陳娟 謝麗華 李生強(qiáng) 許惠娟 陳賽楠 葉云金 葛繼榮

福建省中醫(yī)藥研究院骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)重點(diǎn)研究室，福建 福州 350003

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，POP)是中老年女性的常見多發(fā)病，以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病，其發(fā)生與遺傳、內(nèi)分泌和免疫等因素密切相關(guān)[1]。miRNAs是一類內(nèi)源性、長(zhǎng)度約19～26個(gè)核苷酸的非編碼短小RNA，對(duì)骨代謝和骨的發(fā)育重建起著重要作用[2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-655通過(guò)靶向結(jié)合CLCF1 mRNA的3'UTR區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥關(guān)聯(lián)基因CLCF1的表達(dá)[3]，但hsa-miR-655介導(dǎo)CLCF1基因參與POP的具體機(jī)制尚不清楚。

CLCF1是B淋巴細(xì)胞的催化劑，可刺激B細(xì)胞活化，參與體液免疫[4]?！肮敲庖邔W(xué)”理論認(rèn)為，骨骼系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間存在密切關(guān)系，免疫失調(diào)可導(dǎo)致骨代謝異常[5]。OPG/RANKL/RANK 系統(tǒng)作為連接骨代謝與免疫系統(tǒng)之間的橋梁，是調(diào)節(jié)骨重建的一類重要的信號(hào)通路。本研究通過(guò)在人成骨肉瘤MG63細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)hsa-miR-655，研究hsa-miR-655通過(guò)靶向調(diào)控CLCF1基因表達(dá)，對(duì)細(xì)胞增殖和骨免疫重要通路OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人成骨肉瘤細(xì)胞 MG63(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)；MEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，GIBCO公司)；青鏈霉素(Invitrogen公司)；hsa-miR-655表達(dá)慢病毒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，貨號(hào)MI0003677)；hsa-miR-655引物、U6引物(廣州市銳博生物科技有限公司)；microRNA提取試劑盒(Qiagen公司)；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA定量試劑盒(廣州市銳博生物科技有限公司)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)；CLCF1、OPG、RANKL引物(寶生物工程有限公司)；CLCF1、OPG、RANKL、GAPDH抗體(Abcam公司)；Cell Counting Kit-8試劑盒(日本同仁公司)；SYBR?PremixExTaqTMGC Kit(TaKaRa公司)；PCR儀(ABI 7500 Fast)；核酸檢測(cè)儀(NanoDrop 2000/2000c 分光光度計(jì)，Thermo公司)；Annexin V-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(BD公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1MG63細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒感染：MG63細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基，含10%FBS、1%雙抗，置于5% CO2孵箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前先將MG63細(xì)胞接種于6孔板中，分2組：陰性對(duì)照組(NC組)和hsa-miR-655過(guò)表達(dá)組(OE組)。OE組和Vector組按照感染復(fù)數(shù)50(multiplicity of infection，MOI)，分別感染hsa-miR-655表達(dá)慢病毒及相應(yīng)陰性對(duì)照慢病毒。24 h后換正常培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)觀察感染效率，并收取細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR：根據(jù)試劑盒說(shuō)明分別提取細(xì)胞microRNA和總RNA。定量后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得定量 PCR模板。引物序列見表1，熒光定量PCR反應(yīng)條件如下：①預(yù)變性：95 ℃ 10 s，②變性：95 ℃ 5 s，③退火、延伸：60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。每組均做3個(gè)重復(fù)，取均數(shù)。miR-655相對(duì)定量計(jì)算以U6作為內(nèi)參，CLCF1、OPG、RANKL相對(duì)定量計(jì)算以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：收集各組MG63細(xì)胞，以2×103/孔的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板，各實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔添加培養(yǎng)液100 μL。分別于0、24、48、72、96 h行CCK8檢測(cè)。每孔加入CCK8試劑10 μL，避光孵育3 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處各孔的吸光度值(OD450)，用空白對(duì)照調(diào)零去除背景值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布：收集各組細(xì)胞，將約1×106個(gè)細(xì)胞移入離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清，PBS溶液清洗一次。加入70%冰乙醇5 mL混勻固定，4 ℃放置48 h以上。檢測(cè)前加入0.5 mLPI/RNase(BD公司，貨號(hào)550825)染色液，室溫避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5Western blot 檢測(cè)蛋白水平：RIPA 裂解法提取轉(zhuǎn)染后各組MG63細(xì)胞總蛋白，定量蛋白濃度。40μg蛋白樣品，SDS-PAGE膠分離蛋白。采用濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜60 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入CLCF1抗體(1∶1000)、OPG抗體(1∶1000)、RANKL抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶2000)。4 ℃孵育過(guò)夜；1×TBST 漂洗3次，加入辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗(1∶4000)，常溫孵育1 h；1×TBST 漂洗4次，避光條件下化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，并進(jìn)行灰度值分析。以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白相對(duì)灰度比值。

2 結(jié)果

2.1 hsa-miR-655過(guò)表達(dá)后上調(diào)MG63細(xì)胞miR-655水平

慢病毒感染MG63細(xì)胞，72 h后熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，MOI=50時(shí)，感染效率為80%以上(圖1A、1B)。qRT-PCR檢測(cè)hsa-miR-655在MG63細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組hsa-miR-655表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0004，圖1C)，提示成功建立hsa-miR-655過(guò)表達(dá)的MG63細(xì)胞株。

圖1 hsa-miR-655過(guò)表達(dá)后MG63細(xì)胞miR-655水平的檢測(cè)。A：熒光顯微鏡觀察GFP陽(yáng)性MG63細(xì)胞；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞GFP陽(yáng)性率；C：qRT-PCR 檢測(cè)hsa-miR-655表達(dá)水平Fig.1 Expression of hsa-miR-655 in MG63 cells. A: GFP positive MG63 cells were observed with fluorescence microscopy; B: GFP positive rate was detected with flow cytometry; C: qRT-PCR was used to detect hsa-miR-655 expression level.

2.2 hsa-miR-655抑制CLCF1基因的表達(dá)

為探討hsa-miR-655對(duì)CLCF1基因的調(diào)控作用，筆者分別在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)CLCF1基因的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，hsa-miR-655過(guò)表達(dá)組CLCF1蛋白水平明顯下調(diào)(P=0.0053，圖2)，而mRNA水平未見明顯變化(P=0.0986，圖2)。說(shuō)明hsa-miR-655在轉(zhuǎn)錄后水平抑制CLCF1基因的表達(dá)。

2.3 過(guò)表達(dá)hsa-miR-655抑制MG63細(xì)胞增殖

與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組MG63細(xì)胞增殖能力明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0 h：P=0.203；24 h：P<0.0001；48 h：P<0.0001；72 h：P<0.0001；96 h：P=0.0005)。說(shuō)明hsa-miR-655在MG63中有抑制增殖作用，見表2。

表2 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hsa-miR-655過(guò)表達(dá)對(duì)MG63細(xì)胞的增殖調(diào)控作用Table 2 Inhibitory effect of hsa-miR-655 on MG63 cell growth detected with CCK8 assay

注：***表示與對(duì)照組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.4 hsa-miR-655抑制MG63細(xì)胞周期的進(jìn)展

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)周期分布，結(jié)果提示，hsa-miR-655過(guò)表達(dá)組較對(duì)照組MG63細(xì)胞 G0/G1期細(xì)胞比例增加(P=0.0048)，S期細(xì)胞比例減少(P=0.0133)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)，由此可見，hsa-miR-655可以使細(xì)胞阻滯在G1期，延緩細(xì)胞周期進(jìn)程。

2.5 hsa-miR-655對(duì)OPG和RANKL表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測(cè)hsa-miR-655過(guò)表達(dá)后OPG、RANKL mRNA的變化發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組OPG(P=0.0384)、RANKL(P=0.0007)mRNA均有所上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A)；Western blot檢測(cè)蛋白水平，經(jīng)圖像分析軟件計(jì)算RANKL和OPG相對(duì)灰度比值，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組OPG、RANKL蛋白均上調(diào)，而OPG/RANKL比值卻降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B，表3)。

3 討論

miRNA在骨質(zhì)疏松的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮了重要的調(diào)控功能。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-655能靶向調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥關(guān)聯(lián)基因CLCF1的表達(dá)，但hsa-miR-655介導(dǎo)CLCF1基因參與POP的具體機(jī)制尚不明確。人成骨肉瘤MG63細(xì)胞株具有人成骨細(xì)胞表型特征，是最常用的成骨細(xì)胞模型之一[6]。本實(shí)驗(yàn)在MG63細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)hsa-miR-655，觀察hsa-miR-655對(duì)MG63細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及CLCF1、OPG和RANKL基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá) hsa-miR-655顯著抑制MG63細(xì)胞的增殖，使MG63細(xì)胞G1期阻滯，S期比例減少，從而延緩細(xì)胞周期進(jìn)程。同時(shí)，過(guò)表達(dá)miR-655后，CLCF1蛋白水平明顯下調(diào)，而OPG和RANKL表達(dá)水平雖然上調(diào)，但OPG/RANKL比值卻降低。說(shuō)明miR-655能通過(guò)負(fù)調(diào)控CLCF1基因的表達(dá)，抑制成骨樣細(xì)胞MG63的增殖，并下調(diào)OPG/RANKL的比值。

圖2 hsa-miR-655抑制CLCF1基因的表達(dá)Fig.2 Up-regulation of hsa-miR-655 inhibited CLCF1 expression

組別OPG(相對(duì)灰度值) RANKL(相對(duì)灰度值)OPG/RANKL比值NC組121.21±1.52139.92±1.501.63±0.23OE組139.52±4.21**173.45±3.95***0.89±0.12**

注：**表示與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；***表示與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)，OPG(P=0.0021)，RANKL(P=0.0002)，OPG/RANKL(P=0.0078)。

圖3 FCM測(cè)定hsa-miR-655過(guò)表達(dá)后MG63細(xì)胞周期的變化Fig.3 Changes of cell cycle after up-regulation of hsa-miR-655 detected with FCM

圖4 hsa-miR-655過(guò)表達(dá)對(duì)OPG、RANKL表達(dá)的影響Fig.4 Up-regulation of hsa-miR-655 increased OPG and RANKL expression

作為一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，miRNAs通過(guò)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，在骨代謝中具有重要的調(diào)控作用。文獻(xiàn)報(bào)道，miR-26 a在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)成骨分化過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)調(diào)控 Wnt信號(hào)通路促進(jìn) BMSCs的成骨分化[7]。Gao等[8]發(fā)現(xiàn)miR-210在人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程表達(dá)下調(diào)，通過(guò)對(duì)miR-210的抑制可促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化進(jìn)程。此外，通過(guò)對(duì)miRNA表達(dá)譜的觀察，發(fā)現(xiàn) miR-21在破骨細(xì)胞的分化過(guò)程中呈高表達(dá)，而其高表達(dá)可觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)起到促破骨細(xì)胞分化的作用，因此miR-21可被認(rèn)為是早期破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)miRNA[9]。本研究中的hsa-miR-655基因定位于人14q32.31染色體上，自2005年hsa-miR-655首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，越來(lái)越多的研究對(duì)hsa-miR-655基因及其在各種生物學(xué)功能中發(fā)揮的作用進(jìn)行了報(bào)道。miR-655在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用[10-11]。肝癌中miR-655表達(dá)較高的患者生存期短于miR-655表達(dá)低的。多變量分析顯示，miR-655是肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12]。Kitamura等[13]報(bào)道m(xù)iR-134/487b/655簇能促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，并通過(guò)直接靶向MAGI2來(lái)影響肺癌細(xì)胞的耐藥性。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-655 可以靶向結(jié)合CLCF1 mRNA的3'UTR區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控CLCF1基因表達(dá)。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-655能抑制CLCF1的表達(dá)，并對(duì)人成骨樣細(xì)胞MG63的增殖起調(diào)控作用。

CLCF1是B淋巴細(xì)胞的催化劑，可通過(guò)gp130受體刺激B細(xì)胞活化，參與體液免疫。CLCF1屬白細(xì)胞介素6(IL-6)細(xì)胞因子家族成員，IL-6是骨吸收的主要調(diào)節(jié)者，其主要通過(guò)激活 JAK2/STAT3 信號(hào)通路發(fā)揮作用[14]。研究表明IL-6 與成骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、破骨細(xì)胞及其前體產(chǎn)生密切相關(guān)，能促進(jìn)骨及骨髓中破骨細(xì)胞增加。文獻(xiàn)報(bào)道[15]JAK2/STAT3是破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化成熟過(guò)程中的關(guān)鍵信號(hào)通路，三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)競(jìng)爭(zhēng)性JAK2激酶抑制劑AG490通過(guò)下調(diào)STAT3(Ser727)磷酸化水平，抑制核因子kB受體活化因子配體誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CLCF1在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中表達(dá)下調(diào)，且CLCF1基因過(guò)表達(dá)后可以激活JAK2/STAT3信號(hào)通路[16]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，hsa-miR-655通過(guò)靶向調(diào)控CLCF1基因的表達(dá)，下調(diào)OPG/RANKL的比值。因此，筆者推測(cè)hsa-miR-655對(duì)OPG/RANKL的影響可能與JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

“骨免疫學(xué)”理論認(rèn)為，骨骼系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間存在密切關(guān)系，免疫失調(diào)可導(dǎo)致骨代謝異常。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)則是骨代謝與免疫系統(tǒng)之間的橋梁，OPG、RANKL和其唯一受體RANK形成了一個(gè)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的信號(hào)系統(tǒng)，并且是影響破骨細(xì)胞分化、發(fā)育和功能的最終途徑，在骨質(zhì)疏松中起重要作用[17]。成骨細(xì)胞分泌RANKL，RANKL可激活破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜表面RANK受體，引起破骨細(xì)胞的形成和活化。OPG/RANKL比例的變化對(duì)于維持成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的平衡很重要[18]。研究表明，IL-6 可以通過(guò)各種因素對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的OPG/RANKL/RANK 信號(hào)通路產(chǎn)生影響[19-20]。IL-6 通過(guò)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞上RANKL 表達(dá)，與前破骨細(xì)胞上所表達(dá)的 RANK 相互作用，經(jīng) RANK 信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-655過(guò)表達(dá)后，OPG和RANKL表達(dá)均上調(diào)，但OPG/RANKL的比值卻下調(diào)。推測(cè)hsa-miR-655可能通過(guò)CLCF1調(diào)控成骨細(xì)胞OPG/RANKL系統(tǒng)，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的平衡。而OPG水平的增加可能是由于 RANKL和OPG都在成骨細(xì)胞中分泌，RANKL水平增加，OPG的水平進(jìn)而代償性地提高所導(dǎo)致。

綜上所述，hsa-miR-655可以通過(guò)負(fù)調(diào)控CLCF1基因，抑制成骨樣細(xì)胞MG63的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)RANKL、OPG表達(dá)并下調(diào)OPG/RANKL的比值。但對(duì)hsa-miR-655促進(jìn)RANKL、OPG表達(dá)增加的分子機(jī)制仍待后續(xù)進(jìn)一步研究。