosvi M, Shey M, et al. A Functional TOLLIP Variant is Associated with BCG-Specific Immune Responses and Tuberculosis.Am J Respir Crit Care Med, 2017.
(本文編輯:王然 李敬文)
The evaluation study of threeMycobacteriumtuberculosisproteins in tuberculosis serologic diagnosis
LIUYi,ZHANGXu-xia,ZHANGYu-qing,LIChuan-you.
DepartmentofBacteriologyandImmunology,BeijingKeyLaboratoryonDrug-ResistantTuberculosisResearch,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute;BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China
LIChuan-you,Email:lichuanyou6688@hotmail.com
Objective To compare the antibody expression of three recombinationMycobacteriumtuberculosis(MTB) protein antigens (MTB relative molecular mass 38 000 short as 38 kD, MPT64 and HBHA)in the peripheral blood serum, and comprehensively assess their performances in serologic diagnosis of tuberculosis (TB). Methods Seventy eight active tuberculosis (ATB) cases and 36 latent tuberculosis infection (LTBI) cases were selected from Beijing Chest Hospital as case groups, during July 2012 to October 2013. And 31 healthy control (HC) cases were recruited from the TB physical examination in Beijing Chest Hospital at the same period. We used these purified protein generated by our laboratory as antigens to measure the expression level of antibodies in serum by ELSIA, then compared the difference between ATB, LTBI and HC by statistical method. Sensitivity, specificity and diagnostic efficiency were calculated after getting the receiver operating characteristic (ROC) curve analysis with the results of Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, comprehensive diagnosis performance and application values of these proteins were evaluated. Results The absorbance (A)450 nmvalue of 38 kD measured by ELISA was higher in ATB group (0.343±0.120) than those in LTBI group (0.221±0.102) and HC group (0.143±0.097). The difference showed statistically significance (t=3.07,P<0.05). TheAvalue of MPT64 measured by ELISA was higher in ATB group (0.234±0.102) than those in LTBI group (0.198±0.087) and HC group (0.123±0.075). The difference showed statistically significance (t=3.79,P<0.05). TheAvalue of HBHA measured by ELISA was higher in ATB group (0.263±0.113) than those in LTBI group (0.188±0.091) and HC group (0.148±0.078). The difference showed statistically significance (t=2.70,P<0.05). Areas under the curve (AUC) of 38 KD, MPT64 and HBHA antibodies which used to distinguish ATB and LTBI were 0.78, 0.61 and 0.62; the sensitivity were 71.79%, 62.82% and 52. 56% separately; and the specificity were 72.22%, 58.33% and 69.44% separately. AUC which used to distinguish ATB and HC were 0.91, 0.81 and 0.79; the sensitivity were 87.17%, 69.23% and 73.08% separately; and the specificity were 80.65%, 74.19% and 74.19% separately. AUC which used for distinguish LTBI and HC were 0.63, 0.75 and 0.69; the sensitivity were 58.33%, 77.78% and 63.89% separately; the specificity were 64.52%, 51.61% and 74.19% separately. Conclusion The three proteins possessed good immune-reactivity characteristics, and the expression level of their antibodies showed significantly difference in different patient groups. The assessment of diagnostic efficiency for TB indicated that through detecting antibodies expression levels in peripheral blood of TB patient based on ELISA is an assistant method for diagnosis of TB in clinical laboratory.
Mycobacteriumtuberculosis; Bacterial proteins; Enzyme-linked immunosorbent assay; Antibodies; Serologic tests; Evaluation studies
10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.006
首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)(2014-4-2163);北京市醫(yī)院管理局青苗計(jì)劃(QML20161601)
101149 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 耐藥結(jié)核病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌免疫室
李傳友,Email:lichuanyou6688@hotmail.com
2017-05-15)