吳嬋姬 陸正齊

?

粒細(xì)胞集落刺激因子對大鼠局灶性腦缺血的療效及其機(jī)制分析

吳嬋姬 陸正齊

目的 探討粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)對大鼠局灶性腦缺血的療效及其相關(guān)機(jī)制。方法 采用改良線栓法建立永久性局灶性大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型大鼠12只，并隨機(jī)分為2組，G-CSF組術(shù)后2 h用G-CSF行皮下注射干預(yù)，對照組行PBS干預(yù)，采用t檢驗(yàn)比較組間術(shù)后24 h腦梗死灶的體積差異(TTC染色法)和炎癥及趨化因子TNF-α、TGF-β、IL-10、MCP-1 mRNA水平(RT-PCR法)和CD11b分子的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色法)水平差異。結(jié)果 G-CSF組比對照組梗死體積減小19.6%(P=0.001)；G-CSF組MCP-1mRNA水平較對照組減少約22%(P=0.03)，G-CSF組IL-10 mRNA水平較對照組增高47%(P=0.01)，而TGF-βmRNA則較對照組增高約1倍(P<0.01)，但TNF-αmRNA水平在2組間無明顯差異(P=0.88)；G-CSF組與對照組缺血區(qū)域的CD11b浸潤數(shù)目無明顯差異(P=0.61)。結(jié)論 G-CSF能顯著減少局灶性腦缺血的梗死體積，機(jī)制可能涉及TGF-β、IL-10、MCP-1等一系列重要的炎癥和趨化因子。

粒細(xì)胞集落刺激因子 局灶性腦缺血 療效 機(jī)制

缺血性腦卒中是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)疾病，是目前致殘和致死的主要原因之一，給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)，其中最常見的是大腦中動(dòng)脈供血區(qū)的腦梗死，約占腦梗死的75%左右[1]。在急性腦梗死的治療中雖然超急性期組織纖溶酶原激活物和尿激酶的溶栓治療能取得明顯的療效，但溶栓治療時(shí)間窗小，并有其潛在的出血風(fēng)險(xiǎn)，限制了它的廣泛應(yīng)用[2]。近年來以神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)和造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)為主的細(xì)胞替代治療也取得較明顯的療效，但NSCs的不易獲得性和HSCs來源上的倫理問題以及移植存在的免疫排斥、感染等一系列問題限制了這類干細(xì)胞的發(fā)展與應(yīng)用，因此利用藥物刺激增強(qiáng)自體內(nèi)源性干細(xì)胞的修復(fù)功能成為新的研究靶向熱點(diǎn)[3]。

粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF)作為內(nèi)源性HSCs的強(qiáng)力動(dòng)員劑在CNS疾病的治療中引起了研究者極大的關(guān)注[4]。研究表明給予G-CSF治療能刺激內(nèi)源性神經(jīng)再生，動(dòng)員骨髓干細(xì)胞入血并遷移入腦，促進(jìn)神經(jīng)再生與神經(jīng)功能的修復(fù)，同時(shí)還能促進(jìn)新生血管形成，在腦梗死的動(dòng)物模型中取得了良好的療效，但對其機(jī)制的研究至今尚無明確結(jié)論[5]。因此，本研究擬通過建立大鼠永久性局灶性大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型來闡明G-CSF在大鼠永久性局灶性腦缺血模型中的療效以及G-CSF是否通過調(diào)節(jié)重要的趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)的表達(dá)及T細(xì)胞免疫功能來影響炎癥過程和發(fā)揮保護(hù)作用，為G-CSF的臨床應(yīng)用提供更進(jìn)一步的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大鼠MCAO模型建立

選取SPF級健康成年雄性SD大鼠(購于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號：0027097、0028590、0028629)，體重250～300 g，用改良線栓法[6]建立大鼠MCAO模型；建模后采用5分制評分標(biāo)準(zhǔn)(無神經(jīng)損傷癥狀為0分；不能完全伸展對側(cè)前爪為1分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分；向?qū)?cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走、意識昏迷為4分)對模型大鼠進(jìn)行評分，≥1分者為建模成功并入組實(shí)驗(yàn)，最終共計(jì)納入12只MCAO模型大鼠。

1.2 分組與干預(yù)

隨機(jī)將MCAO模型大鼠平均分為2組：A組(G-CSF組)在大鼠MCAO術(shù)后2 h給予G-CSF(50 ug/kg)單次皮下注射治療1次；B組(對照組)在大鼠MCAO術(shù)后2 h給予同等體積的PBS代替G-CSF進(jìn)行皮下注射治療。所有大鼠在術(shù)后24 h取腦組織行RT-PCR及免疫組織化學(xué)等檢測。

1.3 G-CSF的療效評價(jià)

療效評價(jià)通過測定腦梗死體積決定，G-CSF組與對照組各6只，MCAO術(shù)后24 h迅速斷頭取腦，-20 ℃冰箱中速凍15～20 min后腦托固定，冠狀切腦片(2 mm厚)，放入2%TTC中37℃避光染色30 min，正常腦組織染成玫瑰紅色，梗死組織不被染色呈白色，將腦片移入4%多聚甲醛固定過夜，掃描染色后的腦片用Image J圖像分析軟件計(jì)算梗死體積。計(jì)算公式：校正梗死體積=梗死體積×[1-{(梗死側(cè)半球體積-對側(cè)半球體積)/對側(cè)半球體積}]。

1.4 炎癥和趨化因子測定

采用實(shí)時(shí)RT-PCR方法測定MCAO術(shù)后24h大鼠腦組織缺血區(qū)域TNF-α、TGF-β、IL-10等炎癥相關(guān)因子及趨化因子MCP-1 mRNA的表達(dá)水平，采用免疫組化方法檢測MCAO術(shù)后24 h中性粒細(xì)胞表面標(biāo)記CD11b在大腦缺血區(qū)中的表達(dá)情況。RT-PCR的引物設(shè)計(jì)見表1。所有實(shí)驗(yàn)均參照標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。

表1 RT-PCR的引物設(shè)計(jì)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 G-CSF治療后MCAO大鼠腦梗死體積的變化

G-CSF治療后大鼠MCAO術(shù)后24h梗死體積較對照組明顯減小，對照組梗死體積為(340.8±19.4) mm3，G-CSF治療后減小為(274.0±30.0) mm3，G-CSF組比對照組梗死體積減小19.6%(P=0.001)，(圖1)。

圖1 TTC染色測定腦梗死體積

2.2 G-CSF治療后MCAO大鼠病灶內(nèi)趨化因子和炎癥因子的表達(dá)變化

G-CSF組MCP-1mRNA水平較對照組減少約22%(P=0.03)，G-CSF組IL-10 mRNA水平較對照組增高47%(P=0.01)，而TGF-βmRNA則較對照組增高約1倍(P<0.01)，但TNF-αmRNA水平在2組間無明顯差異(P=0.88)(表2)。

表2 缺血區(qū)腦組織炎癥相關(guān)因子mRNA的 相對表達(dá)水平比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，▲P<0.01

2.3 G-CSF治療后缺血區(qū)域腦組織中性粒細(xì)胞浸潤的改變

G-CSF組與對照組缺血區(qū)域的CD11b浸潤數(shù)目無明顯差異(32.83±5.67個(gè)/每個(gè)400倍視野vs. 30.83±7.30個(gè)/每個(gè)400倍視野,P=0.61)(圖2)。

圖2 免疫組化方法檢測顯示，MCAO術(shù)后24h缺血區(qū)腦組織CD11b浸潤情況(×400倍)(黃色箭頭所示為陽性細(xì)胞) A為G?CSF組，B為對照組

3 討 論

由于腦組織對缺血缺氧的高度敏感性，在急性腦梗死的過程中組織發(fā)生一系列的病理生理改變，細(xì)胞出現(xiàn)壞死與凋亡，并發(fā)生一系列的炎癥過程，包括促炎因子的表達(dá)、內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子與趨化因子的表達(dá)增加、小膠質(zhì)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的活化、白細(xì)胞的浸潤，T細(xì)胞在腦梗死的炎癥反應(yīng)過程中通過炎癥相關(guān)因子的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要的作用[7]。早期的研究認(rèn)為G-CSF在多種條件下能減少多種炎癥因子的表達(dá)水平[8]。本研究探討了G-CSF對腦梗死后梗死灶體積影響及相關(guān)炎性趨化因子的影響，結(jié)果顯示G-CSF在治療大鼠MCAO模型時(shí)可顯著減小腦部梗死灶體積，并且使抗炎因子IL-10、TGF-β增加，MCP-1的表達(dá)減少，但對促炎癥因子TNF-α的表達(dá)和缺血區(qū)域中性粒細(xì)胞(CD11b標(biāo)志)的表達(dá)無明顯影響，提示了G-CSF在腦梗死中特殊的抗炎特性。

IL-10作為一種抗炎因子能抑制許多促炎因子如TNF-α、IL-1β和IL-8的產(chǎn)生，在體外研究中IL-10能保護(hù)脂多糖/γ干擾素引起的少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡，并抑制iNOS的表達(dá)[9]。與IL-10類似，TGF-β在此扮演的生物學(xué)角色可能也為抑制免疫活性細(xì)胞的增殖和抑制多種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[10]。MCP-1是半胱氨酸趨化因子家族成員之一，在腦缺血發(fā)生后MCP-1表達(dá)增加，并在巨噬細(xì)胞在向腦缺血部位的遷移過程中起重要作用[11]，并且MCP-1能使單核細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1、IL-6表達(dá)量增加，加重炎癥反應(yīng)和組織的損傷，使梗死體積擴(kuò)大[12]。本研究認(rèn)為G-CSF在大鼠MCAO模型中的抗炎作用主要是通過增加IL-10和TGF-β、減少M(fèi)CP-1在病灶內(nèi)的表達(dá)來發(fā)揮其對腦梗死的保護(hù)作用。另外，本研究認(rèn)為中性粒細(xì)胞的浸潤并未因使用G-CSF而得到抑制，這與早期Lee等研究結(jié)果提示G-CSF治療能減少腦缺血后中性粒細(xì)胞的浸潤的結(jié)果[13]不相符，考慮原因可能是樣本量和實(shí)驗(yàn)方法的差異所致。TNF-α作為重要的促炎因子[14]，在IL-10和TGF-β都增加的情況下并不能明顯抑制它的表達(dá)，考慮可能原因是在腦梗死的病理機(jī)制中存在其它可促進(jìn)細(xì)胞分泌TNF-α的通路。

綜上所述，本研究初步明確了G-CSF在急性腦梗死治療中的安全性和有效性以及可能涉及的機(jī)制，為臨床G-CSF在急性腦梗死中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)理論參考，但該研究樣本量小，降低了檢驗(yàn)效能，因此期盼納入更多的模型小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，更希望進(jìn)一步的大規(guī)模多中心隨機(jī)雙盲臨床研究來證實(shí)G-CSF在治療急性腦梗死中的價(jià)值。

[1] Hansen CK,Christensen A,Ovesen C,et al.Stroke severity and incidence of acute large vessel occlusions in patients with hyper-acute cerebral ischemia:results from a prospective cohort study based on CT-angiography (CTA)[J].Int J Stroke,2015,10(3):336-342.

[2] Li P,Gan Y,Sun BL,et al.Adoptive regulatory T-cell therapy protects against cerebral ischemia[J].Ann Neurol,2013,74(3):458-471.

[3] Wei L,Fraser JL,Lu ZY,et al.Transplantation of hypoxia preconditioned bone marrow mesenchymal stem cells enhances angiogenesis and neurogenesis after cerebral ischemia in rats[J].Neurobiol Dis,2012,46(3):635-645.

[4] Chandran R,Cantin E.G-CSF induced neutrophil invasion of the CNS is inhibited by Interferon γ(VIR9P.1150)[J].The Journal of Immunology,2015,194(215):16-215.

[5] Zhao LR,Kessler J,Singhal S,et al.Use of SCF and G-CSF in the treatment of cerebral ischemia and neurological disorders:U.S.Patent 8,524,655[P].2013.

[6] Nagasawa H,Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion[J].Stroke,1989,20(8):1037-1043.

[7] Katsura K,Suda S,Abe A,et al.Brain protection therapy in acute cerebral infarction[J].J Nippon Med Sch,2012,79(2):104-110.

[8] Wildbaum G,Shahar E,Katz R,et al.Continuous G-CSF therapy for isolated chronic mucocutaneous candidiasis:complete clinical remission with restoration of IL-17 secretion[J].J Allergy Clin Immunol,2013,132(3):761-764.

[9] Zigmond E,Bernshtein B,Friedlander G,et al.Macrophage-restricted interleukin-10 receptor deficiency,but not IL-10 deficiency,causes severe spontaneous colitis[J].Immunity,2014,40(5):720-733.

[10]Katsuno Y,Lamouille S,Derynck R.TGF-β signaling and epithelial-mesenchymal transition in cancer progression[J].Curr Opin Oncol,2013,25(1):76-84.

[11]Daniele G,Guardado Mendoza R,Winnier D,et al.The inflammatory status score including IL-6, TNF-α,osteopontin, fractalkine, MCP-1 and adiponectin underlies whole-body insulin resistance and hyperglycemia in type 2 diabetes mellitus[J].Acta Diabetol,2014,51(1):123-131.

[12]Niu J,Jin Z,Kim H,et al.MCP-1-induced protein attenuates post-infarct cardiac remodeling and dysfunction through mitigating NF-κB activation and suppressing inflammation-associated microRNA expression[J].Basic Res Cardiol,2015,110(3):26.

[13]Lee ST,Chu K,Jung KH,et al.Granulocyte colony-stimulating factor enhances angiogenesis after focal cerebral ischemia[J].Brain Res,2005,1058(1/2):120-128.

[14]Kagoya Y,Yoshimi A,Kataoka K,et al.Positive feedback between NF-κB and TNF-α promotes leukemia-initiating cell capacity[J].J Clin Invest,2014,124(2):528-542.

(2016-06-21收稿)

The Effect and Mechanism of Granulocyte-Colony Stimulating Factor in Focal Cerebral Ischemia of Rat

WuChanji，LuZhengqi.

DepartmentofNeurology,HainanProvincialPeople’sHospital,Haikou570311

Objective To explore the effect and mechanism of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) in focal cerebral ischemia of rat.Methods Modified suture method was used to establish a permanent middle cerebral artery occlusion (MCAO) model in 12 rats, which were then randomly divided into two groups (G-CSF group, after 2 h line with G-CSF subcutaneously intervention and the control group, underwent PBS intervention), t tests were used to compare the cerebral infarction after 24 h (TTC staining), mRNA levels of inflammatory chemokines including TNF-α, TGF-β, IL-10, and MCP-1 (RT-PCR method), and expression level of CD11b (immunohistochemically staining) between the two groups.Results G-CSF group had reduced infarct volume of 19.6% compared with control group (P=0.001); MCP-1 mRNA levels inG-CSF group was the 78%-fold of that in control group(P=0.03); IL-10 mRNA levels in G-CSF group was the 147%-fold of that in control group (P=0.01), and TGF-β mRNA in G-CSF group was 1 fold higher than that in the control group (P<0.01), but TNF-α mRNA levels between the two groups was not statistically significant (P=0.88); no difference in the number of infiltrating CD11b in ischemic area between the two groups was found (P=0.61).Conclusion G-CSF can significantly reduce infarct volume after focal cerebral ischemia; the mechanisms may involve TGF-β, IL-10, MCP-1 and a series of important inflammatory and chemokines.

Granulocyte-colony stimulating Factor Cerebral ischemia Effect Mechanism

570311 ?？?，海南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(吳嬋姬)；中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(陸正齊)

R743.3

A

1007-0478(2017)02-0095-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.02.003