王麗麗 馬如風(fēng) 于娜 劉海霞 朱如愿 柳辰玥 張淑靜 高譽(yù)珊 葛東宇 牛建昭高思華 張東偉*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)糖尿病研究中心，北京 100029

長期的高脂飲食可能導(dǎo)致骨吸收增加，骨形成減少[1]，最終誘發(fā)下頜骨骨量丟失，發(fā)生骨質(zhì)疏松[2]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)肥胖患者的骨密度(bone mineral density，BMD)下降，骨脆性增加[3]。高脂飲食可以改變大鼠體內(nèi)的氧化-還原平衡，引起丙二醛(malondialdehyde，MDA)和NF-κB水平升高，SOD活性降低[4]。高脂飲食也可以誘發(fā)Cathepsin的高表達(dá)[5]，從而促進(jìn)骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展[6]。研究發(fā)現(xiàn)，NADPH 氧化酶4(Nox4，NADPH oxidase 4)的高表達(dá)與NF-κB的激活、SOD水平降低[7]以及Cathepsin K的表達(dá)密切相關(guān)[8]。

研究表明，丹參對于骨骼疾病和肥胖癥有一定的治療作用，這種作用可能與其抑制Cathepsin K活性有關(guān)[9]。丹酚酸B(圖1)是丹參的活性成分之一，具有抗氧化活性，可改善高脂飲食引起的糖脂類代謝紊亂和肝損傷[10]。但是，丹酚酸B是否通過抗氧化作用而改善骨質(zhì)代謝，目前還未知。因此，為了探索丹酚酸B對高脂飲食小鼠牙槽骨代謝作用和可能的作用機(jī)制，本研究擬采用丹酚酸B干預(yù)治療高脂飲食的C57BL/6小鼠12 w后，觀察小鼠牙槽骨組織病理變化和生物力學(xué)變化，以及其可能對氧化還原通路Nox4-SOD-NF-κB-Cathepsin K的調(diào)節(jié)作用。

圖1 丹酚酸B的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of Sal-B

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器：雙能X線骨密度儀，美國Hologic公司；RM2255徠卡輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，德國Leica公司；Olympus BX53倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；WF-4005微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)，深圳市瑞格爾儀器有限公司。

1.1.2試劑和藥材：ECL超敏發(fā)光液，購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；骨組織抗原修復(fù)液，購自上海舜百生物科技有限公司；Cathepsin K抗體(ab19027)和NF-κB-p65抗體(ab16502)，購自Abcam Biocompany(Cambridge,MA,美國)；Nox4多克隆抗體(NB110-58849)，購自Novus Biologicals (Littleton,CO,美國)；SOD多克隆抗體(sc-11407)，購自Santa Cruz Biotechnology (Dallas,TX,美國)；DAB 顯色液，購自中山金橋生物科技公司(北京,中國)；高脂飼料(高脂飲食，MD12032)，包括45%脂肪、20%蛋白質(zhì)和35%碳水化合物，購于江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司(揚(yáng)州，江蘇，中國)。

1.1.3動物：SPF級C57BL/6雄性小鼠，體重18～20 g，購自北京華阜康動物科技有限公司(北京，中國)，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心清潔級動物實(shí)驗(yàn)室(合格證號SCXK(京)2011-0024，室溫20℃，相對濕度±45%，光暗周期12 h/12 h)。實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠給予自由飲水。

1.2 方法

1.2.1動物模型構(gòu)建：將30只C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)自由等分為正常組、模型組和丹酚酸B組等3組，每組10只。丹酚酸B組每天給予丹酚酸B[125 mg/(kg·d)]，正常組和模型組小鼠每天給予同體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃12 w。實(shí)驗(yàn)期間，正常組小鼠給予正常飼料飼養(yǎng)，其余兩組小鼠均給予高脂飼料飼養(yǎng)。

1.2.2取材及樣品制備：12 w后，將小鼠用1%戊巴比妥(0.4 ml/100 g)腹腔麻醉，分離牙槽骨(mandibles)。 在冰上剝離小鼠附著的肌肉組織后，將其先置于10%中性福爾馬林中固定72h后再放入15% EDTA鈉(pH7.4)溶液脫鈣，脫鈣液每兩周更換一次，連續(xù)脫鈣3個月后沖水，包埋，切片備用。

1.2.3骨密度的測定：使用雙能X線(DEXA)的小動物成像軟件，對小鼠的牙槽骨進(jìn)行掃描，然后統(tǒng)一劃定形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的區(qū)域進(jìn)行圖像分析，測得牙槽骨BMD。

1.2.4牙槽骨HE染色：將牙槽骨石蠟切片(5 μm)常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，Olympus BX53倒置顯微鏡下觀察病理變化并拍照。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色：牙槽骨石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用骨組織抗原修復(fù)液抗原修復(fù)后，3% H2O2室溫孵育30 min，然后用10%山羊血清封閉30 min，滴加1% BSA稀釋的一抗[NF-κB (1∶50) or Nox4(1∶50) or Cathepsin K(1∶50) or SOD (1∶50)]，4 ℃孵育過夜，滴加辣根酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。每組選取牙槽骨切片中6個互不重疊的視野，采用Image Pro Plus6.0分析軟件進(jìn)行圖像分析，測定陽性細(xì)胞的平均吸光度(A)，取6個視野平均值納入。A值高，則細(xì)胞陽性染色(胞漿內(nèi)見棕黃色顆粒)強(qiáng)度高。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

圖4 丹酚酸B對高脂飲食小鼠牙槽骨組織中Nox4表達(dá)的影響。 A：免疫組化染色圖片(×10，×40)。B：免疫組化圖像分析結(jié)果。結(jié)果以表示，與模型組小鼠相比較，*P<0.05；與正常組小鼠相比較，#P<0.05Fig.4 The representative immunohistochemical staining pictures (A, ×10, ×40) and image analysis (B) show Nox 4 expression in the mandibles of mice. Values are expressed as means ± SD. *P<0.05 compared with HFD,#P<0.05 compared with normal

2 結(jié)果

2.1 丹酚酸B對高脂飲食小鼠牙槽骨骨密度的影響

骨密度是診斷骨質(zhì)疏松的金指標(biāo)，丹酚酸B對高脂飲食小鼠牙槽骨骨密度的影響如圖2所示。由圖2可知，與正常組小鼠相比，模型組小鼠的牙槽骨骨密度明顯降低(P<0.05)。丹酚酸B干預(yù)治療12 w后，與模型組小鼠相比，丹酚酸B組小鼠骨密度明顯升高(P<0.05)。結(jié)果表明丹酚酸B能夠抑制高脂飲食引起的小鼠牙槽骨骨量丟失。

圖2 丹酚酸B對高脂飲食小鼠牙槽骨骨密度改變的影響，結(jié)果以表示，*P<0.05，與模型組小鼠相比較；#P<0.05，與正常組小鼠相比較Fig.2 BMD change of mandibular bone (mg/cm2) after HFD. Values are expressed as means ± SD. *P< 0.05 compared with HFD, #P< 0.05 compared with normal

2.2 丹酚酸B對高脂飲食小鼠牙槽骨病理形態(tài)學(xué)的影響

實(shí)驗(yàn)小鼠牙槽骨組織切片HE染色結(jié)果如圖3所示。光鏡(×20)下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠牙槽骨鏡下骨小梁排列整齊呈網(wǎng)狀，骨微結(jié)構(gòu)完整。與正常組小鼠相比，模型組小鼠牙槽骨骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂、變細(xì)、斷裂。與模型組小鼠相比，丹酚酸B組小鼠的骨小梁排列相對整齊，骨微結(jié)構(gòu)形態(tài)明顯改善，骨小梁增粗排列較規(guī)則。這說明丹酚酸B能夠通過改善高脂飲食引起的骨量丟失提高牙槽骨質(zhì)量。

圖3 小鼠牙槽骨HE染色(×20) Fig.3 The representative microscopic images show mandibular histological morphology stained by hematoxylin and eosin (HE×20)

2.3 丹酚酸B對高脂飲食小鼠牙槽骨中Nox4表達(dá)的影響

骨細(xì)胞中Nox4的高表達(dá)，可以激發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[11]。如圖4所示，與正常組相比，模型組小鼠牙槽骨骨小梁表面，骨髓腔中可見Nox4表達(dá)增高(P<0.05)。與模型組相比，丹酚酸B組小鼠牙槽骨中Nox4 水平明顯降低(P<0.05)。這說明丹酚酸B可調(diào)節(jié)高脂飲食引起的小鼠牙槽骨Nox4高表達(dá)而發(fā)揮抗氧化作用。

2.4 丹酚酸B對高脂飲食小鼠牙槽骨中SOD表達(dá)的影響

持續(xù)的氧化應(yīng)激能夠引起體內(nèi)氧化還原失去平衡，導(dǎo)致SOD表達(dá)下降[12]。研究也發(fā)現(xiàn)SOD缺失的小鼠表現(xiàn)為骨脆性增加和骨密度下降[13]。如圖5所示，與正常組小鼠相比，小鼠持續(xù)給予12w的高脂飲食后，牙槽骨SOD表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。與模型組小鼠相比，丹酚酸B能明顯提高高脂飲食小鼠牙槽骨SOD水平(P<0.05)。這表明丹酚酸B可以通過調(diào)節(jié)SOD水平調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠體內(nèi)的氧化還原平衡。

圖5 丹酚酸B對高脂飲食小鼠牙槽骨中SOD表達(dá)的影響。A：免疫組化染色圖片(×10，×10)。B：免疫組化圖像分析結(jié)果。結(jié)果以表示，與模型組小鼠相比較，*P<0.05；與正常組小鼠相比較，#P<0.05Fig.5 The representative pictures (A, ×10, ×10) and image analysis (B) of immunohistochemical staining show SOD expression in the mandible of mice. Values are expressed as means ± SD. *P< 0.05 compared with HFD, #P< 0.05 compared with normal

2.5 丹酚酸B對高脂飲食小鼠牙槽骨中NF-κB-p65表達(dá)的影響

氧化應(yīng)激引起NF-κB活化，進(jìn)而引起骨量丟失[14]。如圖6所示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠NF-κB-p65主要在牙槽骨骨膜和骨髓腔強(qiáng)陽性表達(dá)(P<0.05)。與模型組小鼠相比，丹酚酸B治療12 w后，小鼠牙槽骨組織中的NF-κB-p65的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。這表明丹酚酸B能夠通過降低高脂飲食引起的NF-κB-p65表達(dá)發(fā)揮抗氧化功能。

圖6 丹酚酸B對高脂飲食小鼠牙槽骨組織中NF-κB-p65表達(dá)的影響。A：免疫組化染色圖片(×10，×40)。B：免疫組化圖像分析結(jié)果。結(jié)果以表示，與模型組小鼠相比較，*P<0.05；與正常組小鼠相比較，#P<0.05Fig.6 The representative pictures (A, ×10, ×40) and image analysis (B) of immunohistochemical staining show NF-κB-p65 expression in the mandibles of mice. Values are expressed as means ± SD. *P< 0.05 compared with HFD, #P< 0.05 compared with normal

2.6 丹酚酸B對高脂飲食小鼠牙槽骨中Cathepsin K表達(dá)的影響

Cathepsin K主要由破骨細(xì)胞表達(dá)分泌，被認(rèn)為是破骨細(xì)胞活性和骨吸收的重要指標(biāo)[15]。如圖 7所示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠 Cathepsin K 在牙槽骨骨膜骨吸收陷窩中表達(dá)增高(P<0.05)。丹酚酸B治療12 w后，Cathepsin K表達(dá)明顯下降且接近正常水平(P<0.05)。

圖7 丹酚酸B對高脂飲食小鼠牙槽組織中Cathepsin K表達(dá)的影響。A：免疫組化染色圖片(×10，×40)。B：免疫組化圖像分析結(jié)果。結(jié)果以表示，與模型組小鼠相比較，*P<0.05；與正常組小鼠相比較，#P<0.05Fig.7 The representative pictures (A, ×10, ×40) and image analysis (B) of immunohistochemical staining show cathepsin K expression in mandibles of mice. Values are expressed as means ±SD. *P<0.05 compared with HFD, #P<0.05 compared with normal

3 結(jié)論

丹酚酸B作為丹參的活性成分之一，能促進(jìn)松質(zhì)骨形成，可用于治療糖皮質(zhì)激素引起的松質(zhì)骨骨量丟失[9]。研究表明，丹酚酸B可有效抑制 HMSCs的分化、礦化[16]。同時，高脂飲食可引起頜骨骨密度降低，影響成骨細(xì)胞分化存活，最終導(dǎo)致頜骨骨質(zhì)疏松[2]。本研究也發(fā)現(xiàn)小鼠高脂飲食12 w后，牙槽骨骨密度下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞。丹酚酸B干預(yù)12 w后，小鼠牙槽骨骨密度增加，骨小梁的病理狀態(tài)明顯改善。

高脂飲食可引起體內(nèi)氧化還原失衡[17]。研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食引起Zucker大鼠Nox4 高表達(dá)，促進(jìn)ROS 產(chǎn)生，進(jìn)一步導(dǎo)致NF-κB-p65高表達(dá)[18]。丹酚酸B能下調(diào)人骨髓來源的上皮祖細(xì)胞Nox4水平[19]。丹酚酸B可抑制高脂飲食和/或鏈脲佐菌素引起的丙二醛升高和SOD下降[20]。本研究也發(fā)現(xiàn)丹酚酸B抑制Nox4和 NF-κB表達(dá)，促進(jìn) SOD表達(dá)，從而改善高脂飲食誘發(fā)的小鼠體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)。

研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘發(fā)小鼠Cathepsin K高表達(dá)[21]，而抑制Cathepsin K活性有助于抑制骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展[15]。NF-κB活化也可促使Cathepsin K 的高表達(dá)，而抑制NF-κB活化則有助于降低Cathepsin K的表達(dá)，阻礙骨質(zhì)疏松的發(fā)生[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可以使小鼠牙槽骨組織的NF-κB 和Cathepsin K表達(dá)量上升，引起小鼠牙槽骨骨量丟失。而給予高脂飲食小鼠丹酚酸B干預(yù)12w后，牙槽骨中Cathepsin K 表達(dá)下降，骨密度升高，病理狀態(tài)有一定程度的改善。

綜上所述，高脂飲食小鼠表現(xiàn)出明顯的牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨量丟失。丹酚酸B可通過調(diào)節(jié)Nox4/SOD/NF-κB/Cathepsin K信號通路而改善牙槽骨骨代謝。本研究也首次證明丹酚酸B具有抑制小鼠牙槽骨Cathepsin K表達(dá)的功能。