盧嚴方 林貫川 劉倩倩 劉夢宜 馬文麗 潘星華

南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，廣東 廣州 510515

六味地黃丸是宋代錢乙創(chuàng)制的滋陰補腎的方劑，由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉組成，為補益劑，具有滋陰補腎之功效。現(xiàn)代藥理研究也已證實六味地黃方劑具有治療骨質(zhì)疏松、增強免疫功能、抵抗衰老病癥及其他功效[1-2]。

隨著中藥現(xiàn)代化的不斷推進和基因芯片的廣泛應用，在中醫(yī)藥治療疾病方面產(chǎn)生了大量的基因芯片數(shù)據(jù)，然而由于數(shù)據(jù)分析技術(shù)的局限性，大量的數(shù)據(jù)并沒有得到充分的利用，因此本研究針對美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)上六味地黃丸治療骨質(zhì)疏松癥方面的功效相關(guān)數(shù)據(jù)集進行基因表達譜差異及其相關(guān)功能機制的分析。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)集

本研究所采用的與六味地黃丸相關(guān)的基因表達譜數(shù)據(jù)(登錄號為GSE57273)，是從NCBI數(shù)據(jù)庫GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載，在GEO Series數(shù)據(jù)庫搜索框中以“Liuwei Dihuang Pill”為檢索詞，獲得由Xie等人提交的芯片數(shù)據(jù)GSE57273。GSE57273所用的實驗平臺是Agilent公司的014850人類全基因組芯片4x44K G4112F(特征數(shù)版)，采取患者骨外周血進行芯片檢測，共有3例患者，6個樣本，其中六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥前樣本數(shù)為3個(對照組)，治療3個月后樣本數(shù)為3個(實驗組)。生物芯片檢測對組織樣本數(shù)的最低要求為3個，3個就已經(jīng)達到生物學重復，有統(tǒng)計學意義。此數(shù)據(jù)樣本病例的納入標準和排除標準以及合并用藥均有嚴格詳細的規(guī)范[3]。

1.2 分析工具

1.2.1數(shù)據(jù)處理和差異基因分析：Qlucore Omics Explorer3.0(http://www.qlucore.se/)可用于分析基因芯片、miRNA芯片、甲基化芯片和蛋白質(zhì)芯片，該軟件功能全面，操作簡便。本研究利用Qlucore Omics Explorer3.0軟件對芯片數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，先將數(shù)據(jù)集導入Qlucore Omics Explorer3.0軟件，進行標準化處理(平均數(shù)為0，標準差為1)，采用Two Group Comparsion(兩組樣本T檢驗)統(tǒng)計分析方法，對數(shù)據(jù)進行有效過濾，從而篩選出差異基因[4]。

1.2.2差異基因的GO富集分析和通路分析：生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫(the database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID)為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，能夠找出最顯著富集的生物學注釋。本研究是將篩選出的差異基因上傳至DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在線軟件，選擇DAVID軟件中的基因功能注釋聚類分析(Functional Annotation Clustering)，對這些差異基因進行生物學通路、分子功能、生物學過程預測分析[5-6]。

1.2.3差異基因編碼蛋白的相互作用分析：蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫(functional protein association networks，STRING)，包含了來自2031種生物的9643763種蛋白質(zhì)，是最大的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫之一，通過STRING在線分析工具，可以直接或間接地預測蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。將差異基因?qū)隨TRING(http://string-db.org/)分析工具，分析其所編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用聯(lián)系圖，找出處在關(guān)鍵節(jié)點的蛋白質(zhì)[7-8]。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃丸對絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥治療前后的差異基因分析

通過QOE軟件導入GSE57273數(shù)據(jù)集進行主成分分析，在沒有經(jīng)過篩選處理之前，可以看到在動態(tài)PCA圖中顯示(見圖1)數(shù)據(jù)樣品之間的分布變異很大，表明數(shù)據(jù)集中的基因需要進行進一步的標準化處理。

圖1 GSE57273篩選前兩組原始動態(tài)PCA圖Fig.1 The picture of original dynamic PCA in two groups before GSE57273 screening

由圖1可以看到兩組數(shù)據(jù)分組，藍色為六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥前的樣品芯片數(shù)據(jù)，黃色為六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥之后的芯片數(shù)據(jù)。但是兩組數(shù)據(jù)相當分散，變異較大，此時基因總變量為19136個基因。

隨后，對數(shù)據(jù)進行標準化處理，使mean=0，variance=1，然后篩選差異基因(如圖2)，此時不同樣品對之間變異縮小，六味地黃丸治療組和未治療組能夠完全分開并各自聚集。此時篩選條件為：P=1.4814e-5<0.05，F(xiàn)old Change=2，Q=0.003<0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。

圖2 GSE57273篩選后兩組的動態(tài)PCA圖Fig.2 The picture of original dynamic PCA in two groups after GSE57273 screening

由圖2可以看出，藍色點(治療前)和黃色點(治療后)已經(jīng)完全分開。表明六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥前后確實存在著基因差異。此時篩選出的差異基因有97個。

將這些篩選出的差異基因經(jīng)熱圖(見圖3)分析之后顯示出治療后上調(diào)基因有2個，分別是TNP1和MAP3K10，下調(diào)基因有95個。

圖3 篩選的差異基因熱圖Fig.3 The heat map of screened differential gene

2.2 差異基因的功能聚類(DAVID)分析

為了驗證篩選出的97個差異基因參與的主要生物學功能，筆者將97個差異基因?qū)氲紻AVID中得到如表1所示的基因功能富集類型。

2.3 差異基因蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡圖(STRING)分析

為了解97個差異基因所編碼蛋白質(zhì)相互關(guān)系的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，筆者把97個差異基因進行了STRING分析，其中STRING識別出的差異基因為88個，得到如圖4所示的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡圖。

由圖4可以看出，在可識別的88個差異基因中，可以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)網(wǎng)絡圖中多數(shù)基因之間相互比較孤立，但是以XRN1為中心的ZNF家族基因(ZNF292、ZNF131、ZNF808、ZNF85、ZNF430、ZNF813、ZNF25、ZNF709、ZNF727)、XPO1、PPP1R8、LSM14A聯(lián)系密切(Connection score>0.400，表明所分析蛋白相互作用可信度在中等以上)。由差異基因表達熱圖(圖3)中可以發(fā)現(xiàn)在篩選出的差異基因中只有TNP1和MAP3K10兩個基因在經(jīng)過六味地黃丸治療后表達上調(diào)，其他基因則全部表達下調(diào)，表明這兩個基因在六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥中可能起著關(guān)鍵作用。經(jīng)過系列分析，筆者可以初步說明六味地黃丸影響絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥治療作用的分子機制主要集中在這6個基因以及ZNF家族基因上。

表1 根據(jù)富集系數(shù)篩選出的六味地黃丸治療前后差異基因功能富集表Table 1 The function enrichment of screened differential genes before and after rehmanniae bolus treatment according to enrichment score

圖4 差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡圖Fig.4 Differential genes in protein interaction networks

2.4 數(shù)據(jù)挖掘和分析

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松腎陰虛證是目前老年婦女的常見病，嚴重影響著老年婦女的身體健康，其發(fā)病機理涉及到骨形成與吸收、激素合成、免疫調(diào)節(jié)、礦物質(zhì)吸收、鞘磷脂代謝、蛋白質(zhì)消化吸收等生物學過程。本文著重就六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松腎陰虛證中的骨形成與吸收、激素合成、免疫調(diào)節(jié)3個方面生物學過程進行相關(guān)分子機制的探討。

2.4.1促進骨的形成：雌激素是女性最為重要的性激素之一，具有促進骨形成與抑制骨吸收的作用，對維持骨密度、提高骨量具有促進作用，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松腎陰虛證的發(fā)生與骨形成的減少和骨吸收的增加密不可分[9]。采用六味地黃丸治療后，從差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)路圖中可以發(fā)現(xiàn)，節(jié)點度最高的基因是XRN1基因，與其密切相關(guān)的則是ZNF家族基因(ZNF292、ZNF131、ZNF808、ZNF85、ZNF430、ZNF813、ZNF25、ZNF709、ZNF727)。ZNF家族基因在細胞中具有許多重要的功能，其最為重要的作用是轉(zhuǎn)錄調(diào)控。筆者發(fā)現(xiàn)經(jīng)篩選出的ZNF家族基因在六味地黃丸治療后全部都是低表達的，而ZNF131基因則是雌激素受體α(ERα)的抑制因子，并且是BTB/POZ轉(zhuǎn)錄因子家族的典型成員，它在細胞內(nèi)普遍表達并具有高度的序列保守性。研究表明ZNF131能夠阻止甚至阻斷ERα結(jié)合雌激素效應元件(ERE)，另外ZNF131也能夠抑制ERα靶基因pS2的表達[10-13]。因此筆者推斷六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證的分子機制可能是通過降低ZNF131基因的表達，減少ZNF131對雌激素受體的抑制作用，從而增加雌激素和雌激素受體(ERα)的結(jié)合，使得成骨細胞活性增加，破骨細胞活性降低，促進骨的形成并抑制骨的吸收。同時，XRN1基因目前已被證實是抑制骨肉瘤的關(guān)鍵基因，而骨肉瘤產(chǎn)生的機制就是瘤細胞直接產(chǎn)生腫瘤骨或骨樣組織。由熱圖中可以看到XRN1基因在六味地黃丸治療之后是低表達的，因此筆者推測六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證在骨形成方面的另一分子機制是通過降低ZNF家族基因的表達來調(diào)控降低成骨細胞中XRN1基因的表達，從而使得成骨細胞更多的轉(zhuǎn)化為骨質(zhì)，達到緩解治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證的作用[13]。

2.4.2促進雌激素與雌激素受體的結(jié)合：性激素能參與骨代謝，其中雄激素主要是間接合成蛋白質(zhì)，促進骨內(nèi)膠原形成，進而促使鈣、磷等在骨內(nèi)沉積。Schweik-ert等指出每個正常男性或女性的骨細胞內(nèi)含(821±140)個分子的雄激素受體，骨細胞中有雄激素受體(AR)基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，并且能表達AR蛋白質(zhì)，證明雄激素對骨細胞的作用是直接的[14-15]。同樣，雌激素也能參與骨的代謝。女性絕經(jīng)后卵巢分泌雌激素功能減退，但卵巢間質(zhì)可分泌雄激素，雄激素在外周可通過芳香化酶的作用轉(zhuǎn)化為雌酮，成為此時血循環(huán)中的主要雌激素[16]。

在熱圖中可以看到所篩選出來的差異基因TNP1在治療后是高表達的(圖3)，由功能通路富集表可知TNP1參與廣泛的生物學過程(調(diào)控轉(zhuǎn)錄、調(diào)控核酸代謝、正調(diào)控分子功能、調(diào)控細胞內(nèi)信號通路以及調(diào)控細胞凋亡等)。研究表明TNP1基因與雌激素受體具有顯著的正相關(guān)性。因此六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證的另一分子機制可能是通過調(diào)控TNP1的表達來增強雌激素受體與雌激素的結(jié)合，進而增加雌激素的生物利用度治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松腎陰虛證[17-18]。

2.4.3增強免疫調(diào)節(jié)：骨免疫學認為免疫系統(tǒng)和免疫因素的調(diào)節(jié)對骨質(zhì)疏松的發(fā)展起著重要作用，同時免疫細胞和骨細胞間的對話也為揭示性激素和炎癥通過調(diào)節(jié)T淋巴細胞功能導致骨丟失機制創(chuàng)造了機遇[19-21]。最近人們認識到，T淋巴細胞可調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的生成、代謝和活性，T細胞分泌的多種細胞因子可抑制成骨細胞的分化并抑制其凋亡，而性激素的老化和減少可影響免疫系統(tǒng)和T細胞；另外T細胞可能具有直接作用于破骨前體細胞從而誘導破骨細胞分化的能力[22]。絕經(jīng)后婦女卵巢功能減退，雌激素水平下降，促進T細胞的激活和增殖，引起體內(nèi)免疫應答因子的變化，抑制成骨細胞的產(chǎn)生，促進破骨細胞的生成并抑制其凋亡，骨吸收超過骨形成，導致骨偶聯(lián)失衡，引發(fā)骨重建失衡，最終引起骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[23-25]。

另外，在篩選出來的差異基因中另一個高表達基因是MAP3K10，即絲裂原活化蛋白激酶10。MAP3K10基因參與廣泛的生物學過程，其中尤為重要的一點是參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)錄，能夠調(diào)節(jié)核酸代謝和細胞凋亡[26-27]。而在蛋白質(zhì)網(wǎng)絡圖中與XRN1基因聯(lián)系密切的XPO1基因則是參與細胞周期調(diào)控的基因，同時與XPO1基因聯(lián)系密切的NUP54基因是一個蛋白編碼基因，其相關(guān)通路與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)[28-29]。因此六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥在免疫調(diào)節(jié)上的分子機制可能是通過上調(diào)MAP3K10基因的同時下調(diào)XPO1基因，進而使得NUP54基因表達降低，引起免疫應答減弱，減少T細胞的活化，促進成骨細胞的生成，抑制破骨細胞的合成并促進其凋亡，達到治療絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥的目的。

3 結(jié)論

六味地黃丸作為中成藥的代表之一，其對人體的功效正在被不斷地挖掘發(fā)現(xiàn)。本文針對六味地黃丸對絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥的功效在基因?qū)用嫔献髁艘幌盗械臄?shù)據(jù)挖掘分析，旨在得到六味地黃丸治療骨質(zhì)疏松的相關(guān)靶基因和調(diào)控機制，分析結(jié)果顯示其在基因調(diào)控上主要是通過下調(diào)XRN1基因和ZNF家族基因的表達促進雌激素的分泌和上調(diào)MAP3K10基因的表達并下調(diào)XPO1基因和NUP54基因的表達來平衡免疫應答從而促進骨組織的形成。另外，上調(diào)TNP1基因的表達促進雌激素與雌激素受體結(jié)合，提高雌激素的生物利用度，達到治療緩解絕經(jīng)期腎陰虛骨質(zhì)疏松癥的目的，本研究在分子層面上為今后骨質(zhì)疏松癥的臨床治療起到了一定的指導作用。