李能 廖瑛, 廖源 孫光華 李新紅 周君*

1. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，湖南 衡陽 421001 2. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)科，湖南 衡陽 421001 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 4. 湖南環(huán)境生物學(xué)院護(hù)理學(xué)院，湖南 衡陽 421005

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種十分常見的退變性關(guān)節(jié)疾病，幾乎涉及關(guān)節(jié)的所有組織，包括關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、軟骨下骨及周圍軟組織的結(jié)構(gòu)改變，關(guān)節(jié)的生物力學(xué)及生物化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變，最終使關(guān)節(jié)軟骨變薄、糜爛；嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)裂隙、潰瘍及全層關(guān)節(jié)軟骨面消失等現(xiàn)象[1]。其病理特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞，軟骨下骨反應(yīng)性增生及硬化，并伴隨骨贅形成[1]。同時(shí)，有基礎(chǔ)研究[2]表明：絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)信號(hào)通路參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展過程。其主要包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、C-jun N末端激酶(c-Jun)和p38激酶(p38)。3種亞型可獨(dú)立或同時(shí)被激活[3]。近來有研究[4]發(fā)現(xiàn)：雙膦酸鹽藥物有抗骨質(zhì)疏松，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用，但具體作用機(jī)制尚不明確。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察伊班膦酸鈉對關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨影響，同時(shí)探討伊班膦酸鈉治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制，為臨床應(yīng)用伊班膦酸鈉治療骨關(guān)節(jié)炎提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

三月齡雄性SD大鼠30只，平均體重362.0g，由南華大學(xué)動(dòng)物部提供。

1.2 主要儀器設(shè)備和試劑

主要試劑：伊班膦酸鈉(艾本；河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心)；引物合成及探針修飾：上海生物工程有限公司；Taq DNA PCR反應(yīng)試劑盒；TAKARA大連寶生 批號(hào)ck3501AA； Trizol：美國invitrogen批號(hào)50563209；dNTP：購自美國普洛麥格(Promega)公司；批號(hào)251230；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker：Marker I，顯示條帶：100、200、300、400、500、600bp)，購自北京TIANGEN公司。②主要儀器：奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(日本)；FTC2000實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀，加拿大楓嶺(FUNGLYN)公司；MSE Micro-Centaur Centrifμge微型臺(tái)式離心機(jī)，日本Sanyo公司；Micro-CT，廣州中科愷盛醫(yī)療科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組：采用隨機(jī)生成數(shù)字表分成3組，假手術(shù)組、ACLT組(切斷右前交叉韌帶骨關(guān)節(jié)炎組)、治療組(切斷右前交叉韌帶致膝骨關(guān)節(jié)炎+伊班膦酸鈉治療組)，每組10只。參照文獻(xiàn)[5]：ACLT組及治療組均采用切斷大鼠的右側(cè)前交叉韌帶方法(ACLT術(shù))建立膝關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。假手術(shù)組只切開關(guān)節(jié)腔，不切斷前交叉韌帶。術(shù)后不固定老鼠，允許自由活動(dòng)。溫度(20～26℃)，濕度為60%～70%， 12 / 12h的光/暗循環(huán)，自由飲水和飲食。實(shí)驗(yàn)程序符合《動(dòng)物保護(hù)法》中華人民共和國(2001)。手術(shù)后1 w，治療組：予以伊班膦酸鈉10 μg/kg, 腹腔注射,每周1次,共12 w；ACLT組：予以等量生理鹽水, 腹腔注射,每周1次,共12 w；假手術(shù)組：不予以特殊處理。

1.3.2 檢測指標(biāo)：①使用顯微CT技術(shù)觀察軟骨下骨：Micro-CT掃描及定量分析實(shí)驗(yàn)周期完成后，采用頸椎脫臼法處死大鼠。并取大鼠的右側(cè)脛骨近端于40 g/L多聚甲醛中固定。再將大鼠脛骨近端放置于Micro-CT的工作槽中。其中，Micro-CT的掃描參數(shù)為：旋轉(zhuǎn)角度為220°，其增量為0.6°，分辨率45.0 μm，曝光時(shí)間為3000 ms，每層的間距為16 μm。對同一樣本獲得大概200張不同橫截面圖像。并對骨組織行定量分析，具體分析指標(biāo)如下：骨體積分?jǐn)?shù)(bone volμme fraction, BV/TV)以%表示；骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)以像素值表示；骨小梁數(shù)量(trabecular nμmber, Tb.N)以 1/像素值表示；骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)以像素值表示。②關(guān)節(jié)軟骨組織光學(xué)顯微鏡觀察和改良Mankin評分：完成Micro-CT檢測后，取右側(cè)脛骨近端標(biāo)本，使用20%EDTA二鈉(pH 7.15)溶液浸泡，至組織完全脫鈣。再經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟后切片。切片常規(guī)脫蠟、自來水沖洗。0.5%番紅O染液滴染1 min，再采用95%乙醇分化，風(fēng)干，二甲苯透明，最后中性樹膠固定。顯微鏡下然后觀察各組右脛骨平臺(tái)軟骨組織學(xué)形態(tài)改變。并根據(jù)Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)[6]，從不同方面對關(guān)節(jié)軟骨的損傷進(jìn)行評估。包括：軟骨外觀改變、軟骨細(xì)胞數(shù)、軟骨鈣化層和軟骨下骨改變、潮線的形態(tài)變化等方面。③使用RT-PCR 技術(shù)檢測mRNA表達(dá)：取SD大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)股骨端關(guān)節(jié)軟骨為材料。用Trizol試劑提取總關(guān)節(jié)軟骨RNA，取總RNA 5 μL，在20 μL的逆轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA，以5 μL cDNA為模板加入靶基因上下游引物，在50 μL體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)中以“β-actin”(肌動(dòng)蛋白)為內(nèi)參基因。引物序列見表1。

表2 不同組別的顯微CT定量分析表±s)Table 2 Quantitative analysis micro-CT of different groups(±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05,**P<0.01；與ACLT組比較，#P<0.05,##P<0.01

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences of target genes

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Micro-CT及骨組織定量分析

通過Micro-CT及骨組織定量分析可見：與假手術(shù)組相比，ACLT組的BV/TV、Tb.N顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P<0.05、P<0.05)，Tb.Th兩組之間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Tb.Sp顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療組的BV/TV、Tb.N明顯高于ACLT組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P<0.05、P<0.05)，Tb.Th兩組之間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)治療組Tb.Sp明顯小于ACLT組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳細(xì)見圖1及表2。

圖1 各組Micro-CT圖像 a假手術(shù)組 bACLT組 c治療組Fig.1 Micro-CT images of each group. a Sham-operated group; b ACLT group; c Treatment group

2.2 軟骨形態(tài)學(xué)比較及軟骨mankin評分

假手術(shù)組：軟骨細(xì)胞基本正常；ACLT組：關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，中度以上增生，潮線模糊，并可見纖維變形和裂隙存在；治療組：軟骨及基質(zhì)排列尚有一定規(guī)律，關(guān)節(jié)軟骨變薄，輕微的表面粗糙。ACLT組Mankin評分較假手術(shù)組顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ACLT組相比，治療組Mankin評分顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳細(xì)見圖2、表3。

圖3 不同組別MMP-13、C-JUN、ERK1及P38相對表達(dá)量 A.MMP-13相對表達(dá)量；B.C-jun相對表達(dá)量;C.ERK-1相對表達(dá)量;D.P38相對表達(dá)量與假手術(shù)組比較，** P<0.01；與ACLT組比較，## P<0.01Fig.3 The relative expression levels of MMP-13, C-JUN, P38, and ERK-1 in each groupA The relative expression levels of MMP-13; B The relative expression levels of C-JUN; C The relative expression levels of ERK-1; D The relative expression levels of P38

圖2 各組軟骨組織形態(tài)學(xué)比較(番紅染色×100倍) a假手術(shù)組 bACLT組 c治療組Fig.2 Comparison of cartilage tissue morphology among the group. (saffron-stained, ×100). a Sham-operated group; b ACLT group; cTreatment group.

組 別Mankin 評分假手術(shù)組0.67±0.707ACLT組 7.30±1.636 **治療組 3.80±1.317 ##

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與ACLT組比較，##P<0.01

2.3 C-JUN、ERK1、P38及MMP-13的mRNA表達(dá)水平

本實(shí)驗(yàn)計(jì)算擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)，mRNA的相對表達(dá)量使用標(biāo)化后2-△△Ct值來表示，計(jì)算基因初始拷貝數(shù)的相對量。與假手術(shù)組相比，ACLT組中的 C-JUN、ERK1、P38、MMP-13mRNA表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.01)；與ACLT組相比，治療組中的C-JUN、ERK1、 P38、 MMP-13mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.01)。具體見圖3，如下。

3 討論

在英國、美國約有5%～10%成年人患有膝關(guān)節(jié)炎；僅在美國，2009年因骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的髖、膝人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)的醫(yī)療費(fèi)用就高達(dá)423億美元[7]。而在我國，有流行病學(xué)的調(diào)查研究表明：有癥狀的 OA 患病率約在 5.1%～20.8%之間[8]。隨著中國人口老年化，OA這一問題也將越來越突出，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，社會(huì)醫(yī)療支出巨大，給個(gè)人、家庭、乃至社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此，探討OA的有效治療方法及作用機(jī)制具有重要的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)價(jià)值。

OA的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其中炎癥細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteases，MMPs)、軟骨下骨的重建失衡可能在骨關(guān)節(jié)炎致病過程中起了重要作用[9]。目前一致認(rèn)為：在OA的早期，軟骨下骨的重建以骨吸收為主[10, 11]；而在OA的后期，軟骨下骨的重建以骨形成為主，并最終出現(xiàn)軟骨下骨硬化[12]。本實(shí)驗(yàn)使用腹腔注射骨吸收抑制劑伊班膦酸鈉，在OA發(fā)展的早期抑制骨吸收，恢復(fù)軟骨下骨生物力學(xué)效應(yīng)，并同時(shí)觀察關(guān)節(jié)軟骨的變化。

本實(shí)驗(yàn)通過Micro-CT發(fā)現(xiàn)：ACLT組軟骨下骨骨小梁較假手術(shù)組稀疏，部分骨小梁可見結(jié)構(gòu)紊亂。而治療組軟骨下骨骨量雖然也伴有稀疏，但較ACLT組排列有序。同時(shí)通過骨組織定量分析顯示：與假手術(shù)組相比，ACLT組的BV/TV、Tb.N顯著降低，而Tb.Sp顯著增高。說明ACLT組的骨小梁數(shù)量及其連接密度下降，存在骨質(zhì)疏松現(xiàn)象。骨質(zhì)疏松使得骨損傷發(fā)生概率增加，反復(fù)多次的骨損傷可導(dǎo)致骨形成啟動(dòng)，骨形成使得軟骨下骨發(fā)生硬化，生物力學(xué)強(qiáng)度下降，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生損傷，最終加速OA的發(fā)展。我們從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在OA發(fā)生發(fā)展過程中，軟骨下骨扮演著重要角色。

OA中軟骨下骨與關(guān)節(jié)軟骨的串聯(lián)增強(qiáng)[13]，使得軟骨下骨有可能成為治療OA的新作用靶點(diǎn)[10]。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)通過抑制軟骨下骨重建[14]，可減緩關(guān)節(jié)的退變，從而使得骨性關(guān)節(jié)炎得到一定的緩解。而雙膦酸鹽類藥物[15]可通過對破骨細(xì)胞的調(diào)控，阻礙其皺褶邊緣形成而切斷破骨細(xì)胞對于骨質(zhì)的吸收與破壞，從而在OA早期抑制軟骨下骨的骨質(zhì)疏松，達(dá)到治療或改善OA的目的。在本實(shí)驗(yàn)中：治療組與ACLT組相比，BV/TV、Tb.N顯著增高，Tb.Sp顯著降低。說明伊班膦酸鈉能抑制軟骨下骨的骨質(zhì)疏松，改善軟骨下骨的生物力學(xué)性能，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。而且，在本實(shí)驗(yàn)中：ACLT誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生病理性紊亂，纖維組織增生；同時(shí)，Mankin評分顯著增高，而伊班膦酸鈉顯著抑制關(guān)節(jié)軟骨退變，使得Mankin評分降低。

目前，大多數(shù)研究人員一致認(rèn)為：OA是在力學(xué)和生物學(xué)等多種因素共同作用下，軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及軟骨下骨三者結(jié)構(gòu)和功能失衡的結(jié)果[16]。其中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要特征[17]，而MMPs就是在細(xì)胞外基質(zhì)的生理性和病理性降解中起重要作用的蛋白酶超家族，它廣泛地存在于各種組織及細(xì)胞中。既往研究發(fā)現(xiàn)：在發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎的過程中，MAPKs信號(hào)通路占據(jù)著重要角色[18-20]，它不僅能夠調(diào)節(jié)軟骨的成熟[21]，而且也能調(diào)控軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解[16]，影響軟骨下骨的重建。而MAPKs及其亞型均可在軟骨細(xì)胞中表達(dá)，并可對MMPs的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[22, 23]。目前，在基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員中，MMP-13被認(rèn)為是關(guān)節(jié)軟骨在病理生理過程中與MAPKs信號(hào)通路聯(lián)系最緊密的[2, 24-27]。此前使用人類細(xì)胞的研究中，腫瘤壞死因子(TNF)刺激OA軟骨細(xì)胞中MMP-13的表達(dá)量增加是通過MAPK 44/42和JNK途徑來實(shí)現(xiàn)的[19]。MMP-13能夠降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中最具有特征且含量最多的II型膠原。所以，軟骨外基質(zhì)中II型膠原的變化情況可以通過MMP-13的表達(dá)量來反映[28]。在本實(shí)驗(yàn)中：ACLT組中的MAPKs信號(hào)通路(C-JUN、ERK1、 P38)表達(dá)量及MMP-13表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，說明骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí)，MAPKs信號(hào)通路被激活；而與ACLT組相比，治療組的MAPKs信號(hào)通路(C-JUN、ERK1、P38)表達(dá)量及MMP-13水平同樣明顯降低，表明說明在使用伊班膦酸鈉后，MAPKs信號(hào)通路被抑制，從而調(diào)控MMP-13的表達(dá)減少，減輕了關(guān)節(jié)軟骨的退化，起到了保護(hù)軟骨下骨及關(guān)節(jié)軟骨的作用。其可能的機(jī)制為：伊班膦酸鈉通過對MPAKs信號(hào)通路的抑制，使得MMP-13表達(dá)減少，從而II型膠原形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分解較少，同時(shí)抑制了破骨細(xì)胞的效應(yīng)，延緩了OA早期的骨吸收效應(yīng)，使得骨小梁數(shù)量及密度增加，骨小梁間隔變窄，軟骨下骨的骨質(zhì)疏松得到改善，最后達(dá)到延緩或治療OA的效應(yīng)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)行ACLT術(shù)可使SD大鼠出現(xiàn)典型的骨關(guān)節(jié)炎的表現(xiàn)，同時(shí)也可以看到軟骨下骨發(fā)生骨質(zhì)疏松改變。使用伊班膦酸鈉不僅可以改善軟骨下骨的微觀結(jié)構(gòu)，抑制軟骨下骨的骨質(zhì)疏松，而且還可減少軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，抑制關(guān)節(jié)軟骨退變。伊班膦酸鈉可能通過調(diào)控MAPKs信號(hào)通路的機(jī)制緩解大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變，并且抑制軟骨下骨的骨質(zhì)疏松。因此，伊班膦酸鈉可能成為治療OA的潛在性藥物之一。