陳曉娟 肖宗宇 侯倩 才鼎

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·論 著·

高海拔地區(qū)骨髓源神經(jīng)干細胞及BDNF聯(lián)合移植對大鼠腦缺血再灌注模型的治療

陳曉娟 肖宗宇 侯倩 才鼎

目的 探討高海拔地區(qū)大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells，BMSCs-NSCs)及腦源性神經(jīng)生長因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)聯(lián)合移植對大鼠腦缺血再灌注模型的療效及其相關(guān)機理。方法 60只Wistar雄性大鼠，置西寧地區(qū)正常飼養(yǎng)，制備大鼠腦缺血-再灌注損傷模型；模型制備完畢后立體定向下進行細胞移植治療，將大鼠分為3組，即A組：大鼠骨髓源性神經(jīng)球組(BMSCs-NSCs組，n=20)；B組：大鼠骨髓源性神經(jīng)球聯(lián)合BDNF組(BMSCs-NSCs+BDNF組，n=20)，注射大鼠骨髓源性神經(jīng)球細胞的同時，聯(lián)合注射100 ng BNDF；C組：對照組(僅注射DMEM/F12培養(yǎng)基，n=20)；術(shù)后對其神經(jīng)功能進行評定，并于術(shù)后24 d取腦組織，行Nestin、GFAP、Map2免疫熒光檢測。結(jié)果 細胞移植后第3 d，各組間神經(jīng)功能評分無顯著性差異；細胞移植后第14 d BMSCs-NSCs+BDNF組神經(jīng)功能評分顯著優(yōu)于BMSCs-NSCs組，BMSCs-NSCs組優(yōu)于對照組；免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，BMSCs-NSCS+BDNF組Nestin、GFAP、Map2的IOD值均顯著高于BMSCs-NSCs組；BMSCs-NSCs+BDNF組、BMSCs-NSCs組各檢測指標(biāo)水平均高于對照組；Nestin、GFAP、Map2的表達主要集聚于腦梗死灶與正常腦組織交界處。結(jié)論 在西寧地區(qū)聯(lián)合移植大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞及BDNF可顯著促進大鼠大腦中動脈閉塞再灌注損傷模型的神經(jīng)功能恢復(fù)。

骨髓基質(zhì)干細胞 神經(jīng)干細胞 骨髓源神經(jīng)干細胞 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 高海拔

近年來，隨著神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)研究的不斷深入，部分研究者將骨髓基質(zhì)細胞( bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出了骨髓源神經(jīng)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells，BMSCs-NSCs)。腦源性神經(jīng)生長因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是一種具有防止神經(jīng)元死亡功能的蛋白質(zhì)，在體外它可保持NSCs的活性和促進其向神經(jīng)元分化[3-4]。為探討在高海拔地區(qū)大鼠BMSCs-NSCs細胞移植對大鼠腦閉塞-再灌注損傷模型的療效，本研究擬在西寧地區(qū)(平均海拔約2200米)制備Wistar大鼠大腦中動脈閉塞-再灌注損傷模型，并在立體定向下進行顱內(nèi)細胞移植，觀察BMSCs-NSCs及BDNF聯(lián)合移植對大鼠腦缺血再灌注模型的療效，并初步探討其相關(guān)機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠共60只，平均體重(200±20) g，購自蘭州大學(xué)實驗動物中心，合格證號為SCXK(甘)2013-0002。

1.2 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶由Gibco公司購得。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)為Hyclone公司產(chǎn)品。B27添加劑購自Invitrogen公司。表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)由Peprotech公司購得，小鼠抗Nestin抗體、兔抗GFAP抗體、小鼠抗Galc抗體為Chemicon公司產(chǎn)品，兔抗CD133抗體購自Santa Cruz公司，小鼠抗Map2抗體、兔抗β-tubulin III抗體由Abcam公司生產(chǎn)。Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 594標(biāo)記羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG由Molecular Probes公司生產(chǎn)。DAPI封片劑為Vector Laboratories公司產(chǎn)品。

1.3 大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)及鑒定

選取成年雄性Wistar大鼠，無菌條件下取雙側(cè)股骨和肱骨，反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓組織懸液，以含10%FBS的DMEM/F12進行培養(yǎng)；收集生長狀態(tài)良好的BMSCs，經(jīng)0.25%胰酶消化，制備單細胞懸液，以含20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF及1∶50的B27添加劑的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基重懸，接種密度為2×105細胞/ mL，隔天換半液1次并添加相應(yīng)劑量生長因子；收集在無血清培養(yǎng)條件下形成的神經(jīng)球，采用免疫熒光法檢測神經(jīng)干細胞特異性標(biāo)志物CD133和Nestin。

1.4 大鼠大腦中動脈閉塞再灌注損傷模型的建立

參考Longa等[5]的報道，采用3.6%水合氯醛對大鼠按1mL/100g體重的劑量進行腹腔注射麻醉后取仰臥位固定于手術(shù)臺上，分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，結(jié)扎并剪斷頸外動脈遠端，經(jīng)頸外動脈向頸內(nèi)動脈插入線栓，阻斷大腦中動脈血供，缺血2 h后拔除線栓，成功制備大腦中動脈閉塞再灌注損傷模型。

1.5 大鼠腦缺血再灌注模型的治療

成功制備大鼠腦缺血再灌注模型后第3 d，將各大組大鼠分為3組，即A組：大鼠骨髓源性神經(jīng)球組(BMSCs-NSCs組，n=20)；B組：大鼠骨髓源性神經(jīng)球聯(lián)合BDNF組(BMSCs-NSCs-BDNF組，n=20)，注射大鼠骨髓源性神經(jīng)球細胞的同時，聯(lián)合注射100ng BNDF；C組：對照組(僅注射DMEM/F12培養(yǎng)基，n=20)；收集BMSCs-NSCs，并調(diào)整活細胞密度為5×105/10 μL DMEM/F12培養(yǎng)基；將大鼠顱平位固定于立體定向儀，選右側(cè)大鼠腦尾狀核為接種靶點，其坐標(biāo)為前囟中點前1.0 mm，矢狀縫右旁開3.0 mm，硬膜下5.0 mm，對各組大鼠進行顱內(nèi)細胞移植治療；分別于細胞移植治療后第3、7、14、21 d，采用行走測試對各組大鼠進行神經(jīng)功能評分，1分為能直線行走；2分為不能直線行走；3分為因癱瘓，只能原地旋轉(zhuǎn)；4分為因癱瘓，不能動；細胞移植治療后21 d，收集各組大鼠，對腦組織切片行Nestin、GFAP、Map2免疫組化檢測，收集圖片，利用IPP(Image Pro-Plus)對圖片進行分析，測量陽性細胞的總光密度(Integrated Optical Density，IOD)值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)及鑒定

將大鼠BMSCs轉(zhuǎn)入含20 ng/mLbFGF、20 ng/mLEGF及B27添加劑(1∶50)的DMEM/F12培養(yǎng)基后呈懸浮球狀聚集生長。經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測，所形成的細胞球呈CD133和Nesitn陽性(圖1)。

圖1 大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞呈Nestin(綠色、圖A)、CD133(紅色、圖B)陽性，細胞核以DAPI復(fù)染(藍色、圖C)，熒光顯微鏡，標(biāo)尺為50μm

2.2 各組神經(jīng)功能評定

細胞移植內(nèi)7 d行神經(jīng)功能評定，各組間無顯著性差異(P>0.05)；細胞移植14 d后， BMSCs-NSCs+BDNF組神經(jīng)功能評分優(yōu)于BMSCs-NSCs組，BMSCs-NSCs組優(yōu)于對照組(P<0.05)；隨時間的推移，對照組的神經(jīng)功能也有一定程度的恢復(fù)。

2.3 各組腦組織免疫組化檢測

于顱內(nèi)細胞移植術(shù)后第21 d取大鼠腦組織，行免疫熒光檢測腦梗塞病灶內(nèi)Nestin、GFAP、Map2表達情況，行總光密度值檢測，發(fā)現(xiàn)BMSCs-NSCs+BDNF組Nestin、GFAP、Map2的IOD值均顯著高于BMSCs-NSCs組；BMSCs-NSCs+BDNF組、BMSCs-NSCs組各檢測指標(biāo)水平均高于對照組。對照組中MAP2表達為陰性，且BMSCs-NSCs+BDNF組、BMSCs-NSCs組中Nestin、GFAP、Map2的表達主要集聚于腦梗死灶與正常腦組織交界處(圖2～4，表2)。

表1 行走測試比較，分)

圖2 Nestin表達情況 A為BMSCs?NSCs+BDNF組；B為BMSCs?NSCs組；C為對照組

圖3 GFAP表達情況 A為BMSCs?NSCs+BDNF組；B為BMSCs?NSCs組；C為對照組

圖4 Map2表達情況 A為BMSCs?NSCs+BDNF組；B為BMSCs?NSCs組；C為對照組

表2 細胞移植治療后第21 d，各組中 Nestin、Map2、GFAP表達率

注：3組間Nestin、Map2、GFAP IOD值比較有明顯差異(P<0.05)

3 討 論

神經(jīng)干細胞 (neural stem cells，NSCs)是指分布于神經(jīng)系統(tǒng)的具有無限增殖、自我更新及多向分化潛能的細胞，作為一種后備儲備，它在一定條件下可以進行增殖、遷移和分化并參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)或細胞正常死亡的更新。但是成體中樞神經(jīng)損傷后其自我再生能力有限，遠遠不能完成神經(jīng)功能的再生修復(fù)，特別是大面積受損的中樞神經(jīng)組織僅靠自身的神經(jīng)干細胞修復(fù)無法實現(xiàn)。如何促進顱腦損傷后神經(jīng)再生和神經(jīng)功能恢復(fù)是當(dāng)前研究的熱點和難點[6-7]。近年來，研究表明骨髓基質(zhì)細胞于體外通過誘導(dǎo)分化可獲得骨髓源性神經(jīng)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells，BMSCs- NSCs)[1-2]。BMSCs- NSCs的成功培養(yǎng)避免了神經(jīng)干細胞或胚胎干細胞等其它干細胞涉及的來源有限、取材困難、免疫排斥、倫理等問題。因此，BMSCs- NSCs在應(yīng)用神經(jīng)干細胞治療人類某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病及損傷方面具有良好的臨床應(yīng)用前景。

BDNF是一種具有防止神經(jīng)元死亡功能的蛋白質(zhì)。BDNF-mRNA廣泛地存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織內(nèi)。在中樞其廣泛分布在大部分腦區(qū)如上丘、大腦皮層和海馬等。BDNF在體外可保持NSCs的活性和促進其向神經(jīng)元分化。體內(nèi)外研究均表明，BDNF可顯著增加神經(jīng)干細胞或神經(jīng)前體細胞分化為神經(jīng)元的數(shù)量[8-9]。因此，本研究選用BDNF，擬通過聯(lián)合移植大鼠骨髓源性神經(jīng)干細胞和BDNF，增加骨髓源性神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元的數(shù)量，改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能。

西寧地區(qū)屬于高海拔地區(qū)，市區(qū)海拔約2200米，空氣稀薄，含氧量較平原地區(qū)為低，人們長期處于一個低壓低氧刺激的環(huán)境，對缺血、缺氧耐受力相對較強，高海拔地區(qū)人群可能具有更強的腦保護力，在發(fā)生腦缺血再灌注損傷時可能會有更小的梗死體積和更輕的臨床癥狀[10]。為明確在高海拔地區(qū)進行腦組織缺血再灌注損傷的細胞移植的療效如何？本研究設(shè)計了該實驗。本實驗發(fā)現(xiàn)，在MACO/R模型細胞移植后第21 d，BMSCs-NSCs+BDNF組的神經(jīng)功能恢復(fù)顯著優(yōu)于BMSCs-NSCs組及對照組；且顱內(nèi)表達Nestin陽性細胞顯著高于BMSCs-NSCs組，這些標(biāo)志物的表達主要集中于細胞移植區(qū)及腦梗死病灶與正常腦組織交界處。本研究推測，骨髓源神經(jīng)干細胞移植入顱內(nèi)后繼續(xù)增殖并分化，在細胞移植治療后第21 d，在移植區(qū)仍有大量神經(jīng)干細胞存活，且BMSCs-NSCs+BDNF組表達Nestin比例更高，表明BDNF促進了神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的存活及增殖。BMSCs-NSCs+BDNF組神經(jīng)元(Map2)、星形膠質(zhì)細胞(GFAP)表達率均顯著高于BMSCs-NSCs組，而對照組中無Map2表達，表明添BDNF后骨髓源神經(jīng)干細胞顯著促進了骨髓源神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞分化的比例。結(jié)合神經(jīng)功能評分，聯(lián)合移植治療顯著改善了大鼠腦缺血—再灌注損傷模型的神經(jīng)功能。由此可見，BDNF顯著增強了骨髓源神經(jīng)干細胞移植治療的療效，其可能機制如下：①在BDNF的影響下一部分神經(jīng)干細胞分化神經(jīng)元，促進了神經(jīng)功能的恢復(fù)；②神經(jīng)干細胞或已分化的星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元等分泌多種細胞因子，促進神經(jīng)的再生；③神經(jīng)干細胞分化為少突膠質(zhì)細胞，參與了神經(jīng)細胞髓鞘的形成，促進了神經(jīng)纖維的生長，促進了神經(jīng)功能的恢復(fù)。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)無論細胞移植組或?qū)φ战M，在腦梗死病灶及正常腦組織邊界仍有部分細胞表達Nesin，由此可推測此部分神經(jīng)干細胞可能來源于自體神經(jīng)干細胞，在機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時自體神經(jīng)干細胞參與了神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)。雖然對照組中在腦梗死區(qū)中無Map2的表達，但在腦梗死病灶與正常腦組織邊緣有大量GFAP陽性細胞表達。從神經(jīng)功能評分來看，隨著時間推移，對照組大鼠神經(jīng)功能也有一定程度的恢復(fù)，由此本研究推測其神經(jīng)功能的恢復(fù)可能來源于自體神經(jīng)干細胞，也可能系腦梗死后病灶周圍大量表達GFAP的膠質(zhì)細胞增殖、釋放神經(jīng)生長因子等促進了神經(jīng)功能的恢復(fù)。

綜上所述，在高海拔地區(qū)聯(lián)合移植大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞及BDNF可顯著促進大鼠大腦中動脈腦閉塞—再灌注損傷模型的神經(jīng)功能恢復(fù)，但其潛在機制仍需進一步研究。

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(2016-06-26收稿)

The effects of BDNF on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells in high altitude

ChenXiaojuan,XiaoZongyu,HouQian,etal.

*DepartmentofNeurology,People’sHospitalofQinghaiProvince,Xining810000

Objective To investigate the efficacy of neural stem cells derived bone marrow to repair rats MACO/R model in high altitude, and to discuss the mechanism.Methods 60 Wistar rats were prepared for MACO/R model in Xining, then neural stem cells derived from bone marrow were injected in the right striatum. And these rats were randomly divided into three groups: A: BMSCs-NSCS group (n=20), B: BMSCs-NSCS+BDNF group (n=20), C: control group (n=20). Then neurological scales were tested, the expression of Nestin, GFAP, Map2 were tested by Immunochemistry. Results There was no significance difference in neurological scales in different groups in day 3. The neurological function was recovered after cell therapy, and the neurological function was better in BMSCs-NSCs+BDNF group. The expression of Nestin, GFAP, Map2 were much higher in BMSCs-NSCS+BDNF group than BMSCs-NSCS groups and control group. And the Expression of MAP2, β-tubulin, GFAP, CD133, Nestin were gathered in the injection area and the conjunction area between the normal brain tissue and the cerebral infarction.Conclusion Transplantation of BMSCs-NSCS and BDNF could significantly promote the recovery of neurological function in MACO/R model in Xining area.

Bone marrow mesenchymal stem cells Neural stem cells Bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells BDNF High altitude

青海省科技創(chuàng)新能力促進計劃項目(編號為2015-ZJ-943Q)

810000 西寧，青海省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(陳曉娟 侯倩 才鼎)；青海大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(肖宗宇)

R743.3

A

1007-0478(2017)02-0087-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.02.001