葉智衛(wèi) 蔡瑾 梅小剛 朱呂佶 高克加

上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院核醫(yī)學科，上海 200002

在人們對自身健康、保健的意識不斷增強的現(xiàn)狀下，中、老人群中常見的疾病骨質疏松癥也逐步出現(xiàn)增多趨勢[1-2]。不能夠早期診斷和及時干預治療，可發(fā)生各種嚴重的并發(fā)癥，并影響患者的生活質量[3-5]。因此，關鍵在于早期的診斷方法和早期干預治療。

1 資料與方法

1.1 資料

制作骨質疏松動物模型的實驗兔由上海生旺實驗動物養(yǎng)殖有限公司提供；動物飼養(yǎng)和實驗場所在上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院動物實驗室；核素骨骼顯像劑“99mTc-MDP”(锝-99m-亞甲基二膦酸鈉)由上海欣科藥業(yè)有限公司提供；治療藥物“99Tc-MDP”(锝-99-亞甲基二膦酸鈉)由成都云克藥業(yè)責任有限公司提供：其中A瓶為99Tc液(5.5 ug/5ml)，B瓶為MDP 5mg/瓶(用于治療類風濕性關節(jié)炎和骨性疾病)；地塞米松磷酸鈉針劑(DX)5mg/1ml，上海信誼藥廠生產。儀器設備：骨密度測定儀(雙能X線骨密度儀LUNAR. DXP-L.USA)。骨生物力學測定(骨力學測試儀INSTRON-5543.USA)。核素骨骼顯像(SPECT Sopha DSX 法國產)，使用低能通用平行孔準直器。CT為飛利浦CT-SECURA，X線攝片、病理、骨形態(tài)計量檢測及生化儀均為常規(guī)設備。放射性標準源：Isotope Products Laboratories Radioactive Material(美國)Gd-153 100uCi(3.7MBq)取3枚(300 uCi)作為放射性對照標準源(radioactive standard source，RSF)。

1.2 方法

1.2.1制作兔模型的方法與分組：取健康新西蘭實驗兔64只，平均體重(2.5±0.23)kg，采用肌肉注射DX誘導制作兔骨質疏松動物模型[6-7]。按隨機數(shù)字表形式安置實驗兔并分為2個階段。(1)第1階段制作模型階段：將實驗兔分為正常組(A組，16只)，肌肉注射0.9%注射用生理鹽水，用量為1 ml/kg；早期骨量減少模型組(B組，24只)，肌肉注射DX量為2 mg/kg，每周2次，時間為2 w，第3周開始肌肉注射DX 量為2 mg/kg，每周1次，以作維持；骨質疏松模型組(C組，24只)，肌肉注射DX量為2 mg/kg，每周2次，模型制作時間為6 w。第7周處死A、B、C組各8只，進行病理骨組織學、骨密度等各指標比較，顯示正常組與早期骨量減少模型組、骨質疏松模型組之間的差別，以證實模型成立。(2)第2階段將原A組余下的8只實驗兔設為治療階段正常對照組(D組)，將B組余下的16只實驗兔設為早期骨量減少模型對照組(E組)和早期骨量減少模型治療組(F組)，將C組余下的16只實驗兔設為骨質疏松模型對照組(G組)和骨質疏松治療組(H組)。所有模型組實驗兔注射DX量改為2 mg/kg，每周1次，維持模型至實驗結束，總觀察療程為14w。在治療結束時進行核素“99mTc-MDP”骨骼顯像以及相關檢測。骨骼顯像條件采用低能高分辨平行孔準直器，矩陣128×128，取靜態(tài)俯臥位，采集時間10min。F組、H組治療方法：采用非放射性核素藥物99Tc-MDP治療，用量參考臨床成人用量。將A瓶中99Tc液5ml注入B瓶內，搖勻1min后，稀釋于0.9%注射用生理鹽水中，以0.2mg/(5ml·kg)的稀釋濃度對F組、H組實驗兔進行耳靜脈推注治療，每周一次。

1.2.2動物實驗觀察檢測指標：核素骨骼掃描感興趣區(qū)(region of interest，ROI)值半定量測定、病理骨組織學、骨形態(tài)計量、骨密度、生物力學試驗、X線、CT攝片以及血清BALP、BGP等指標，分析各組之間的差異和“99mTc-MDP”骨骼顯像的特點。

實驗兔的第1階段和第2階段結束后均取其腰椎、股骨頭及股骨行病理細胞學、骨形態(tài)計量(骨小梁體積%)、骨密度(分別采用整體股骨、單個椎體進行檢測骨密度，g/cm2)、生物力學試驗(分別以股骨三點彎曲、腰椎壓縮方法、最大壓縮載荷試驗，單位為N)檢測。處死前進行X線攝片、CT攝片、核素骨骼顯像ROI值[8](骨骼顯像取骨代謝功能變化明顯、攝取放射性相對最高的區(qū)域為高攝取ROI：第3腰椎、股骨頭、膝關節(jié)、股骨中段與攝取放射性與體外固定RSF進行比值對照)。處死時取血清行BALP、BGP骨代謝指標檢測。

1.3 動物實驗結果進行相對模型評判設想和療效評價

1.3.1模型評判：(1)正常組：病理骨細胞學骨小梁排列規(guī)則、均勻，無斷裂、無形態(tài)破壞，骨形態(tài)計量、骨密度、生物力學試驗、X線、CT攝片、核素骨骼掃描以及血清BALP、BGP所取得的結果為相對正常對照標準；(2)早期骨量減少組：病理骨細胞學骨小梁輕度變細，排列較均勻，但無破壞形態(tài)，骨形態(tài)計量、骨密度、骨力學、X線、CT攝片與正常對照組比較應變化不明顯，但核素骨骼顯像ROI比值和血清BALP、BGP升高；(3)骨質疏松組：病理骨細胞學骨小梁排列不規(guī)則、明顯稀疏，存在骨小梁斷裂現(xiàn)象，骨形態(tài)計量、骨密度、生物力學降低明顯，核素骨骼顯像ROI比值與正常組比較明顯增高，血清BALP、BGP升高，X線、CT攝片隱見骨小梁存在稀疏現(xiàn)象。

1.3.2相對療效的評判：根據(jù)骨細胞學、骨密度、骨形態(tài)計量上升或下降，結合對早期骨量減少敏感指標核素“99mTc-MDP”骨骼顯像ROI比值結果的增高或降低，同時觀察X線、CT攝片的骨小梁密度增加或稀疏以及血清BALP、BGP的變化相對區(qū)分為治療顯效、有效和無效。(1)顯效：F組在E組模型的基礎上，病理骨細胞學接近正常對照組，核素骨骼顯像ROI比值降低、血清BALP、BGP在原來的基礎上有所降低；H組在G組模型的基礎上，病理骨細胞學在骨小梁斷裂、破壞狀態(tài)有所修復，骨小梁增多、增粗，骨密度、骨形態(tài)計量增加>5%，生物力學升高、核素骨骼顯像ROI比值降低>5%，血清BALP、BGP在原來的基礎上降低>15%，X線、CT攝片骨質密度有所改善；(2)有效：F組在E組的基礎上略有改善，而H組在對應模型的基礎上，主要指標中有一項改善，病理骨細胞學骨小梁增粗，排列及密度有所升高，斷裂、破壞形態(tài)得到修復，骨密度、骨形態(tài)計量、生物力學升高<5%，>0%，核素骨骼顯像ROI比值降低<5%，>0%，血清BALP、BGP在原來的基礎上降低<15%，>0%，X線、CT攝片基本無改變；(3)無效：F組和H組在病理骨細胞學無改變，H組骨小梁斷裂明顯，呈骨破壞形態(tài)。骨密度、骨形態(tài)計量、生物力學、核素骨骼顯像ROI比值、血清BALP、BGP、X線、CT攝片在原來的基礎上沒有改變或加重。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

在第1階段制作模型結束，病理檢查結果顯示：A組股骨頭或腰椎的骨小梁排列規(guī)則，分布均勻，骨組織和關節(jié)表面未見骨質破壞；而C組則表現(xiàn)為軟骨破壞，骨小梁稀疏、斷裂，骨母細胞消失等明顯骨破壞現(xiàn)象；早期骨量減少模型組(B組)則表現(xiàn)為骨小梁存在略有變細，也無斷裂現(xiàn)象。3組實驗兔“99mTc-MDP”骨骼顯像結果均存在差異，與外界固定RSF的比值更能顯示差異(見表1)。

表13組實驗兔的相關指標檢測結果
Table1Results of the test index in the three groups of experimental rabbits

組別左股骨頭骨密度(g/cm2)第4腰椎骨密度(g/cm2)左股骨頭骨力學(N)第4腰椎骨力學(N)骨形態(tài)計量(%)血清BALP(30～120IU/L)血清BGP(0 5～5 0ng/ml)第3腰椎放射性/標準源股骨頭放射性/標準源膝關節(jié)放射性/標準源股骨中段放射性/標準源A組(n=8)0 294±0 016⊕0 302±0 021⊕405 341±51 300﹡⊕750 875±82 733﹡⊕131 501±27 225⊕12 375±4 391﹡⊕115 296±16 595﹡⊕2 976±0 403﹡⊕2 949±0 393﹡⊕2 863±0 457﹡⊕1 346±0 172B組(n=8)0 287±0 277﹟0 290±0 036﹟338 200±51 623﹡﹟493 729±72 541﹡﹟126 786±18 629﹟18 571±6 872﹡﹟138 080±17 823﹡﹟4 165±0 585﹡﹟4 208±0 329﹡﹟4 115±0 286﹡﹟1 047±0 121C組(n=8)0 238±0 150﹟⊕0 236±0 152﹟⊕265 914±48 859﹟⊕369 671±57 658﹟⊕66 230±10 043﹟⊕45 000±6 771﹟⊕168 080±16 139﹟⊕4 845±0 475﹟⊕5 445±0 942﹟⊕5 189±1 083﹟⊕1 740±0 333

注：t檢驗顯示：﹡、﹟、?為組與組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

B、C組與A組之間“99mTc-MDP”骨骼顯像ROI比值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但A組與B組間在骨密度、骨形態(tài)計量指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但骨力學和血清BALP、BGP之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。A組與C組間骨密度、骨形態(tài)計量、骨生物力學、血清BALP、BGP檢測結果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此實驗兔輕度骨質疏松模型和骨質疏松模型成立。

第2階段，經14 w治療和觀察，可見D、E、G組3組骨組織病理切片、骨密度等指標檢測結果分別與制模6w時的A、B、C組的結果基本相似。經過干預治療后，F(xiàn)組在E組的基礎上骨病理學顯示：股骨頭的骨小梁排列基本規(guī)則，骨小梁有所增粗；而H組在G組的基礎上，骨病理則表現(xiàn)為骨小梁略有增粗，骨小梁粗細不均勻，但無斷裂現(xiàn)象(見圖1)。

圖1 各階段實驗兔股骨頭組織病理學骨小梁的變化(HE染色，10×40)。A：正常組；B：早期骨量減少組；C：骨質疏松組；D：早期骨量減少治療組；E：骨質疏松治療組Fig.1 The change of the trabecular bone of the femoral head in different stages (HE staining, 10×40). A：Normal group；B：Early bone reduction group；C：Osteoporosis group；D：Early bone reduce treatment group；E：Osteoporosis treatment group

經治療后，“99mTc-MDP”骨骼顯像ROI比值也出現(xiàn)降低(見圖2)，骨密度、骨形態(tài)計量、骨生物力學、血清ALP、BGP檢測結果顯示，F(xiàn)組、H組分別在E、G組的基礎上得到了改善，F(xiàn)組各項指標接近于D組，而H組尚不能達到D組的水平。以骨生物力學升高明顯(見表2)。

圖2 各階段實驗兔核素骨顯像的變化。顯示各組實驗兔骨骼對放射性骨顯像劑“99mTc-MDP”攝取量程度不一樣，E、F組的股骨頭、膝關節(jié)攝取99mTc-MDP明顯增高(P<0.05)。A：正常組；B：早期骨量減少組；C：骨質疏松組；D：早期骨量減少治療組；E：骨質疏松治療組Fig.2 Changes in radionuclide bone imaging in rabbits at different stages. The experimental results show that the intake of radioactive bone imaging agent “99mTc-MDP” is not the same in each group. The intake of 99mTc-MDP significantly increased the femoral head and knee joint in E and F group (P<0.05). A：Normal group；B：Early bone reduction group；C：Osteoporosis group；D：Early bone reduce treatment group；E：Osteoporosis treatment group

表2 治療14 w后F組、H組與其他各組的實驗室檢測比較Table 2 Comparison of laboratory indexes between F, H groups and other groups after 14-week treatment

注：經抗骨質疏松治療的F、H組分別與相應對照組E、G組相比較，療效明顯(P<0.05)。

表2顯示，F(xiàn)、H組分別在E、G組的基礎上各項檢測指標得到不同程度的改善，而與D組比較，F(xiàn)、H組分別在股骨頭骨密度差異為1.33%(P>0.05)和9.27%(P<0.05)；椎體骨密度差異為0.33%(P>0.05)和9.45%(P<0.05)；股骨頭生物力學差異為2.47%(P<0.05)和15.91%(P<0.05)；椎體生物力學差異為1.44%(P<0.05)和10.03%(P<0.05)；骨形態(tài)計量差異為1.64%(P>0.05)和25.27%(P<0.05)；核素骨骼顯像ROI比值差異為21.94%(P<0.05)和55.76%(P<0.05)；血清BALP差異為25%(P<0.05)和147.62%(P<0.05)，BGP降低4.54%(P<0.05)和16.99%(P<0.05)。F組與H組比較各指標差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相對療效的評判均為顯效，以F組更明顯。但X線、CT攝片改變不明顯，可能與動物模型較小有關。

3 討論

骨質疏松癥的診斷目前主要是依靠骨密度儀檢測。但是，骨密度的檢測范圍值是在一定數(shù)量人群的統(tǒng)計均值，也僅是一個參考值[9-11]，對于不同種族、不同地區(qū)、不同的生活習慣、從事不同工種以及個體差異等的因素與骨密度的參考值存在差異，如何克服各種因素及個體差異，能夠早期評估骨質疏松(早期骨量減少)將是有益于臨床早期判斷個體的骨吸收已經開始和防治的關鍵。

核素骨骼顯像是一種利用與骨組織存在特異親合力的顯像劑，在短時間內到達全身骨組織參與骨代謝并能夠顯示骨組織成骨功能的變化，提示異常骨鈣流失的功能診斷技術。骨骼顯像劑“99mTc-MDP”屬一種雙膦酸鹽類的化合物，進入人體后能夠馬上吸附在骨組織的羥基磷灰石表面[12]，當骨鈣流失加快、成骨功能相對增強時，該部位骨組織攝取“99mTc-MDP”即增加，能較直觀、及時地反映骨組織功能代謝的現(xiàn)狀[13-14]，因此，不論種族、生活習慣、職業(yè)等，在早期骨量減少時，尚未發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)結構(骨密度)明顯改變或只要出現(xiàn)骨鈣流失加快、成骨功能相對增強時，“99mTc-MDP”骨顯像即能夠表現(xiàn)為骨組織代謝增強，動物模型可見早期骨量減少組和骨質疏松組骨顯像結果即如此。當早期骨量減少，骨密度改變不明顯時，“99mTc-MDP”骨顯像即能發(fā)現(xiàn)骨組織代謝異常，是早期骨量減少的診斷提供依據(jù)。

治療藥物“99Tc-MDP”與核素骨骼顯像劑“99mTc-MDP”的化學結構相似，但其物理性質不同，僅在化學結構上少一個“m”，沒有“m”即不含放射性，是一種治療骨質疏松的雙膦酸鹽藥物，但二者在聚集到骨質損傷或破壞部位的羥基磷灰石表面的生理作用相同，也是一種靶向性治療藥物。當骨質疏松部位骨組織攝取骨骼顯像劑“99mTc-MDP”增加時，同樣攝取治療性藥物“99Tc-MDP”也增加，起到抑制骨吸收作用外，同時還存在調節(jié)免疫功能，保護過氧化歧酶(SOD)的活力，防止自由基對組織的破壞，并對炎性介質和免疫調節(jié)因子白介素Ⅰ(IL-1)的產生有抑制作用[15-16]。在動物實驗中，早期骨量減少的F組經治療性藥物“99Tc-MDP”治療后，療效明顯優(yōu)于骨質疏松的H組。由此可見，核素99mTc-MDP骨骼顯像對早期成骨性骨代謝異常敏感性強。另顯示在早期骨量減少期給予早期干預治療將得到更滿意的療效。