李永賢 張順聰 梁德 郭丹青 莫國業(yè) 李大星 郭惠智 馮蓬勃 李永巍莫凌 楊志東 唐永超

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510407 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)骨傷科學(xué)國家重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)影響全世界大多數(shù)女性人口，已被WHO列為十大最嚴(yán)重疾病之一[1]。骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥最常見的并發(fā)癥之一[2]，增加老年患者的致殘率和死亡風(fēng)險[1]，并且為經(jīng)濟(jì)帶來極大負(fù)擔(dān)[3]。因此，深入研究骨質(zhì)疏松性骨折骨重建的發(fā)生機(jī)制和防治措施，對提高患者的生存質(zhì)量和降低死亡率具有重要意義。骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生的主要機(jī)理在于成骨細(xì)胞的骨形成功能和破骨細(xì)胞的骨吸收功能間的失平衡，導(dǎo)致骨量減少、結(jié)構(gòu)退化、骨脆性增加，當(dāng)載荷超過其自身的支持強(qiáng)度時引起骨折[4]。骨折后骨重建的核心是成骨細(xì)胞骨吸收和破骨細(xì)胞骨生成反應(yīng)間的相互耦聯(lián)的過程，是一動態(tài)連續(xù)的過程[5]，而成骨細(xì)胞的活化引起骨吸收是骨重建的起始階段，對于骨重建具有不可替代的作用。因此，研究關(guān)于調(diào)控成骨細(xì)胞活化或調(diào)亡的機(jī)制是防治骨質(zhì)疏松的重要策略。

近年發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路調(diào)控破骨細(xì)胞的分化及功能，并對骨細(xì)胞存活及骨重建起關(guān)鍵作用[6]。但目前關(guān)于Notch信號通路調(diào)節(jié)骨重建的研究較少，骨質(zhì)疏松性骨折患者的骨重建機(jī)制仍不清楚。因此，闡明Notch信號通路與調(diào)控成、破骨細(xì)胞分化的具體機(jī)制，對于防治骨質(zhì)疏松相關(guān)疾病具有重大意義。骨質(zhì)疏松性椎體骨折屬祖國醫(yī)學(xué)“骨萎骨折”的范疇，在對其認(rèn)識和治療上積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血法可使減少破骨細(xì)胞形成，增加成骨細(xì)胞生成，來防治骨質(zhì)疏松相關(guān)疾病。最近研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路調(diào)節(jié)對骨細(xì)胞活性及骨重建方面起著關(guān)鍵作用，但補(bǔ)腎法是否通過影響Notch信號通路相關(guān)因子而調(diào)節(jié)骨重建尚不清楚。因此，本研究一方面進(jìn)一步探討Notch信號通路調(diào)節(jié)成骨、破骨細(xì)胞的分化及功能的機(jī)制；另一方面，深入研究補(bǔ)腎中藥治療骨質(zhì)疏松性骨折的作用機(jī)理，為以后臨床治療骨質(zhì)疏松性骨折提供理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 補(bǔ)腎中藥配制

補(bǔ)腎中藥選取右歸丸加減方，由附子、肉桂、鹿角膠、熟地黃、枸杞子、山茱萸、山藥、菟絲子、杜仲、牛膝、當(dāng)歸、桃仁、紅花組成，90 ℃煎煮至上清液濃縮為2∶1。冷卻后，濾紙過濾，4 ℃冷藏靜置48 h，離心后取上清液，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。灌胃前用蒸餾水配制成10、20、40 mg/mL濃度待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

生理鹽水購于華南醫(yī)藥公司，補(bǔ)腎中藥、抗生素購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，其余試劑均購于廣州菲博生物科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組與處理

60只SPF級12月齡雌性SD大鼠，(400±20)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實(shí)驗(yàn)中心室內(nèi)。隨機(jī)平均分為5組，分別為正常組、骨質(zhì)疏松骨折模型組、高、中、低劑量補(bǔ)腎中藥治療組，各組均摘除卵巢，術(shù)后3個月形成骨質(zhì)疏松模型。隨后除正常組外，其余各組在無菌條件下用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，取仰臥位，四肢用橡皮筋固定，去毛后酒精消毒右后肢，鋪巾。做左側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口，切開皮膚，皮下組織及肌肉，顯露股骨及髕韌帶，沿髕韌帶內(nèi)側(cè)打開關(guān)節(jié)腔，用1.0 mm的克氏針于股骨平臺偏前方沿股骨長軸旋入約14～17 mm長度，然后以文氏鉗繼續(xù)將克氏針頂入，確?？耸厢樌喂坦潭ㄓ谶h(yuǎn)端髓內(nèi)松質(zhì)骨中。牽拉推移皮膚使股骨中段暴露切口內(nèi)，用小型電鉆鋸斷股骨，用生理鹽水沖洗創(chuàng)面后，以4-0號絲線縫合切開的肌肉、關(guān)節(jié)囊、皮下組織及皮膚，建立起股骨骨折模型。骨松骨折模型成立后，對每只大鼠腹腔注射80萬 U/kg青霉素鈉鹽進(jìn)行抗感染治療，通過雙能X射線觀察骨折情況(圖1)，每日給予正常組與模型組生理鹽水進(jìn)行灌胃，治療組分別給予高、中、低劑量補(bǔ)腎中藥灌胃12 w進(jìn)行治療。

圖1 大鼠股骨骨松骨折模型X光片F(xiàn)ig.1 X-ray photo of osteoporotic fractured femur in the rat

圖2 補(bǔ)腎中藥對血清中堿性磷酸酶、TRAP和骨鈣素含量的影響。A：堿性磷酸酶；B：TRAP破骨標(biāo)志物；C：骨鈣素注：NC：正常組；MC：骨質(zhì)疏松骨折模型組；BS-L/M/H：補(bǔ)腎中藥低、中、高劑量治療組。Fig.2 Influence of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicine in serum alkaline phosphatase (AKP), strACP (TRAP), and osteocalcin (OC). A: AKP; B: TRAP; C: OC.Note: NC, normal control group; MC, osteoporotic fracture model group; BS-L/M/H, low/middle/high dose of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicine-treated group.

1.4 指標(biāo)檢測

末次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對大鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，應(yīng)用雙能X射線檢測大鼠股骨的骨密度。使用普通采血管和采血針，通過腹主動脈采取血液，靜置1～2 h后在4 ℃下冷凍離心，3 000 r/min，離心10 min，分離上清液得到血清樣品，通過ELISA法測量堿性磷酸酶、骨鈣素、血清抗酒石酸性磷酸酶(serumtar trate-resistantacid phosphatase，strACP)破骨標(biāo)志等指標(biāo)含量，對股骨樣品進(jìn)行甲醛浸泡24 h、脫鈣3～4 w后制作HE染色切片進(jìn)行病理學(xué)檢查以及Western blot法檢測Notch1蛋白的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎中藥對血清中堿性磷酸酶、TRAP和骨鈣素含量的影響

ELISA法測定大鼠血清中堿性磷酸酶、TRAP和骨鈣素含量的結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松骨折模型組與正常組相比，堿性磷酸酶與TRAP的含量顯著升高，骨鈣素含量明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而經(jīng)過補(bǔ)腎中藥治療后，治療組中的堿性磷酸酶與TRAP的含量顯著降低，骨鈣素含量明顯提升，上述指標(biāo)在高劑量治療組中與模型組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，呈明顯的劑量依賴性。

2.2 補(bǔ)腎中藥對骨組織中Notch1蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)的免疫印跡條帶和光密度值如圖3所示。結(jié)果顯示，Notch1蛋白的表達(dá)在模型組中受到顯著抑制(與正常組相比，P<0.01)，而補(bǔ)腎中藥具有調(diào)節(jié)Notch1蛋白表達(dá)的作用，且成明顯劑量相關(guān)性，3個劑量治療組的Notch1蛋白表達(dá)與模型組相比顯著升高(P<0.01)，且高劑量治療組的表達(dá)水平與正常組接近。上述結(jié)果提示補(bǔ)腎中藥具有調(diào)節(jié)Notch1蛋白表達(dá)的作用。

圖3 補(bǔ)腎中藥對骨組織中Notch1蛋白表達(dá)的影響。A：免疫印跡條帶；B：光密度值注：NC：正常組；MC：骨松骨折模型組；BS-L/M/H：補(bǔ)腎中藥低、中、高劑量治療組。Fig.3 Influence of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicines in Notch1 protein in bone. A: Lanes of Notch1 protein; B: Quantitative results of different groupsNote: NC, normal control group; MC, osteoporotic fracture model group; BS-L/M/H, low/middle/high dose of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicine-treated group.

圖4 各組大鼠股骨骨折端病理學(xué)染色切片(200×)Fig.4 Histological examination on rat fractured femurs with H&E staining in different groups (200×)

2.3 補(bǔ)腎中藥對骨密度的影響

病理組織學(xué)切片結(jié)果如圖4所示，骨質(zhì)疏松骨折模型組與正常組相比，在骨折端的成骨細(xì)胞數(shù)量較少，破骨細(xì)胞數(shù)量較多，而高劑量補(bǔ)腎中藥治療組在骨折端的成骨細(xì)胞數(shù)量較多，破骨細(xì)胞數(shù)量較少。X光片骨密度值測量結(jié)果顯示(圖5)，模型組的骨密度與正常組相比顯著下降(P<0.01)，經(jīng)補(bǔ)腎中藥治療后，骨密度顯著回升，高劑量治療組的骨密度與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。上述結(jié)果提示，補(bǔ)腎中藥具有提高骨密度的效果。

3 討論

骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生的主要機(jī)理在于成骨細(xì)胞的骨形成功能和破骨細(xì)胞的骨吸收功能間的失衡，導(dǎo)致骨量減少、結(jié)構(gòu)退化、骨脆性增加，當(dāng)載荷超過其自身的支持強(qiáng)度時引起骨折。骨質(zhì)疏松性骨折的根本原因在于骨質(zhì)疏松，因此積極地治療骨質(zhì)疏松是防治OVCF骨質(zhì)疏松性骨折的前提條件，古人對骨質(zhì)疏松癥的根本病機(jī)認(rèn)識主要為腎精不足所致?！秲?nèi)經(jīng)》曰“氣傷形，形傷腫”，宋《圣濟(jì)總錄》也指出“筋、肉、骨、節(jié)誤致所折，則氣血癖滯疼痛”，認(rèn)為骨折損傷氣血，致血脈離經(jīng)去行，惡血留滯，形成血瘀，以致氣血運(yùn)行失常、癖積不散為腫為痛。清·陳士鐸在《辨證錄》中也指出“血不活則癖不能去，癖不去則骨不能接”?；谶@些觀點(diǎn)，認(rèn)為骨質(zhì)疏松性骨折的基本病機(jī)為腎虛所致，采用補(bǔ)腎法治療取得了較好的療效[7-8]，為防治骨質(zhì)疏松性骨折提供了新的思路和方法，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

圖5 各組大鼠股骨骨密度值注：NC：正常組；MC：骨松骨折模型組；BS-L/M/H：補(bǔ)腎中藥低、中、高劑量治療組。Fig.5 BMD of the rat femur in different groupsNote: NC, normal control group; MC, osteoporotic fracture model group; BS-L/M/H, low/middle/high dose of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicine-treated group.

Notch信號通路為一廣泛應(yīng)用且高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，是影響細(xì)胞命運(yùn)決定的重要通路之一，相鄰細(xì)胞之間通過Notch受體或配體傳導(dǎo)信號，調(diào)節(jié)包括干細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的分化、增殖和調(diào)亡[9]。最近研究表明，Notch信號通路參與OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)調(diào)控破骨細(xì)胞的分化及功能，并對骨細(xì)胞存活及骨重建起關(guān)鍵作用[6]。

Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由Notch受體、Notch配體和CSL DNA結(jié)合蛋白3部分組成。哺乳動物有4種Notch受體(Notch1、 Notch2、 Notch3、 Notch4)和5種Notch配體(Jagged1、Jagged2、 Delta1、 Delta3、Delta4)，廣泛分布于造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞表面，Notch信號由兩個鄰近細(xì)胞的Notch受體與配體相互作用而激活Notch。配體與受體結(jié)合后，在ADAMI0/KUZ或ADAM17/TACE作用下，Notch受體于細(xì)胞膜外被酶切，釋放出和Notch配體連接的胞外部分，隨后在γ-分泌酶的作用下，胞內(nèi)段被酶切，形成可溶性的NICD(notch intracellular domain)轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，通過激活轉(zhuǎn)錄因子SCL而調(diào)節(jié)基因表達(dá)[9]，Notch的下游靶基因主要以HES家族成員為主，包括HESl、HES5、 HEY1等。

目前關(guān)于Notch信號通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化及功能影響骨重建相關(guān)研究較少。Yamada等[6]發(fā)現(xiàn)Notch1轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出RANKL及OPG基因的表達(dá)增加，而巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)表達(dá)的強(qiáng)烈抑制，導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化能力減弱。這些發(fā)現(xiàn)表明Notch信號通路同時影響破骨前體細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，并對破骨細(xì)胞生成產(chǎn)生負(fù)向調(diào)節(jié)作用[10]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，人體外敲除骨基質(zhì)巨噬細(xì)胞中的Notch1、Notch2、Notch3，可以促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的增殖與分化[11]；破骨細(xì)胞中的Notch1失活會抑制其OPG的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化與骨吸收能力，從而證明Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對破骨細(xì)胞具有抑制作用[12]。Duan等[13]指出NF-kB的活性在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和骨吸收中增加。RAW264.7細(xì)胞中的HES1的mRNA和蛋白表達(dá)在RANKL刺激后增加。因此認(rèn)為，在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和骨吸收介導(dǎo)的NF-kB信號通路中，Notch信號被激活。在成骨細(xì)胞對破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)作用方面，Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過促進(jìn)成骨細(xì)胞OPG的表達(dá)，從而減弱RANK通路介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化作用。Bai等[12]研究還表明破骨細(xì)胞上表達(dá)有Notch配體(Delta1、 Jagged1和Jagged2)，將成骨細(xì)胞上的Notch1敲除后，由于OPG表達(dá)的降低可引起破骨細(xì)胞數(shù)量的增加。而Notch 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)失調(diào)可以導(dǎo)致骨發(fā)育失調(diào)等疾病[10，13]。近年來通過Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)對骨重建的研究主要局限于動物研究，少于與骨質(zhì)疏松患者相連，骨質(zhì)疏松性椎體骨折患者骨重建的機(jī)制仍不清楚[14]。因此，闡明Notch信號通路與OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)相互作用調(diào)控破骨細(xì)胞分化影響骨重建的具體機(jī)制，尋找靶向調(diào)控OPG、RANKL表達(dá)的Notch信號通路相關(guān)配體或受體，對于防治骨質(zhì)疏松相關(guān)疾病具有重大意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松骨折模型組與正常組相比，在骨折端的成骨細(xì)胞數(shù)量較少，破骨細(xì)胞數(shù)量較多。運(yùn)用補(bǔ)腎中藥治療骨質(zhì)疏松骨折大鼠后，高劑量治療組在骨折端的成骨細(xì)胞數(shù)量較多，破骨細(xì)胞數(shù)量較少，提示補(bǔ)腎中藥具有促進(jìn)骨性愈合的效果。另外，模型組的骨密度與正常組相比顯著下降(P<0.01)，經(jīng)補(bǔ)腎中藥治療后，骨密度顯著回升，高劑量治療組的骨密度與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松骨折模型組與正常組相比，堿性磷酸酶與TRAP的含量顯著升高，骨鈣素含量明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而經(jīng)過補(bǔ)腎中藥治療后，治療組中的堿性磷酸酶與TRAP的含量顯著降低，骨鈣素含量明顯提升，上述指標(biāo)在高劑量治療組中與模型組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，呈明顯的劑量依賴性。另外，Western blot結(jié)果也顯示，Notch1蛋白的表達(dá)在模型組中受到顯著抑制(與正常組相比，P<0.01)，而補(bǔ)腎中藥具有調(diào)節(jié)Notch1蛋白表達(dá)的作用，且成明顯劑量相關(guān)性，3個劑量治療組的Notch1蛋白表達(dá)與模型組相比顯著升高(P<0.01)，且高劑量治療組的表達(dá)水平與正常組接近。本研究結(jié)果提示，補(bǔ)腎中藥能夠通過調(diào)節(jié)Notch1蛋白的表達(dá)來抑制血清中破骨標(biāo)志物堿性磷酸酶和TRAP的水平，并提高骨鈣素的含量來刺激成骨細(xì)胞生成、抑制破骨細(xì)胞分化，從而加速骨折的愈合，提高骨密度，對大鼠股骨骨質(zhì)疏松骨折具有良好的治療作用。