李應(yīng)福 李寧* 謝興文 宋敏 徐世紅 蔣國(guó)鵬

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

近年來，隨著人們生活節(jié)奏的加快，骨折的發(fā)生率大大提高，繼之骨折后骨缺損的發(fā)生逐年呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，如何使這種高能量、高速度、多復(fù)合傷損傷的愈合時(shí)間與愈合速度及治愈率顯著提升，減少愈合延遲、畸形愈合及不愈合的發(fā)生幾率，已經(jīng)成為骨科領(lǐng)域一項(xiàng)長(zhǎng)期面臨的挑戰(zhàn)與機(jī)遇[1-4]。目前大量研究表明，從分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及基因水平入手，通過中藥血清藥理學(xué)結(jié)合現(xiàn)代化檢測(cè)方法，研究單味中藥或中藥復(fù)方治療疾病的靶點(diǎn)與作用機(jī)制，充分將傳統(tǒng)中醫(yī)藥與西藥治療相結(jié)合，這將成為理論上更具有科學(xué)性、有效性、安全性的新思路[5-6]。在前期研究的探討、分析與總結(jié)基礎(chǔ)上，本研究主要觀察SCF、MCP-1 mRNA在顱骨骨缺損模型大鼠中的作用及通過麝香干預(yù)后對(duì)SCF、MCP-1 mRNA的表達(dá)影響，探討麝香對(duì)骨缺損修復(fù)及愈合的重要作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：300只SD大鼠，雌性150只，雄性150只，體質(zhì)量(200±20)g，均由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物設(shè)施使用證明No：00000230；動(dòng)物質(zhì)量合格證No：62001000000201。

1.1.2藥物、試劑、設(shè)備：麝香購(gòu)于甘肅蘭州安泰堂天順行藥業(yè)，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室鑒定，為天然麝香。氯胺酮注射劑(西安力邦制藥有限公司)。SCF酶聯(lián)免疫試劑盒(Rat SCF ELISA KIT，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)：m1002853)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(型號(hào)RT-6100，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)；Trizol Reagent(invitrogen公司)；RNA的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，promega公司)、SYBR Green Realtime PCR Master Mix(toyobo公司)；Agilent Technologies(SureCycler 8800)；PRO 200型組織勻漿器(上海季諾科貿(mào)有限公司)；顱骨鉆(南韓STRONG 90)；CT14RD臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海天美生化儀器設(shè)備有限公司)；Q5000微量紫外分析儀(美國(guó)Quawell公司)；7500型PCR熱循環(huán)儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2方法

1.2.1顱骨骨缺損模型的建立：嚴(yán)格以氯胺酮0.1 g/kg體重腹腔注射大鼠，2～4 min后取俯臥位，利用自制固定板固定大鼠頭部及四肢，頭部術(shù)野處濕毛、剪毛、碘伏消毒，然后剪長(zhǎng)約1～1.5 cm縱行切口，除去局部骨膜充分暴露顱骨。用直徑5 mm鉆頭的顱骨鉆在術(shù)野處造成直徑約5 mm的圓形骨缺損，以不損傷頭部毛細(xì)血管及硬腦膜為原則，用無菌生理鹽水沖洗骨缺損區(qū)域，去除殘存骨屑，然后逐層縫合，縫完皮膚層后用碘伏消毒傷口[7]。

1.2.2分組與給藥：所有模型大鼠稱重，按體重編號(hào)，采用完全隨機(jī)法分為給藥組與模型組，每組各150只，然后再將這兩組通過完全隨機(jī)法分別分為3小組，每組50只。給藥組灌服麝香，以4.2 mg/100 g為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)，灌胃劑量按人與大鼠體重的折算公式計(jì)算，麝香通過研缽將其充分研磨后溶于折算后蒸餾水中反復(fù)吹打，模型組灌服等體積的生理鹽水，兩組均每日灌服一次，分別持續(xù)灌服7 d、14 d、28 d。

1.2.3檢測(cè)標(biāo)本制備：對(duì)所有模型大鼠持續(xù)灌胃7 d時(shí)，分別對(duì)給藥組(第1組)、模型組(第4組)大鼠進(jìn)行股動(dòng)脈采血及顱骨骨缺損處取材；持續(xù)灌胃14 d時(shí)，分別對(duì)給藥組(第2組)、模型組(第5組)大鼠進(jìn)行股動(dòng)脈采血及顱骨骨缺損處取材；持續(xù)灌胃28 d時(shí)，分別對(duì)給藥組(第3組)、模型組(第6組)大鼠進(jìn)行股動(dòng)脈采血及顱骨骨缺損處取材；將每次取出的血液3 000 r/min離心10～15 min，取上清，放置-20℃冰箱備用。將每次制備的顱骨骨缺損樣本標(biāo)號(hào)、液氮冷凍、放入冷凍管，放置-80 ℃冰箱備用。

1.2.4SCF含量測(cè)定：參照J(rèn)ian1等[8]的方法，按照SCF試劑盒檢測(cè)說明書操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。具體步驟：稀釋標(biāo)準(zhǔn)品→加樣品及標(biāo)準(zhǔn)品→加酶→顯色液A、B→加入終止液→15 min內(nèi)450 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。根據(jù)OD值和標(biāo)準(zhǔn)物濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將OD值代入相應(yīng)公式計(jì)算最終濃度。

1.2.5MCP-1 mRNA含量測(cè)定：參照 Xu等[9]的方法：①按照Trizol法提取組織總RNA說明書操作，取100 mg骨缺損組織加入1 ml Trizol，用小剪刀將其剪碎，利用勻漿器將骨組織充分勻漿，依照提取步驟提取骨缺損組織總RNA，通過微量紫外分析儀檢測(cè)總RNA濃度與純度，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性。②各組取16 ul總RNA聯(lián)合promega RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒其他試劑形成40 ul體系逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。③以完成逆轉(zhuǎn)cDNA為模板按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix說明書操作加入相關(guān)試劑及引物最終成20 ul體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如表1，具體反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，61 ℃退火30 s，95 ℃退火15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。以7500型PCR熱循環(huán)儀分析軟件，將相對(duì)定量值RQ及處理后CT值用于統(tǒng)計(jì)分析。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

圖1 肉眼觀察顱骨骨缺損模型Fig.1 Macroscopic observation of the skull bone defect model

圖2 顱骨骨缺損處取材樣本Fig.2 Sample collection from the skull bone defect

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 造模完成后肉眼觀察大鼠顱骨有一5 mm左右的圓形骨缺損(圖1)

2.2 顱骨骨缺損取材(圖2)

2.3 麝香對(duì)兩組顱骨骨缺損模型大鼠不同時(shí)間段內(nèi)血清中SCF表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組SCF表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì)，與模型組比較，給藥組第7天SCF含量表達(dá)最高，且兩組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；給藥組第14天SCF表達(dá)水平較之前降低，與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第28天SCF表達(dá)水平又有所增高，且與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。給藥組不同時(shí)間段各組內(nèi)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示在麝香的干預(yù)下，可能主要通過上調(diào)SCF表達(dá)水平來促使骨缺損區(qū)域的修復(fù)愈合，與模型組比較，第7天和第28天其表達(dá)均增高，但第7天表達(dá)更加顯著。見表2。

表2 大鼠骨缺損模型血清中SCF表達(dá)Table 2 Expression of serum SCF in rat bone defect model

注：與模型組比較，*P<0.01。

2.4 麝香對(duì)兩組顱骨骨缺損模型大鼠不同時(shí)間段內(nèi)顱骨骨缺損處MCP-1 mRNA表達(dá)的影響

與模型組比較，MCP-1 mRNA在第7天表達(dá)最高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0046)，第7天之后持續(xù)降低，第28天接近于模型組，給藥組第14天與第28天與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，給藥組各時(shí)間段比較顯示，第7天和第28天比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。說明通過對(duì)顱骨骨缺損模型大鼠不同時(shí)間段灌服麝香后，MCP-1 mRNA可能在第7天出現(xiàn)高表達(dá)有助于缺損區(qū)的修復(fù)，縮短愈合時(shí)間。見表3。

表3 大鼠骨缺損模型骨缺損組織中MCP-1 mRNA表達(dá)水平Table 3 Expression of mRNA MCP-1 in bone defect of rat bone defect model

注：與模型組比較，*P<0.01。

MCP-1擴(kuò)增曲線前期曲線基線平整，低濃度樣本指數(shù)期明顯，各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，為較理想的擴(kuò)增曲線，見圖3。圖4顯示其溶解曲線呈單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物較純且單一，為較理想的溶解曲線。

圖3 MCP-1擴(kuò)增曲線Fig.3 MCP-1 amplification curve

圖4 MCP-1溶解曲線Fig.4 MCP-1 dissolution curve

3 討論

骨折后骨缺損疾病在臨床上越來越多見，經(jīng)過長(zhǎng)期的臨床觀察及治療效果，發(fā)現(xiàn)治療方式的多種多樣(自體骨、異體骨、組織工程骨、人工骨修復(fù)材料等)，其治療效果均有一定程度的局限性。為了在這方面有所突破，尋求一個(gè)快速、安全、高效、低損傷的治療方法，探索其作用途徑及效果顯得尤為重要。麝香是鹿科動(dòng)物成熟雄體(馬麝、原麝等)香囊中的干燥分泌物。其味辛性溫，歸心、脾、肝經(jīng)，具有開竅醒神、活血通絡(luò)、散結(jié)止痛等功效，《本草綱目》記載：它有“通諸竅，開經(jīng)絡(luò)，透肌骨”等功效。其性辛香走竄，臟腑筋骨、肌膚孔竅無所不達(dá)，麝香的用途十分廣泛，主要作用于溫?zé)岵⌒跋菪陌地?、猝然倒仆、氣郁暴厥、牙關(guān)緊閉及癥瘕積聚、跌打損傷等證。目前已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在骨折修復(fù)愈合微環(huán)境過程的不同時(shí)期確實(shí)存在具有誘導(dǎo)成骨作用的多種生長(zhǎng)因子與細(xì)胞因子參與、調(diào)節(jié)的。傳統(tǒng)接骨方藥中頻繁的使用麝香治療跌打損傷、骨折等疾病，說明麝香具有引藥物直達(dá)病所的作用，但到底是哪些存在于骨細(xì)胞中的骨生長(zhǎng)因子，并且是通過哪種途徑在特定的微環(huán)境中進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)機(jī)體自我修復(fù)能力，這是本實(shí)驗(yàn)研究的主要內(nèi)容。研究發(fā)現(xiàn)[10]低濃度麝香可以促使大鼠顱骨骨缺損處基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1的表達(dá)增加，促進(jìn)大鼠顱骨骨缺損處骨痂形成，縮短愈合時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)主要探索麝香促使骨缺損修復(fù)愈合的機(jī)制可能與SCF、MCP-1有關(guān)。

SCF在維持造血細(xì)胞存活，促使成體干細(xì)胞增殖與分化的過程中起重要作用，不僅促進(jìn)干細(xì)胞分裂，且抑制細(xì)胞凋亡[11]。SCF生物學(xué)活性的發(fā)揮主要通過與其受體c-kit結(jié)合實(shí)現(xiàn)，SCF在骨缺損區(qū)或骨折區(qū)通過促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的大量募集是骨修復(fù)與骨愈合的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)及微環(huán)境條件下重要的前提條件。徐麗等[12]利用SD大鼠建立下頜骨缺損，采用免疫組織化學(xué)法及免疫印跡法檢測(cè)骨缺損區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)SCF含量的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種檢測(cè)方法在骨缺損修復(fù)過程中SCF表達(dá)比正常組織中明顯增高，且與時(shí)間均呈負(fù)相關(guān)，這說明SCF在骨缺損修復(fù)過程中與促使骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等密切相關(guān)，是一種重要的趨化因子。而本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)SCF第7天表達(dá)最高，隨后呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，這表明骨缺損在不同時(shí)期其表達(dá)作用將有所變化，這可能與骨折愈合分期存在密切關(guān)系。MCP-1作為一種對(duì)單核細(xì)胞有趨化作用的重要調(diào)控因子，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，主要通過調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞的聚集或疏散而起作用，參與炎癥反應(yīng)的遷移與黏附、釋放與聚集、清除致炎物質(zhì)和組織修復(fù)等。因此，MCP-1不僅對(duì)骨骼的修復(fù)與重塑有重要作用，在腎病、免疫缺陷性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤等疾病中也扮演著重要角色[13]。相關(guān)研究表明，阻斷MCP-1 表達(dá)可明顯減緩缺血性心肌病的發(fā)展[14]；鄭力峰等[15]通過對(duì)48例腰椎間盤突出癥患者檢測(cè)髓核組織中MCP-1 mRNA表達(dá)含量，發(fā)現(xiàn)由于明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及炎性反應(yīng)的出現(xiàn)，可分泌大量的細(xì)胞因子，同時(shí)使MCP-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，這說明MCP-1會(huì)隨患者疼痛癥狀的變化而發(fā)生異常[16]，其機(jī)理與本研究基本相符，MCP-1的主要功能是趨化和激活單核細(xì)胞至炎性反應(yīng)部位，骨折前期釋放大量炎性因子發(fā)生炎性反應(yīng)，灌服麝香可以使MCP-1向骨缺損區(qū)大量聚集并激活微環(huán)境中相關(guān)信號(hào)通路或調(diào)節(jié)因子而發(fā)揮促愈合作用，后期隨著其炎性反應(yīng)相應(yīng)減少M(fèi)CP-1 mRNA表達(dá)也就降低。另外有研究報(bào)道，MCP-1在正常骨組織中不表達(dá)，但在出現(xiàn)骨骼相關(guān)炎癥反應(yīng)過程中會(huì)出現(xiàn)非持續(xù)性的MCP-1上調(diào)，其炎性反應(yīng)程度越重MCP-1 上調(diào)越高，例如惡性原發(fā)性骨腫瘤和轉(zhuǎn)移性骨腫瘤組織中MCP-1的表達(dá)均明顯高于良性骨腫瘤[17-18]。這可能與激活相關(guān)細(xì)胞因子并調(diào)節(jié)成骨-破骨系統(tǒng)之間的失衡狀態(tài)，進(jìn)而促使骨骼的修復(fù)與重塑有關(guān)[19]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明SCF、MCP-1可能參與骨缺損修復(fù)與重建的整個(gè)過程，這對(duì)促使骨折后骨缺損愈合，縮短愈合時(shí)間等方面提供了新的思路，對(duì)探索中藥在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下參與疾病的修復(fù)及治療方面有重要意義。但尚存在一些仍需要繼續(xù)研究探索的問題，例如SCF、MCP-1趨化因子是通過哪種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起修復(fù)作用；雖然得出促使骨缺損修復(fù)的機(jī)制可能與增加SCF、MCP-1mRNA有關(guān)，但其修復(fù)效果的最佳時(shí)間點(diǎn)仍需要大樣本、多層次的基礎(chǔ)研究；是否存在具有相同作用或更好療效的其他因子以及表達(dá)量不同的具體作用機(jī)制，這些問題的解決才能進(jìn)一步為臨床治療骨缺損疾病提供有力的依據(jù)。