閆瑞云 王善軍 王雁

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醒腦靜聯(lián)合丁苯肽對腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響

閆瑞云 王善軍 王雁

目的 觀察醒腦靜、丁苯酞及二者聯(lián)合分別對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡及Bcl-2和Bax表達的影響。方法 60只雄性wistar大鼠(250±20) g采用改良線栓法制作腦缺血再灌注損傷模型(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)，隨機分為4組，即模型組、醒腦靜組、丁苯酞組、醒腦靜聯(lián)合丁苯酞(聯(lián)合用藥)組，每組又分為6、24、72 h三個亞組；通過原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL)檢測神經(jīng)細胞凋亡情況，采用免疫組化法觀察大鼠腦缺血再灌注各個時間點Bcl-2、Bax的表達水平。結(jié)果 (1)模型組手術(shù)對側(cè)大腦半球偶見凋亡細胞，病灶區(qū)可見大量神經(jīng)細胞凋亡。丁苯酞用藥組、醒腦靜用藥組凋亡細胞數(shù)明顯減少，醒腦靜聯(lián)合丁苯酞組凋亡細胞數(shù)最少(P<0.05)；(2)丁苯酞組及聯(lián)合用藥組Bcl-2陽性表達水平較模型組均有提高，聯(lián)合用藥組Bcl-2陽性表達水平在各時間點均最高(P<0.05)；丁苯酞組及聯(lián)合用藥組Bax陽性表達水平較模型組均有降低，聯(lián)合用藥組Bax陽性表達水平最低(P<0.05)。結(jié)論 (1)醒腦靜、丁苯酞及二者聯(lián)合均可能通過抑制腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡來實現(xiàn)神經(jīng)細胞保護作用，其中二者聯(lián)合效果最佳；(2)丁苯酞可能通過增加腦缺血再灌注損傷大鼠Bcl-2表達，減少Bax表達的方式來減少神經(jīng)細胞凋亡，從而減輕腦缺血再灌注損傷；(3)醒腦靜本身不能對Bcl-2、Bax的表達水平產(chǎn)生影響，但其可能通過增強丁苯酞作用的方式影響B(tài)cl-2、Bax的表達，從而減輕腦缺血再灌注損傷。

腦缺血再灌注損傷 Bcl-2 Bax 凋亡

缺血性腦血管病(CVD)的超早期溶栓是目前最有效的措施，但溶栓成功后的患者在一定時間后其神經(jīng)系統(tǒng)功能不但恢復(fù)欠理想，部分出現(xiàn)了更加嚴重的腦功能障礙，稱之為腦缺血再灌注損傷(reperfusion damage)。腦缺血再灌注損傷機制十分復(fù)雜，目前尚不十分清楚。目前臨床上針對神經(jīng)細胞凋亡及可能引起的神經(jīng)功能障礙的治療常采用神經(jīng)營養(yǎng)或腦保護藥物，常用的神經(jīng)保護藥物如自由基清除劑、神經(jīng)營養(yǎng)劑、通道阻斷劑、興奮性氨基酸受體阻斷劑等，但效果往往難以盡如人意。因此，新型神經(jīng)保護藥物的研制及已有藥物的聯(lián)合應(yīng)用成為可能的選項。

醒腦靜作為臨床常用的中成藥，具有清熱解毒、涼血活血、開竅醒腦，常用于腦栓塞、腦出血急性期、顱腦外傷等。 丁苯酞為人工合成的消旋正丁基苯酞，與天然的左旋芹菜甲素的結(jié)構(gòu)相同。相關(guān)研究顯示，丁苯酞對急性缺血性腦卒中患者中樞神經(jīng)功能的損傷有改善作用，可促進患者神經(jīng)功能缺損的改善。丁苯酞可阻斷缺血性腦卒中所致腦損傷的多個病理環(huán)節(jié)，具有較強的抗腦缺血作用。二者作為臨床常用藥，是西藥與傳統(tǒng)的中醫(yī)藥的有機結(jié)合，被廣大醫(yī)務(wù)人員廣泛接受，然而其具體療效及可能的作用機制尚不明確，相關(guān)研究較少。

本研究從臨床常用藥物醒腦靜及丁苯肽入手，觀察其對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的影響，從而推斷其可能的作用通道。

1 對象與方法

1.1 研究對象

健康成年雄性Wistar大鼠60只，體重230～270 g，由山東省實驗動物中心提供。

1.2 實驗設(shè)計

將60只成年雄性wistar大鼠(250±20) g隨機分為4組，即模型組(n=15)、醒腦靜組(n=15)、丁苯酞組(n=15)、醒腦靜聯(lián)合丁苯酞(聯(lián)合用藥)組(n=15)，每組又分為6、24、72 h三個亞組。

1.3 藥品

醒腦靜注射液(國藥準字Z41020664；產(chǎn)品批號為20141207；規(guī)格為10 mL)；丁苯酞氯化鈉注射液(國藥準字H20100041；產(chǎn)品批號為618151007；規(guī)格為100 mL，25 mg)

1.4 模型制作及干預(yù)

采用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，并于缺血2 h后實現(xiàn)再灌注損傷。干預(yù)：各組采用腹腔注射的方法給藥，模型組：生理鹽水 15 mL/kg；醒腦靜組：醒腦靜注射液5 mL/kg+生理鹽水10 mL/kg；丁苯酞組：丁苯酞注射液10 mL/kg+生理鹽水5 mL/kg；醒腦靜聯(lián)合丁苯酞組：醒腦靜5mL/kg+丁苯酞注射液10 mL/kg。

1.5 觀察指標

1.5.1 TUNEL染色陽性細胞及檢測 鏡下細胞核顏色呈棕黃色，形態(tài)固縮，胞體縮小的為陽性細胞(即凋亡細胞)。TUNEL染色陽性細胞計數(shù)：每只大鼠取3張切片(各組各時間點的每只大鼠采取相似的3個部位)，每張切片采集高倍鏡下(10×40倍)隨機的3個非重疊視野，記數(shù)每個視野中的100個細胞中凋亡細胞個數(shù)，從而計算凋亡陽性細胞率(凋亡陽性細胞率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%)，取其均數(shù)。

1.5.2 免疫組化染色陽性細胞及檢測 Bcl-2、Bax陽性細胞與背景比較，胞漿、胞膜染成棕黃色。Bcl-2、Bax陽性細胞計數(shù)：在400倍光鏡下每張切片隨機取缺血側(cè)大腦皮質(zhì)3個不重疊高倍視野，計數(shù)其陽性細胞數(shù)，每只大鼠取3張相似部位切片計數(shù)，取其均數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TUNEL染色陽性的凋亡細胞 凋亡細胞數(shù)總體趨勢是模型組最高，醒腦靜組及丁苯酞組不同程度降低，醒腦靜聯(lián)合丁苯酞組最低，其中丁苯酞組與模型組，聯(lián)合用藥組與模型組及丁苯酞組與聯(lián)合用藥組之間在6、24、72 h時間點的差異均明顯(P均<0.05)，而醒腦靜組與模型組的比較僅24 h時間點上有明顯差異，6 h與72 h時間點無明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 大鼠腦缺血再灌注后凋亡陽性細胞率的變化，%)

注：與模型組比較，▲P<0.05，◆P>0.05，▽P<0.05；與醒腦靜組比較，★P<0.05；與丁苯酞組比較，※P<0.05

2.2 Bcl -2 和Bax 蛋白表達水平 丁苯酞組及聯(lián)合用藥組在6、24、72 h時間點Bcl-2陽性表達水平較模型組均有提高(P均<0.05)，聯(lián)合用藥組Bcl-2陽性表達水平在各時間點均最高(P<0.05)。醒腦靜組在各時間點與模型組比較無明顯差異(P>0.05)。丁苯酞組及聯(lián)合用藥組在6、24、72 h時間點Bax陽性表達水平較模型組均有降低(P<0.05)。聯(lián)合用藥組Bax陽性表達水平在各時間點均最低(P<0.05)。醒腦靜組在各時間點與模型組比較均無明顯差異(P均>0.05)。

Bcl-2陽性表達水平于6 h明顯升高，24 h達峰值，Bax于6 h表達減少，24 h達最低值；聯(lián)合給藥組Bcl-2陽性表達水平在各時問點最高，而Bax陽性表達最少(P<0.05)(表2～3)。

表2 大鼠腦缺血再灌注后Bcl-2 陽性表達水平，個/每個400倍視野)

注：與模型組比較，▲P>0.05，▽P<0.05；與醒腦靜組比較，◆P<0.05，★P<0.05；與丁苯酞組比較，※P<0.05

表3 大鼠腦缺血再灌注后Bax陽性表達水平，個/每個400倍視野)

注：與模型組比較，▲P>0.05，▽P<0.05；與醒腦靜組比較，◆P<0.05，★P<0.05；與丁苯酞組比較，※P<0.05

3 討 論

缺血性腦血管病(ICVD)是一種常見的臨床疾病，其發(fā)病率呈上升趨勢，致殘率較高，因此研究腦缺血后的病理生理過程及對其病理過程進行干預(yù)研究有其理論及現(xiàn)實意義。缺血性腦損傷是一個多環(huán)節(jié)、多反應(yīng)的復(fù)雜病理生理過程。在人體和動物中腦組織對缺血、缺氧導(dǎo)致的損害都非常敏感，相關(guān)研究顯示阻斷血流30 s腦代謝即發(fā)生改變，1 min后神經(jīng)元功能活動停止，缺血超過5 min可發(fā)生腦梗死。腦缺血后神經(jīng)元的損傷也是具有選擇性的，輕度缺血時僅有某些種類的神經(jīng)元喪失，完全持久、長時間的缺血可導(dǎo)致各種神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及內(nèi)皮細胞均有壞死。因此，腦缺血時腦組織損害的程度與缺血時供血保留的水平及缺血持續(xù)時間有關(guān)。腦梗死的治療無外乎重新建立腦血供，然而臨床及實驗均證明在腦缺血中斷后如果腦血流再通超過有效的時間窗，腦損傷可繼續(xù)加劇，產(chǎn)生所謂的缺血-再灌注損傷。 再灌注損傷機制復(fù)雜，已有的研究顯示其機制主要包括自由基過度形成和自由基“瀑布式”連鎖反應(yīng)、神經(jīng)細胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸細胞毒性作用、炎癥級聯(lián)反應(yīng)、血管內(nèi)皮細胞功能紊亂等。具體過程并不十分明確。

1972 年 Kerr首次提出了細胞凋亡這一概念，細胞凋亡被認為是與細胞有絲分裂發(fā)揮完全相反作用，是神經(jīng)細胞的程序性、主動性死亡，是可以控制細胞缺失的一種機制。其過程十分復(fù)雜，有一系列酶參與的過程，當(dāng)機體的正常細胞在受到生理、病理性刺激或者環(huán)境劇烈變化時誘導(dǎo)或抑制細胞凋亡的發(fā)生。既往研究證實凋亡可以發(fā)生在缺血性腦血管病阿爾茨海默病、帕金森綜合癥等。近年來腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡相關(guān)方面的研究再次成為熱點。Bcl-2 家族在凋亡蛋白家族中起著舉足輕重的作用，其中包括抗凋亡蛋白 Bcl-2、Bcl-x L 和促凋亡蛋白 Bax 和 Bak。 細胞凋亡發(fā)揮作用具有內(nèi)在途徑和外在途徑兩種，即細胞表面死亡受體途徑和線粒體途徑。Bcl-2 家族蛋白多定位于線粒體，多通過內(nèi)在途徑發(fā)揮作用。Bcl-2 家族蛋白在調(diào)節(jié)細胞色素 C 釋放中發(fā)揮核心作用。Bcl-2 家族調(diào)控細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展取決于促進抗凋亡蛋白-Bcl-2 和抑制凋亡蛋白-Bax 的相對濃度[1]。許多研究表明，過度表達 bcl-2 能夠減少腦梗死動物模型中缺血性腦損傷[2-3]，其主要作用是抑制細胞凋亡，是神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)保護性蛋白，其表達越多，腦保護作用越強[4]，而bax表達越多，腦損傷越重。因此，檢驗bcl-2與bax的水平可反映細胞凋亡的水平。

醒腦靜作為臨床常用的中成藥，具有清熱解毒、涼血活血、開竅醒腦。常用于腦栓塞、腦出血急性期、顱腦外傷等。但具體的作用機制及作用效果研究較少。在中醫(yī)中藥方面Lv HD及Jia D等[5-6]在研究丹酚酸B及三七多糖對腦缺血后的神經(jīng)系統(tǒng)保護時也發(fā)現(xiàn)可能與抑制bax表達或提高bcl-2的表達有關(guān)。那么臨床常用中成藥醒腦靜對神經(jīng)系統(tǒng)的保護是否也有類似的影響呢？該方面的研究較少。

近年來，Junga YS及Hua K等[7-8]的研究顯示普伐他汀、依達拉奉、丁苯肽等藥物降低腦缺血后神經(jīng)元損傷可能與通過抑制bax表達或提高bcl-2的表達有關(guān)。在腦缺血或腦缺血再灌注損傷治療方面神經(jīng)細胞的凋亡控制的程度可能直接關(guān)系預(yù)后。丁苯酞是從芹菜籽中提取出來的有效成分，dl- 3-正丁基苯酞( dl-NBP) 學(xué)結(jié)構(gòu)是左旋體，后經(jīng)人工合成為消旋體。其主用作用靶點為血管內(nèi)皮，具有穩(wěn)定神經(jīng)血管單元[9]、促進血管生成、增加灌注血管數(shù)、減少梗死體積、改善神經(jīng)功能缺損的作用[10]。丁苯酞在缺血性腦血管病及腦缺血再灌注損傷中的應(yīng)用越來越廣泛，其療效被廣大醫(yī)務(wù)工作者及實驗機構(gòu)認可，廣泛應(yīng)用于臨床。其可能的作用機制是通過抑制神經(jīng)細胞凋亡來實現(xiàn)神經(jīng)保護作用的。但其對神經(jīng)細胞凋亡的影響程度及可能的作用通道尚不明確。

通過研究醒腦靜、丁苯酞及二者聯(lián)合應(yīng)用對腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡及bcl-2和bax表達的影響，不僅可以通過對神經(jīng)細胞凋亡的研究來反映上述藥物的臨床療效、研究二者的相互作用，為臨床是否聯(lián)合該兩種藥物提供理論依據(jù)；也可以通過對凋亡蛋白bcl-2/bax的研究來推斷可能的作用通道，必將對新的靶向作用藥物的研究提供新的實驗依據(jù)。

本研究顯示模型組、醒腦靜組、丁苯酞組及聯(lián)合用藥組梗死周圍組織明顯水腫、壞死，可見許多深染、固縮核細胞及凋亡細胞。TUNEL染色陽性的凋亡細胞數(shù)總體趨勢是模型組最高，醒腦靜組及丁苯酞組不同程度降低，醒腦靜聯(lián)合丁苯酞組最低。這說明醒腦靜、丁苯酞具有對抗腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡的作用。二者聯(lián)合應(yīng)用對抗神經(jīng)細胞凋亡的作用最強，優(yōu)于單用醒腦靜和丁苯酞。其中丁苯酞組與模型組、聯(lián)合用藥組與模型組及丁苯酞組與聯(lián)合用藥組之間在6、24、72 h時間點的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而醒腦靜組與模型組的比較僅24 h時間點上差異有統(tǒng)計學(xué)意義，6 h與72 h時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明醒腦靜抗神經(jīng)細胞凋亡作用是有限的，單用時該藥物在24 h的時候作用顯現(xiàn)。丁苯酞的抗凋亡作用優(yōu)于醒腦靜。但聯(lián)合應(yīng)用醒腦靜及丁苯酞會令該兩種藥物的抗凋亡作用明顯增強。二者聯(lián)合應(yīng)用時抗凋亡作用的增強是單純的疊加效應(yīng)，還是兩種藥物有某種協(xié)同作用呢？這個問題可以從上述藥物對bcl-2/bax表達的影響來回答。

丁苯酞組及聯(lián)合用藥組在6、24、72 h時間點Bcl -2陽性表達水平較模型組均有提高，而同時Bax陽性表達水平較模型組均有降低。這可能與神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。說明丁苯酞及聯(lián)合應(yīng)用醒腦靜和丁苯酞可能是通過影響凋亡蛋白bcl-2/bax的表達水平來影響神經(jīng)細胞凋亡，從而起到腦保護作用。至少抗凋亡是其作用靶點之一。醒腦靜組在各時間點與模型組比較，Bcl-2、Bax陽性表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明醒腦靜不是通過影響凋亡蛋白bcl-2/bax表達的途徑實現(xiàn)抗凋亡作用的。其較弱的抗神經(jīng)細胞凋亡作用另有通道，有待下一步試驗中進一步研究。聯(lián)合用藥組Bcl-2陽性表達水平在各時間點均最高，Bax均最低，說明雖然醒腦靜本身不具有影響凋亡蛋白bcl-2/bax表達的作用，但其可通過增強丁苯酞作用的方式來實現(xiàn)對抗神經(jīng)細胞凋亡，實現(xiàn)腦缺血再灌注損傷后的腦保護作用。這說明臨床上聯(lián)合應(yīng)用醒腦靜及丁苯酞是有實際作用的，聯(lián)合用藥效果更佳，并且該作用是通過醒腦靜增強丁苯酞作用的方式實現(xiàn)的。

另外，Bcl-2陽性表達水平于6 h明顯升高，24 h達峰值，Bax于6 h表達減少，24 h達最低值；聯(lián)合給藥組Bcl-2陽性表達水平在各時問點最高，而Bax陽性表達最少。這提示通過該通道的作用來實現(xiàn)對抗神經(jīng)細胞凋亡作用，早期干預(yù)(24 h以內(nèi))可能效果更佳。

總之，丁苯酞可明顯減少大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡，具有一定的神經(jīng)保護作用; 其神經(jīng)保護作用可能是通過上調(diào) bcl-2 的表達、下調(diào)Bax的表達來實現(xiàn)的。醒腦靜具有有限的抑制神經(jīng)細胞凋亡作用，但其具體的作用機制不詳。醒腦靜可通過增強丁苯酞影響凋亡蛋白bcl-2/bax表達的方式抑制神經(jīng)細胞凋亡，從而起到腦保護作用。本實驗結(jié)果提示神經(jīng)營養(yǎng)藥物可以通過抑制神經(jīng)細胞凋亡方式而起神經(jīng)保護作用，這就為臨床上缺血性腦血管疾病的防治提供了新思路。

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(2016-10-09收稿)

Effects of Xingnaojing injection combined with butylphthalide(NBP) on the expression of apoptosis after cerebral ischemia reperfusion

YanRuiyun,WangShanjun,WangYan,etal.

QingdaoUniversityMedicalCollege,QingDao26600

Objective To observe the effects of Xingnaojing injection, butylphthalide(NBP) and combined with them on the expression of apoptosis,Bcl-2 and Bax in rats after cerebral ischemia reperfusion. To investigate whether there are protective effects on brain, and to explore its possible mechanism.Methods Sixty male Wistar rats by modified suture method for cerebral ischemia reperfusion (MCAO) were randomly assigned into four groups: model group, Xingnaojing group, butylphthalide(NBP) group,combined with NBP and xingnaojing(combination) group. Each group was divided into three subgroups: 6 h, 24 h and 72 h. The apoptosis of nerve cells was detected by transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling (TUNEL), and the expression of Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemistry.Results In the model group, a large number of apoptotic cells were observed in the lesion area. In NBP group and Xingnaojing group,the number of apoptosis were significantly reduced, the combination group at the least level (P<0.05). In NBP group and combination group,the expression of bcl-2 was significantly lower than that in the model group. The combination group at the highest level, at each time point (P< 0.05). The expression of bax was to the contrary (P< 0.05).Conclusion The use of xingnaojing, NBP and combination of the two have neuroprotective effects through the inhibition of nerve cell apoptosis, in which the combination group do the best. NBP can relieve the brain damage by up-regulating the expression of Bcl-2 and down-regulating the expression of Bax. Xingnaojing injection itself cannot influence the expression of bcl-2 and Bax. But it can enhance the effect of NBP to the expression of bcl-2 and Bax. It can indirectly alleviate cerebral ischemia reperfusion injury.

Cerebral ischemia reperfusion injury Bcl-2 Bax Apoptosis

26600 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院[閆瑞云(現(xiàn)工作于山東省昌樂縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)]；濰坊市益都中心醫(yī)院神經(jīng)外科(王善軍)；青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[王雁(通信作者)]

R743.3

A

1007-0478(2017)02-0099-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.02.004