林煜 肖莉莉 林焱斌 張怡元 黃云梅 吳銀生 林燕萍*

1. 廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院骨科，福建 福州 350007 2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350102

骨質(zhì)疏松(osteoporosis)是一種常見的與年齡、性激素相關(guān)的退行性疾病，機(jī)體在達(dá)到骨峰值后，隨著年齡的增長、性激素水平的降低，成骨細(xì)胞活性逐漸降低，而破骨細(xì)胞活性相對增強(qiáng)，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，骨量減少。因此，骨質(zhì)疏松是與衰老密切相關(guān)性疾病，而端粒酶在衰老過程中起著關(guān)鍵作用。端粒酶是一種特異的染色體末端轉(zhuǎn)移酶，能以自身RNA為模板，合成端粒DNA并加到染色體末端，使端粒延長，從而延長細(xì)胞的壽命甚至使其永生化[1]。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)是端粒酶活性的決定因素，TERT表達(dá)與端粒酶活性高度相關(guān)，能激活端粒酶抑制端粒DNA的消耗[2]。端粒、端粒酶調(diào)節(jié)機(jī)制與機(jī)體雌激素水平的關(guān)系十分密切，研究證實(shí)，雌激素主要作用于TERT基因的啟動子，對TERT轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)節(jié)而激活端粒酶[3]。前期研究顯示：成人男性和女性骨組織中TERT、雌激素受體α(estrogen receptorα，ERα)均會隨著年齡的增加逐漸下降[4]。而以補(bǔ)腎健脾立法的健骨顆粒，能明顯提高大鼠體內(nèi)雌二醇(estradiol，E2)水平，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，提高細(xì)胞的代謝活力，延緩成骨細(xì)胞的凋亡，改善骨組織結(jié)構(gòu)，達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的目的[5-8]。因此，本研究擬采用采用補(bǔ)腎健脾中藥健骨顆粒干預(yù)不同性別不同年齡老年鼠，從雌激素調(diào)節(jié)TERT活性角度探討健骨顆粒防治骨衰老機(jī)制的可能機(jī)制，為臨床治療提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗藥物

健骨顆粒由煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、山藥等藥味組成，原藥材統(tǒng)一由福建省醫(yī)藥公司提供，福建中醫(yī)藥研究院中試車間負(fù)責(zé)加工制備，每克顆粒含原生藥2.9 g。

1.2 實(shí)驗細(xì)胞及動物

成骨細(xì)胞株ROS1728(由中科院上海細(xì)胞庫提供)，3月齡清潔級雄性SD大鼠20只(由上海斯萊克實(shí)驗動物有限責(zé)任公司提供)用于制備含藥血清。

1.3 實(shí)驗試劑

低糖DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、青/鏈霉素(新西蘭Hyclone公司產(chǎn)品)，細(xì)胞堿性磷酸酶(AKP)染色試劑盒、ALP、BGP、 ColⅠ酶聯(lián)免疫吸附測試試劑盒(上海西唐公司)，TRIZOL(MBI Fermentas公司)，PCR引物(博尚生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRPremix Ex TaqTMPCR Kit(日本TaKaRa公司)。ERα、TERT、c-MYC抗體(德國Calbiochem公司)；β-actin抗體(美國Cell Signaling公司)；WesternBreeze(美國invitrogen公司)；PVDF膜(Amersham公司)。

1.4 主要實(shí)驗儀器

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(BB16/BB5060型，德國Heraus公司)，Olympus倒置相差顯微鏡(日本TKO光學(xué)儀器株式會社)，Du650紫外分光光度計(美國Beckman公司)，BT224半自動生化分析儀(意大利生物技術(shù)公司)，9600DNA擴(kuò)增儀(美國PE生物系統(tǒng)公司)，7500型實(shí)時定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.5 實(shí)驗方法

1.5.1 ER抑制的大鼠成骨細(xì)胞株ROS1728細(xì)胞模型的建立：于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代24 h后加藥，藥物(ICI182780) 溶解于二甲亞楓(DMSO)，終濃度為1×105mol/L。加藥60 h后取細(xì)胞，采用Western Blot法檢測干預(yù)后細(xì)胞中ERα的表達(dá)。

1.5.2 含藥血清制備：取3月齡清潔級雄性SD大鼠30只，分別喂服健骨顆粒、生理鹽水、雌二醇連續(xù)灌胃7 d，于最后1次灌胃后1 h腹主動脈無菌取血，常溫下靜置60 min，3000 r/min離心10 min后取同組血清混合，再離心1次，56℃滅活30 min，過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 分組：將ER抑制的大鼠成骨細(xì)胞株ROS1728細(xì)胞以1×105/mL傳代接種于培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，加入不含小牛血清的單純DMEM培養(yǎng)基，饑餓24 h，使細(xì)胞同步化于G0或G1期，對照組為正常ROS1728細(xì)胞加入最佳濃度的生理鹽水血清，模型組為ER抑制的ROS1728細(xì)胞模型，藥物刺激組在ER抑制的ROS1728細(xì)胞加入最佳濃度的健骨顆粒顆粒含藥血清，雌激素組在ER抑制的ROS1728細(xì)胞加入最佳濃度的雌二醇含藥血清。

1.5.4 成骨細(xì)胞分泌ALP、BGP、 ColⅠ的測定：分別按各試劑盒說明書。

1.5.5 實(shí)時熒光定量SYBR GREEN法檢測ERE、ERα、c-MYC、P53、Pot1、NF-κBmRNA的表達(dá)：收集連續(xù)培養(yǎng)3d細(xì)胞，采用實(shí)時熒光相對定量SYBR GREEN法檢測。ERE引物：ERE引物序列：上游引物F：5’-AAGGAGCACCTCTCAAACC-3’，下游引物R：5’-AAATGGACTACAGCCGCTT-3’，產(chǎn)物長度：189bp；ERα引物序列：上游引物F：5’-ACCTCAAGATGTGCCACTC-3’，下游引物R：5’-TGCTCTCTCCAAACCAGAC-3’，產(chǎn)物長度：197bp； c-MYC的引物序列：上游引物F：5’-CTGATGAAGGAACCTCTGAGTT-3’ 下游引物R：5’-CTGACAGTTGATGCGAGTG-3’，產(chǎn)物長度：189bp；內(nèi)參β-actin引物：上游5‘AGGCTGTGTTGT CCCTGTA3’，下游5‘ ATGTCACGCACGATTTCC3’，產(chǎn)物長度 193bp。采用Trizol法提取總RNA，抽提后的RNA加入溴芬蘭進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果通過凝膠圖像分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行分析；檢驗RNA無降解，測定RNA的吸光度值，計算出RNA的濃度，在根據(jù)濃度計算出體積后取RNA 500ng按試劑盒步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄后在ABI7500上按照試劑說明進(jìn)行mRNA擴(kuò)增，得到擴(kuò)增曲線與CT值。將得到的各組目的基因及β-actin基因的值分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出各自的起始模板量。以β-actin作為參比基因?qū)λ袠悠愤M(jìn)行RNA校正，用待測基因的定量結(jié)果除以β-actin定量結(jié)果即可得到校正值。以陰性對照組mRNA的表達(dá)量作為“1”，再根據(jù)校正值計算出其他各組的相對量，進(jìn)行組間相對量的比較。

1.5.6 Western Blot 檢測TERT、ERα、c-MYC蛋白的表達(dá)：提取細(xì)胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，以每泳道30μg蛋白上樣，進(jìn)行12%十二烷基磺酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS - PAGE), 電轉(zhuǎn)移將膠上蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。膜以封閉液室溫封閉30 min。將與目的蛋白融合表達(dá)的標(biāo)簽抗體1∶5 000稀釋，封閉膜1 h。每次 40 mL 洗液漂洗膜6次，即：1 min 2 次；20 min 2 次；5 min 2 次。然后將堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗室溫封閉膜30 min，然后如前洗膜。將 AP化學(xué)發(fā)光底物與膜室溫下孵育反應(yīng)5 min，暗室中壓X片曝光、顯影。應(yīng)用Phoretix 1D生物電泳圖象分析系統(tǒng)分析膠片中的目的條帶，計算機(jī)自動讀取并記錄每條帶的光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Western Blot 檢測ER抑制的大鼠成骨細(xì)胞株ROS1728細(xì)胞模型的是否建立

用ICI182780干預(yù)ROS1728細(xì)胞后，Western blot分析目的蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：模型組ERα表達(dá)呈陰性，而正常ROS1728細(xì)胞表達(dá)呈陽性，組間比較均有顯著性差異(P<0.05)(見圖1)。

圖1 各組ERα蛋白表達(dá)1-正常ROS1728細(xì)胞組；2-模型組Fig.1 Expression of ER protein in each group

2.2 不同濃度含藥血清促成骨細(xì)胞增殖

AlamarBlue檢測繪制成骨細(xì)胞增殖曲線圖，生理鹽水血清組細(xì)胞隨血清濃度增加增殖速度改變不明顯，當(dāng)濃度達(dá)到50%時，細(xì)胞增殖明顯降低；健骨顆粒血清組細(xì)胞隨血清濃度增加而增殖加快，并在含藥血清濃度為20%時增殖速度最快；雌激素血清組細(xì)胞隨血清濃度增加而增殖加快，并在含藥血清濃度為35%時增殖速度最快；兩組與同濃度生理鹽水血清組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨后隨著血清濃度繼續(xù)增加，其增殖速度下降(見圖2)。因此確定20%健骨顆粒血清、35%雌激素血清組為促成骨細(xì)胞增殖最佳濃度。

圖2 不同濃度不同組別血清對ROS1728增殖的影響Fig.2 Effect of different concentrations of serum on the proliferation of ROS1728 cells

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP、BGP、ColⅠ等信號因子的表達(dá)

采用不同血清干預(yù)成骨細(xì)胞后，ELISA法分析細(xì)胞液中的ALP、BGP、 ColⅠ發(fā)現(xiàn)：隨著干預(yù)時間的延長，培養(yǎng)液中的三種信號因子的含量逐漸上升，各組內(nèi)不同天數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而組間比較顯示：對照組3種信號因子的水平最高，雌激素組次之，健骨顆粒組再次之，模型組最低，各組比較有顯著性差異(P<0.05)。(見表1-3)

表1 4組成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP的含量(μg/mL) Table 4 Content of ALP in osteoblast culture medium in the 4 groups (μg/mL)

注：與同期模型組比較，aP<0.05；與同期健骨顆粒組比較，bP<0.05；與同期雌激素組比較，cP<0.05；與同期對照組比較，dP<0.05

表2 4組成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中BGP的含量 μg/mLTable 2 Content of BGP in osteoblast culture medium in the 4 groups (μg/mL)

注：與同期模型組比較，aP<0.05；與同期健骨顆粒組比較，bP<0.05；與同期雌激素組比較，cP<0.05；與同期對照組比較，dP<0.05

表3 4組成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中ColⅠ的含量(μg/mL)Table 3 Content of Col I in osteoblast culture medium in the 4 groups (μg/mL)

注：與同期模型組比較，aP<0.05；與同期健骨顆粒組比較，bP<0.05；與同期雌激素組比較，cP<0.05；與同期對照組比較，dP<0.05

2.4 各組細(xì)胞中ERE、ERα、c-MYC基因表達(dá)

qPCR結(jié)果表明：健骨顆粒組及雌激素組的ERE、ERα、c-MYC、的RNA的表達(dá)均高于模型組，但低于對照組，且雌激素組的ERE、ERα、c-MYC表達(dá)高于健骨顆粒組，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表4)。

表4 各組細(xì)胞中ERE、ERα、c-MYC的mRNA的表達(dá)結(jié)果±s)Table 4 mRNA expression of ERE, ER, and c-MYC ±s)

注：a與模型組比較，P<0.01；b與健骨顆粒組比較，P<0.01；c與雌激素組比較，P<0.01；d與對照組比較，P<0.01

2.5 各組細(xì)胞中TERT、ERα、c-MYC蛋白表達(dá)

4組TERT、ERα、c-MYC蛋白表達(dá)量情況以對照組的蛋白表達(dá)含量最高，雌激素組次之，健骨顆粒組再次之，模型組最低。各組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(詳見圖3)。

圖3 各組TERT、ERα、c-MYC蛋白表達(dá)1-模型組，2-健骨顆粒組，3-雌激素組，4-對照組Fig.3 Expression of TERT, ER, and c-MYC protein in each group

3 討論

端粒酶是一種具有特殊逆轉(zhuǎn)錄酶活性的核糖核蛋白復(fù)合物，能保證染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性、防止細(xì)胞的衰老和凋亡。而TERT是端粒酶起作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，可通過逆轉(zhuǎn)錄端粒酶RNA模板序列，合成端粒DNA重復(fù)序列并添加到染色體末端，從而延長端粒長度。在TERT 啟動子序列上有兩個雌激素反應(yīng)元件(ERE)通過雌激素受體α(ERα) 結(jié)合TERT基因啟動子區(qū)域的ERE，激活TERTmRNA的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行[9-11]。在表達(dá)ER的細(xì)胞中，雌激素可與胞質(zhì)內(nèi)的ER結(jié)合，通過ERE直接激活端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)[12]。此外在增齡性衰老過程中，TNF-α 基因表達(dá)和活性的抑制也與衰老具有時間相關(guān)性：TNF-α可通過端粒酶依賴機(jī)制，直接損傷DNA導(dǎo)致的端粒紊亂，降低端粒酶的活性導(dǎo)致端粒損傷來誘導(dǎo)細(xì)胞衰老、凋亡[13]；另外TNF-α可以通過誘導(dǎo)與NF-κB結(jié)合的TERT蛋白，由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核來調(diào)節(jié)端粒酶的活性。NF-κB被TNF-α激活后，調(diào)節(jié)其下游的靶點(diǎn)TERT，抑制其活性[14,15]。因此隨著衰老、性腺功能降低，體內(nèi)雌激素水平的下降導(dǎo)致TERT水平的降低，使骨組織中ER表達(dá)陽性的成骨細(xì)胞功能衰退，骨形成低于骨吸收，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。本實(shí)驗采用ERα特異性抑制劑ICI182780阻斷ROS1728細(xì)胞ERα表達(dá)后，模型組TERT、ERα、c-MYCmRNA及蛋白表達(dá)量均顯著低于對照組(P<0.05)，同時模型組細(xì)胞中ALP、BGP、ColⅠ的含量也低于對照組，表明ER介導(dǎo)的TERT信號通路與成骨細(xì)胞功能衰退密切相關(guān)。

補(bǔ)腎健脾中藥健骨顆粒是針對骨質(zhì)疏松“腎虧脾虛”的病機(jī)特點(diǎn)，以“腎主骨”、“補(bǔ)先后天”理論為組方原則，選用煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、山藥等藥物。方中煅狗骨味甘，性溫，功能補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)；淫羊藿味辛甘，性溫，與煅狗骨共奏補(bǔ)腎益精，強(qiáng)筋健骨之效。山茱萸味酸澀，性微溫，酸澀主水，溫能助陽，故能柔潤助陰，補(bǔ)益肝腎，滋養(yǎng)精血而助元陽之不足，進(jìn)一步增強(qiáng)煅狗骨、淫羊藿之補(bǔ)腎益精。黨參、山藥健脾益氣，使氣血生化有源，氣旺則精足，精足則髓充，髓充則骨養(yǎng)，為腎中精氣的充養(yǎng)提供來源。諸藥合用，可通過補(bǔ)腎健脾，達(dá)到強(qiáng)筋壯骨之目的。在使用健骨顆粒含藥血清后，隨著干預(yù)時間的延長，培養(yǎng)液中的ALP、BGP、ColⅠ的含量逐漸上升。其中對照組3種信號因子的含量最高，雌激素組次之，健骨顆粒組再次之，模型組最低(P<0.05)。4組TERT、ERα、c-MYCmRNA及蛋白表達(dá)量情況以對照組的蛋白表達(dá)含量最高，雌激素組次之，健骨顆粒組再次之，模型組最低(P<0.05)。提示健骨顆粒通過補(bǔ)腎健脾，調(diào)節(jié)機(jī)體雌激素水平，提高成骨細(xì)胞ERα的表達(dá)，從而使TERT表達(dá)增強(qiáng)，提升了成骨細(xì)胞活性和功能，抑制成骨細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)骨重建過程中骨形成量的增加。

總之，健骨顆粒是通過影響雌激素介導(dǎo)的TERT及其相關(guān)因子的變化，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及延緩細(xì)胞凋亡，是有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一個重要環(huán)節(jié)。