王想福 孫鳳歧* 葉丙霖 范有福 李盛華 溫少瑾

1.甘肅省中醫(yī)院脊柱微創(chuàng)骨科，甘肅 蘭州 730050 2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050

類黃酮是自然黃酮的類似物，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，它可以抑制破骨細(xì)胞引起的骨吸收。在體外實(shí)驗(yàn)中，它可以抑制破骨細(xì)胞的形成和骨吸收。在一些國家，類黃酮被用來治療骨質(zhì)疏松。

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的、全身性的骨代謝疾病，其特征是骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退化，導(dǎo)致骨脆性增加從而引起腰背疼痛、骨密度下降、骨折等常見癥狀，并會發(fā)生身長縮短、駝背等。骨質(zhì)疏松導(dǎo)致代謝紊亂，從而造成血鈣偏高，由此引起一系列與鈣代謝紊亂相關(guān)的并發(fā)癥，如高血壓、冠心病、動脈硬化及腦血管疾病等[1]。國內(nèi)學(xué)者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國50歲以上骨質(zhì)疏松約有6 944萬人，40歲以上漢族人群骨質(zhì)疏松癥患病率為12.4%，并且女性明顯多于男性[2-3]。國外部分學(xué)者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，美國每年有2 500萬骨質(zhì)疏松癥患者，其中因骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨折約為150萬人，約占6%[1]，而我國每年因骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致骨折的人數(shù)卻高于10%。因此，骨質(zhì)疏松的治療已成為亟待解決的社會問題。鑒于目前西藥治療的費(fèi)用高、療程長、不良反應(yīng)較多等弊端，大力發(fā)展其他療法治療該病顯得尤為重要。

類黃酮是一種廣泛存在于自然界中的酚類物質(zhì)，作為一種植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于多種植物中[4]。大量動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)類黃酮可以抑制骨細(xì)胞的吸收，促進(jìn)骨生成[5]。因而增加對類黃酮的認(rèn)識可對骨質(zhì)疏松的治療起到重要作用。本研究觀察了類黃酮對體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞的影響，從而更加了解類黃酮對骨質(zhì)疏松治療的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

培養(yǎng)基 MEM，臨用時(shí)加10%小牛血清(NBS，Gibco BR)；消化酶(0.25%胰蛋白酶，0.1%Ⅱ型膠原酶，Sigma公司)；類黃酮(上海迪奧生物科技有限公司)；D-Hanks液(美國Hyclone公司)；人重組RANKL蛋白和M-CSF蛋白；2.5%戊二醛固定液；青鏈霉素雙抗、淋巴細(xì)胞分離液等。

1.2 主要儀器及器械

二氧化碳培養(yǎng)箱，德國；純水系統(tǒng)，美國；電子天平，上海；超潔凈工作臺，蘇州；倒置相差顯微鏡 Olympus EX70，日本；光學(xué)顯微攝影系統(tǒng) Nikon E600型，日本；磁力攪拌器，上海；微量移液器，上海；RT-PCR 儀：LineGene 9600，杭州；低溫臺式高速離心機(jī)，上海；引物合成，上海生工。

1.3 試驗(yàn)對象

健康志愿者外周血，所有志愿者均簽署倫理知情同意書。

1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)

1.4.1體外破骨細(xì)胞誘導(dǎo)模型的復(fù)制：抽取健康志愿者外周血液共計(jì)13 mL，其中3 mL用于血常規(guī)檢查，將另外10 mL外周血加入50 mL離心管，并加入等體積的D-hanks液，混合均勻。取4 mL淋巴細(xì)胞分離液(室溫)加入15 mL無菌離心管，加入上述混合均勻的血液8 mL置于淋巴細(xì)胞分離頁面上，離心并吸取含有單個核細(xì)胞的白膜層，再加入5倍體積D-hanks液，洗滌并充分離心，細(xì)胞沉淀中加入1 mL含10%FBS的培養(yǎng)基，吹打均勻并計(jì)數(shù)細(xì)胞，預(yù)留活細(xì)胞率>95%，細(xì)胞數(shù)>107個的細(xì)胞懸浮液進(jìn)入下一步純化。利用RANKL、M-CSF誘導(dǎo)單個核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。接種單個核細(xì)胞并置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。將沖洗并收集的離心并用MEM洗滌2次，并將細(xì)胞沉淀中加入1 mL含10% FBS及100U/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素的培養(yǎng)基，吹打并計(jì)數(shù)，預(yù)留活細(xì)胞率>95%，細(xì)胞數(shù)>107個的細(xì)胞懸浮液進(jìn)入下一步培養(yǎng)。將上述細(xì)胞調(diào)整為107個/mL細(xì)胞懸液，分別加入RANKL和M-CSF的兩個體系，及時(shí)換液，鋪有細(xì)胞的骨片轉(zhuǎn)移至新孔培養(yǎng)，進(jìn)行TRAP染色。雙蒸水輕柔漂洗2次，加入100 μL蘇木素復(fù)染2 min，再次用雙蒸水沖洗細(xì)胞核為藍(lán)色，干燥后采用熒光倒置顯微鏡觀察，攝像。取出骨片PBS沖洗，2.5%戊二醛固定10 min，再次PBS沖洗，去離子水超聲沖洗3 min×3次，酒精脫干并甲苯胺藍(lán)染色20 s，PBS沖洗，干燥再進(jìn)行骨吸收陷窩染色觀察。

1.4.2類黃酮調(diào)控：根據(jù)上述方法獲得破骨細(xì)胞，并分為對照組(10%FBS+MEM+100 U青霉素+100 μg/mL鏈霉素+30 ng/mL RANKL、25 ng/mL M-CSF)和干預(yù)組(10%FBS+MEM+100 U青霉素+100 μg/mL鏈霉素+30 ng/mL RANKL、25 ng/mL M-CSF+0.5 μg/mL類黃酮)，將最終培養(yǎng)得到的細(xì)胞進(jìn)行鏡下觀察破骨細(xì)胞活性。提取RNA(均為冰上操作)，分別進(jìn)行勻漿、分相、沉淀、清洗、溶解、RNA定量及純度檢測、逆轉(zhuǎn)錄。PCR所需引物均由上海生工合成，以人β-actin作為內(nèi)參對照，進(jìn)行凝膠電影檢測模板，進(jìn)行RT-PCR，每個反應(yīng)孔15 μL體系，每個基因3個復(fù)孔，每組均設(shè)陰性對照。并進(jìn)行Western blot檢測，具體步驟如下：收集DATS處理后的OCs細(xì)胞，冷PBS洗2次后，加入適量的細(xì)胞裂解緩沖液，于4 ℃裂解1 h，10000 rpm×10 min，吸取上清液，即為細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。調(diào)節(jié)每份樣品濃度，以等量的蛋白量加樣，樣品加入1∶4的5×SDS加樣緩沖液，沸水煮沸5 min，經(jīng)10%SDS-PAGE膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(封閉液1∶200～1∶1000稀釋)，室溫孵育2 h；TBST洗3次，每次10 min；加相應(yīng)的辣根過氧化物酶連接的抗兔的二抗(封閉液1∶2000稀釋)，室溫孵育1 h；TBST洗3次，每次15 min；用ECL發(fā)光法檢測不同蛋白表達(dá)狀況；薄層掃描儀測定印跡區(qū)帶的光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對各組樣本均數(shù)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 類黃酮對干預(yù)組和對照組破骨細(xì)胞的活性影響

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察可見誘導(dǎo)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞形態(tài)明顯，干預(yù)組破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的形成減少，活性減弱，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 類黃酮對體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞活性影響。A：對照組(×10)；B：干預(yù)組(×10)Fig.1 Effect of flavonoids on osteoclast activity in vitro. A: Control group (×10); B: Intervention group (×10)

2.2 RT-PCR檢測c-fos基因表達(dá)量結(jié)果

采用RT-PCR技術(shù)，對干預(yù)組破骨細(xì)胞中c-fos mRNA水平進(jìn)行了檢測，見圖2。由圖2可見，檢測物質(zhì)的溶解曲線較好，無非特異性雜帶。與對照組比較，類黃酮作用的干預(yù)組c-fos的mRNA表達(dá)水平較對照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 c-fos mRNA量化結(jié)果注：與干預(yù)組比較，**P<0.01Fig.2 Results of c-fos mRNA quantization.Note: Compared with the intervention group, **P<0.01.

2.3 采用Western blot檢測p38蛋白表達(dá)水平

Western blot檢測結(jié)果顯示干預(yù)組p-p38蛋白表達(dá)水平較對照組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、4。

圖3 p-p38/p38檢測結(jié)果對比注：以p38為內(nèi)參，干預(yù)組p-p38表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)Fig.3 Comparison of p-p38/p38 test results.Note: Using p38 as internal control, p-p38 expression in the intervention group decreased, and the difference was statistically significant (P<0.05).

圖4 p-p38/p38量化結(jié)果注：與干預(yù)組比較，**P<0.05Fig.4 Results of p-p38/p38 quantizationNote: Compared with the intervention group, **P<0.05.

3 討論

類黃酮因其色澤多呈黃色而被冠以此名，它是一大類常見的多酚化合物，目前已發(fā)現(xiàn)的天然類黃酮有4000多種，類黃酮是一類具有廣泛生物活性的植物次生代謝物，其在人體內(nèi)作用機(jī)制比較復(fù)雜，類黃酮多存在于淫羊藿、花、茶葉、豆類、蔬菜、水果等多種食源性植物中。近年來不斷深入的研究發(fā)現(xiàn)，類黃酮具有減弱破骨細(xì)胞活性、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化、礦化促進(jìn)骨形成，并且具有良好的抗氧化、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、預(yù)防心血管疾病、抗癌等生物活性[6-9]。

骨質(zhì)疏松引起的各種疾病嚴(yán)重影響中老年人尤其是絕經(jīng)后婦女的生活質(zhì)量，加上醫(yī)療費(fèi)用支出的增多、壽命的縮短等不僅對患者的身心健康造成危害，也增加了家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已被公認(rèn)為僅次于心血管疾病的第2大健康殺手，成為極為嚴(yán)重的公共健康問題。因此，骨質(zhì)疏松作為一種常見的代謝性骨骼疾病，常見的疾病好發(fā)因素包括老化、炎癥性腸病、甲亢以及藥物引起等。根據(jù)2014年我國骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)專家共識，目前國內(nèi)骨質(zhì)疏松患者人數(shù)仍有逐年增多趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的健康。

類黃酮的作用主要包括防治骨質(zhì)疏松、抑制血小板聚集、止血與鎮(zhèn)痛、抑菌、抗炎、抗風(fēng)濕、保肝、抗氧化及抗癌作用，類黃酮通過對人體外周血p38MAPK/c-fos信號通路的調(diào)控來抑制破骨細(xì)胞分化。其中 p38MAPK通路主要參與破骨細(xì)胞的生成和凋亡，但是還缺少有關(guān)作用機(jī)制的研究，更缺少隨機(jī)對照的大樣本臨床研究[10-11]。近年關(guān)于類黃酮治療骨質(zhì)疏松的研究層出不窮，越來越多的證據(jù)表明類黃酮對于骨質(zhì)疏松的治療具有確切的療效。部分學(xué)者在細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)類黃酮能夠通過多種途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞生成，抑制破骨細(xì)胞分化，進(jìn)而能夠在機(jī)體雌激素缺乏時(shí)盡量減少骨質(zhì)的丟失，以至提高骨密度和骨礦含量，但是具體作用機(jī)制尚不完全清楚。Ailsa等[12]研究認(rèn)為，類黃酮可能是通過減少氧化應(yīng)激或慢性低度炎癥信號通路的影響，從而達(dá)到防止骨質(zhì)流失的作用。部分學(xué)者贊同上述觀點(diǎn)，并且通過實(shí)驗(yàn)研究初步證實(shí)類黃酮可以減少維生素A的應(yīng)激氧化，并且能夠阻滯維甲酸和磷的含量以防骨質(zhì)的流失[13]。

類黃酮在人體內(nèi)作用機(jī)制比較復(fù)雜[14]，本研究雖然發(fā)現(xiàn)類黃酮在人體外周血破骨細(xì)胞分化p38MAPK/c-fos信號通路調(diào)控中起作用，但是目前實(shí)驗(yàn)過程由于不可控因素較多，尚缺乏有效證據(jù)表明類黃酮對于人體骨質(zhì)疏松的治療效果。因此，類黃酮發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松的具體機(jī)制尚未完全闡明，進(jìn)一步的研究將有助于認(rèn)識該藥物的治療作用機(jī)制，從而為類黃酮大量的投入應(yīng)用于臨床奠定一定的理論基礎(chǔ)[15-16]。類黃酮對人體外周血破骨細(xì)胞分化機(jī)制還不是十分清楚，還有待大規(guī)模、多中心隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)研究。