李鉞 謝煒星 晉大祥 溫龍飛 丁金勇 徐繼禧

廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

隨著老年化社會的到來，骨質(zhì)疏松癥已成為一個嚴重的社會問題，危害著中老年人的健康。骨質(zhì)疏松癥是一種骨代謝疾病，它是以骨微細結(jié)構(gòu)破壞、低骨量、骨折風險增加為特點。它有許多并發(fā)癥，包括骨折、殘疾以及慢性疼痛[1]。骨形成和骨吸收在其發(fā)病機制中起到了重要的作用。成骨細胞參與骨形成，破骨細胞參與骨吸收，骨質(zhì)疏松的原因就是骨吸收增加而骨形成作用減弱，最終導致骨量減少。

研究發(fā)現(xiàn)，在各種類型的骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中都伴隨著氧化應(yīng)激水平的升高[2]。氧化應(yīng)激是因為細胞內(nèi)的抗氧化作用和活性氧的產(chǎn)生之間的不平衡，從而對細胞產(chǎn)生不利影響。生理水平的活性氧對于保持正常的成骨細胞功能是有益的，而當細胞內(nèi)活性氧的積累明顯增加時，氧化應(yīng)激將對成骨細胞造成嚴重危害，并將導致骨質(zhì)疏松[3]。

腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activated protein kinase，AMPK)是細胞內(nèi)的能量和代謝感受器，AMPK的激活對于調(diào)節(jié)整個細胞的能量和代謝平衡至關(guān)重要[4]。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK被激活后，對保護成骨細胞免受氧化應(yīng)激的損害發(fā)揮重要作用。本文就AMPK的激活與成骨細胞關(guān)系及作用機制的最新進展作一綜述。

1 AMPK的介紹

1.1 AMPK的結(jié)構(gòu)和功能

AMPK是由α、β、γ3個亞單位組成的三聚體，分別按照α∶β∶γ=1∶1∶1的比率組成，其中發(fā)揮催化作用的是α亞基，起調(diào)節(jié)作用的是β和γ亞基。α、β、γ亞基含有多種基因編碼的異構(gòu)體(α1、α2、β1、β2、γ1、γ2、γ3)[5]。見圖1。

AMPK的主要功能元素是α亞基，其包含蛋白激酶域(KD)、α-鉤狀結(jié)構(gòu)(α-hook)和自我抑制序列(AID)以及一個與β亞基鏈接的C-末端(α-CTD)4個重要結(jié)構(gòu)域[6]。蛋白激酶域(KD)包含一個絲氨酸/色氨酸激酶區(qū)，其中含有一個蘇氨酸(Thr-172)位點，該位點的磷酸化是酶活化所必需的。自我抑制序列(AID)的功能是抑制AMPK的催化作用，C-末端(α-CTD)形成一個球狀域，這個球狀域與β亞基的C-末端連接起來，此結(jié)構(gòu)對于形成α、β、γ的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)意義深遠[5]。

β亞基被認為是蛋白激酶的骨干，它有兩個特殊的區(qū)域，糖原鏈接域(GBD)和α、γ亞單位結(jié)合域(β-CTD)。它的調(diào)節(jié)功能涉及碳水化合物的代謝平衡。AMPK最重要的亞基是γ亞基，因為它是體內(nèi)AMPK水平的傳感器[5]。γ亞基則由 1 個與β亞單位互相結(jié)合的結(jié)合域和 4個胱硫醚-β-合成酶(CBS)串聯(lián)重復序列組成的兩個貝特曼域(betaman domain) 組成[6]。

圖1 AMPK結(jié)構(gòu)模式圖Fig.1 The structure of AMPK

1.2 AMPK的生理調(diào)控機制

AMPK作為能量調(diào)節(jié)器，參與多種代謝活動，其活性調(diào)節(jié)涉及復雜的信號通路和調(diào)控機制。目前認為AMPK的活性主要受細胞中AMP/ATP比率的調(diào)節(jié)，AMP/ATP比率升高，則AMPK被激活[7]。

AMPK可以被一些上游的AMPK激酶，如絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(LKB1)、轉(zhuǎn)化生長因子活化激酶-1(TKA1)、鈣調(diào)蛋白激酶激酶(CaMKKS)直接激活。它們都是通過直接磷酸化AMPKα亞單位上的Thr-172而激活AMPK[8]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(LKB-1)是最主要的AMPK上游調(diào)節(jié)激酶，體內(nèi)外實驗均證實LKB-1可以直接使Thr172磷酸化，但是它發(fā)揮作用需要依賴STRAD-M025復合物[5]。

研究表明，無論LKB-1還是CaMKKS，它們均不能被腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)直接激活，只有在細胞內(nèi)Ca離子水平增加后才能被激活。研究發(fā)現(xiàn)，在大腦內(nèi)，CaMKKS激活AMPK被認為是最重要的方式。作為一種可被選擇的激酶，TKA1可使骨骼肌激活，它在心臟內(nèi)AMPK的激活作用中也發(fā)揮重要作用[5]。

2 AMPK與成骨細胞功能

2.1 AMPK與NADPH

還原型輔酶Ⅱ(NADPH)是一種輔酶，在成骨細胞中起遞氫體的作用，參與多種合成代謝反應(yīng)。Jeon[9]的研究表明，AMPK在NADPH的代謝中發(fā)揮重要作用，其中AMPK/ACC(腺苷酸激活蛋白激酶/乙酰輔酶 A 羧化酶)信號軸在維持NADPH的代謝平衡中發(fā)揮作用。激活AMPK可以減少活性氧的積累，從而減輕氧化應(yīng)激的作用，并通過增加NADPH的活力，主要是增加NADPH的合成以及限制NADPH的分解，最終達到保護細胞免受氧化應(yīng)激的破壞[10]。

Guo等[11]研究發(fā)現(xiàn)，使用Compound13(一種小分子的AMPK激活劑)可以激活依賴AMPK的NADPH信號通路，它可以抑制地塞米松產(chǎn)生活性氧，同時Compound13可以增加培養(yǎng)的鼠MC3T3-E1細胞的NADPH活力。但是假如使AMPK基因突變或?qū)⒋嘶蚯贸?，這種增強NADPH活力的作用將會受到抑制。這個實驗結(jié)果表明，Compound13激活AMPK，通過增加NADPH數(shù)量，從而抑制地塞米松產(chǎn)生的氧化應(yīng)激對培養(yǎng)的成骨細胞的破壞作用。

She等人[12]的研究發(fā)現(xiàn)，使用AMPK的抑制劑CompoundC或敲除基因后，可以顯著增加過氧化氫處理過的MG63細胞所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，同時他們觀察到細胞內(nèi)高的NADPH+與NADPH之間的比例，顯示過氧化氫處理過的MG63細胞內(nèi)產(chǎn)生更多的NADPH消耗。由以上實驗可以得出，激活AMPK后可以通過減少氧化應(yīng)激條件下成骨細胞內(nèi)NADPH的消耗，而起到抗氧化的作用。

2.2 AMPK與成骨細胞自噬

自噬(autophagy)是以自噬體的出現(xiàn)為特征，對細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和細胞生存至關(guān)重要，當細胞在缺乏營養(yǎng)或發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時，可誘發(fā)自噬現(xiàn)象[13]。將細胞暴露在應(yīng)激條件下將產(chǎn)生自噬，它可以使細胞在氧化條件下或營養(yǎng)/生長缺乏的條件下生存。

最新的研究表明，AMPK是自噬活動的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。事實上，一方面AMPK可以通過自身磷酸化及刺激UK1而直接引起自噬；另一方面，調(diào)節(jié)mToRc1(雷帕霉素靶蛋白的復合體)而抑制其發(fā)揮作用可間接產(chǎn)生自噬；再者，Lc3B-1(微管相關(guān)蛋白輕鏈3B)在自噬形成過程中也起重要作用，通過類泛素系統(tǒng)，Lc3B-1經(jīng)脂化作用轉(zhuǎn)變?yōu)長c3B-2引起自噬[12]。

She等人[12]的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過氧化氫培養(yǎng)的MG63細胞可以產(chǎn)生UK1的磷酸化、mToRc1被抑制以及Lc3B-1通過脂化作用轉(zhuǎn)變?yōu)長c3B-2，引起Lc3B-2的上調(diào)。這些實驗數(shù)據(jù)都顯示成骨細胞自噬活動的發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，使用自噬抑制劑3-MA及bafilo myciaAI后，可以破壞過氧化氫作用下細胞自噬活動的產(chǎn)生；另外，將AMPKα基因敲除后，也可以抑制成骨細胞內(nèi)自噬活動的產(chǎn)生。通過這些實驗，可以推測在氧化應(yīng)激條件下，AMPK被激活后，它可以增加成骨細胞內(nèi)自噬活動，最終達到保護成骨細胞的作用。

2.3 AMPK與成骨細胞凋亡

細胞凋亡(apotosis)是細胞受基因調(diào)控而發(fā)生的一種主動的程序化死亡過程，對維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要的生物學意義。成骨細胞凋亡是骨組織發(fā)生、發(fā)育、修復等過程中的一種重要的調(diào)節(jié)機制，它在維持成骨細胞的數(shù)目及功能方面具有重要的作用[14]。大量的體內(nèi)外實驗證實成骨細胞凋亡在骨丟失的病理過程中影響深遠，之前的研究還證實成骨細胞凋亡與骨密度的減少相關(guān)。

Zhu等人[15]的研究發(fā)現(xiàn)，使用濃度為10mM的A-769662(AMPK的激活劑)試劑將人MG-63細胞預處理1h后，再將其放在過氧化氫溶液中處理，培養(yǎng)48h后，使用FACS和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，過氧化氫產(chǎn)生的多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)清除量減少，在氧化應(yīng)激條件下，PARP可作為細胞內(nèi)有效監(jiān)測DNA損傷的分子感受器，參與修復損傷或誘導細胞凋亡[16]；Caspase-3 是參與凋亡級鏈反應(yīng)最終效應(yīng)子， 是細胞凋亡的真正執(zhí)行者，也被稱為“死亡蛋白酶”。激活后的Caspase-3 引導下游其他一系列Caspase 蛋白激活，從而導致細胞凋亡[17]。這兩種酶的清除量減少表明A-769662試劑可以抑制過氧化氫產(chǎn)生成骨細胞凋亡，使用AMPK的抑制劑CompoundC或用shRNA將AMPK基因沉默，均可加速過氧化氫產(chǎn)生的成骨細胞凋亡，表明A-769662試劑的細胞保護作用隨著AMPK被抑制或作用減弱而減少。

在另外一項實驗中，實驗者使用AMPK的抑制劑CompoundC去阻礙AMPK激活，結(jié)果顯示，使用了抑制劑后，過氧化氫處理過的成骨MG63細胞凋亡數(shù)量增加，然后他們使用AMPKα基因被沉默的MG63細胞觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過氧化氫處理過的成骨細胞凋亡數(shù)量顯著增加[12]。以上結(jié)果表明，AMPK抗氧化作用是通過減少成骨細胞凋亡而達到的。

2.4 AMPK與成骨細胞內(nèi)ATP

最新的研究表明，幾乎所有的真核細胞在應(yīng)激條件下(包括缺氧或缺乏能量的狀態(tài))，將會導致ATP的數(shù)量減少，進而出現(xiàn)AMP/ATP的比率增加，從而激活AMPK，而激活AMPK可以提高維持體內(nèi)ATP的內(nèi)穩(wěn)態(tài)的能力以提高細胞生存。

Yang等[10]的實驗發(fā)現(xiàn)，地塞米松處理過的MC3T3-E1細胞，ATP的數(shù)量是減少的，使用氧化劑NaHS(H2S的供體，大量實驗證明H2S有抗氧化的功能)可以抑制ATP減少；當使用AMPK抑制劑后，NaSH對ATP數(shù)量的影響作用將會減弱。進一步研究表明NaHS抑制地塞米松產(chǎn)生ATP消耗，AMPK的激活在這個過程中起重要作用。

Zhu等人[15]的研究發(fā)現(xiàn)，MG-63或MC3T3-E1細胞經(jīng)過氧化氫處理后，ATP的數(shù)量都減少了，但使用AMPK的激活劑A-769662處理后成骨細胞內(nèi)ATP數(shù)量有所增加，當他們使用AMPK抑制劑CompoundC后，ATP數(shù)量將會減少。通過以上實驗可以認為由于過氧化氫處理后的成骨細胞將會導致ATP數(shù)量下降，這會刺激AMPK，導致AMPK被激活，通過體內(nèi)調(diào)節(jié)以維持成骨細胞內(nèi)ATP水平，從而達到保護成細胞免受氧化應(yīng)激損害的目的。

3 AMPK激活作為骨質(zhì)疏松治療的通路

AMPK激活后可以通過以上各種方式影響成骨細胞，進而保護成骨細胞免受氧化應(yīng)激的作用，這些方式不是孤立存在的，它們之間是相互聯(lián)系的。激活AMPK可能是這樣保護成骨細胞免受氧化應(yīng)激的損害：AMPK被激活后通過提高NADPH的合成及減少其消耗，調(diào)節(jié)ATP的體內(nèi)平衡，激活自噬活動等這些途徑共同達到抑制過氧化氫產(chǎn)生成骨細胞凋亡。

綜上所述，骨質(zhì)疏松作為一種多病因的慢性代謝性疾病，與多種因素相關(guān)，這些因素可以通過氧化應(yīng)激這條共有的機制來影響成骨細胞的功能。氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮重要作用，過多的ROS通過影響多種細胞因子或酶活性來調(diào)控多條信號通路，最終影響成骨細胞的功能，打破以破骨細胞和成骨細胞之間的動態(tài)平衡，從而促使骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)生，進而影響骨代謝。目前的文獻沒有對其相關(guān)聯(lián)的通路有一個系統(tǒng)且清晰的概括。因此，有必要對通路進行深入研究，便于更好地指導骨質(zhì)疏松新藥的研發(fā)[18]。

激活AMPK作為其中的一種重要調(diào)節(jié)機制，可以影響成骨細胞在氧化應(yīng)激條件下NADPH的合成、ATP的代謝、細胞凋亡、細胞自噬等活動。通過激活AMPK，可以增加成骨細胞活力，進而影響骨代謝平衡，為骨質(zhì)疏松的治療提出理論依據(jù)。