楊絮唐嵐單偉光

三生合歡飲抗抑郁作用及其對腸道菌群影響的實驗研究

楊絮1唐嵐2單偉光2

目的研究三生合歡飲抗抑郁作用及其對腸道菌群的影響。方法健康雄性昆明種小鼠60只，隨機(jī)分為空白組、模型組、百憂解組及三生合歡飲高、中、低劑量組（15.04g/kg、7.52g/kg、3.76g/kg），每組10只。采用慢性應(yīng)激和孤養(yǎng)的方法復(fù)制慢性應(yīng)激抑郁小鼠模型。第21天測定小鼠體質(zhì)量增加情況、糖水消耗、行為學(xué)以及腦內(nèi)多巴胺遞質(zhì)含量等指標(biāo)。第22天，采集各實驗組小鼠糞便樣品，采用ERIC-PCR技術(shù)獲得反映腸道微生物群落結(jié)構(gòu)特征的ERIC-PCR指紋圖譜。結(jié)果與空白組比較，模型組小鼠在第14天后體質(zhì)量增加顯著降低[14天：（16.22±0.80）g比（20.34±1.06）g]；21天：（20.04±1.62）g比（22.71±1.35）g；P＜0.01），與模型組相比，三生合歡飲高劑量組[14天：（17.93±0.94）g，21天：（22.58±2.15）g]、百憂解組[14天：（17.16±0.93）g，21天：（20.97±2.89）g]小鼠體質(zhì)量增加明顯高于模型組（P＜0.01）；與空白組[14天：（3.94±0.80）mL，21天：（2.62±0.56）mL]比較，模型組小鼠糖水消耗[14天：（2.75±1.01）mL，21天：（2.05±0.76）mL]明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，第21天后三生合歡飲高﹑中﹑低劑量組小鼠糖水消耗量[（3.66±1.05）mL、（3.10±0.70）mL、（3.10±0.70）mL]顯著增加（P＜0.01），百憂解組小鼠糖水消耗[（3.34±1.84）mL]亦明顯增加（P＜0.01）；與空白組[（248.67±43.64）次/s、（35.67±20.66）次/s]比較，模型組小鼠水平活動和垂直活動次數(shù)[（207.55±46.07）次/s]明顯減少（P＜0.05），游泳不動時間[（77.44±64.79）次/s]明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，三生合歡飲低、中劑量組小鼠自主活動次數(shù)[（253.10±40.72）次/s、（251.90±45.39）次/s]顯著增加（P＜0.01），低劑量組小鼠游泳不動時間[（44.70±40.48）次/s]明顯減少（P＜0.05）；與空白組[（1.21±0.34）μg/mL]比較，模型組多巴胺（DA）遞質(zhì)含量[（1.12±0.17）μg/mL]顯著減少（P＜0.05）；與模型組比較，三生合歡飲低劑量組DA含量[（1.31±0.25）μg/mL]明顯提高（P＜0.05）；EKIC-PCR指紋圖譜顯示，模型組與空白組在500bp以上條帶位置、數(shù)量及豐度有較大差異，三生合歡飲中、低劑量組與空白組接近。結(jié)論三生合歡飲有較好的抗抑郁作用，并能調(diào)節(jié)抑郁模型小鼠腸道菌群。

小鼠；抑郁癥；動物模型；三生合歡飲；抗抑郁；行為學(xué)；腸道菌群

抑郁癥是一種常見的情感性精神障礙，隨著社會競爭的增加，抑郁癥發(fā)病率呈逐年上升趨勢。到2020年抑郁癥將成為全球第二大致病和致殘的主要疾病[1]。三生合歡飲為臨床驗方，由石膏、知母、生地、厚樸等12味中藥組成，臨床對中、重度抑郁癥療效顯著。三生合歡飲方通過清陽明經(jīng)熱、除煩生津、調(diào)暢氣機(jī)來治療抑郁癥。本研究采用慢性不可預(yù)知性應(yīng)激抑郁結(jié)合孤養(yǎng)建立小鼠抑郁模型[2]，研究三生合歡飲抗抑郁作用及對腦內(nèi)多巴胺（DA）神經(jīng)遞質(zhì)的影響，并結(jié)合ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)分析三生合歡對抑郁小鼠腸道菌群的影響，以闡明其抗抑郁作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑三生合歡飲浸膏粉（本院藥劑科生產(chǎn)，1g藥粉相當(dāng)于3.63g生藥，批號20100401），用蒸餾水配制成所需濃度；鹽酸氟西汀膠囊（規(guī)格：20mg，美國禮來公司產(chǎn)品，批號9202B）；鹽酸多巴胺（中國藥品生物制品檢驗所，批號100070-200405），供含量測定。雙蒸水、PBS緩沖液（pH7.4，0.1mol/L磷酸鈉緩沖液）、DNA Marker、溶菌酶、核糖核酸酶、PCR試劑盒（dNTPs，Buffer，MgCl2，HotstarTaq酶）購自大連寶生物工程有限公司；Tris飽和酚購自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司；引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2 動物雄性昆明種小鼠（18～22g），購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物合格證：SCXK（滬）2007-0005。

1.3 儀器RF-540型熒光分光光度計，日本島津；紫外-可見分光光度計（型號UV2450），日本島津制造所；移液槍（型號DU24968，DU30930），大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司；移液器（型號P20）、Micro 17R型臺式多功能離心機(jī)，美國SORVALL；PCR儀（veriti 96 well）美國ABI；Gel Doc XR型凝膠成像系統(tǒng)，美國bio-rad；水平電泳儀，美國Bio-Rad。

2 方法

2.1 動物分組健康雄性昆明種小鼠60只，飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，隨機(jī)分為空白組、模型組、三生合歡飲低劑量組（3.76g/kg）、中劑量組（7.52g/kg）、高劑量組（15.04g/kg）（分別相當(dāng)于原生藥13.6g/kg、27.3g/ kg、54.6g/kg）、鹽酸氟西汀對照組（百憂解組）2.6mg/ kg，各10只。除空白組外，其余各組小鼠均為單籠飼養(yǎng)。在造模同時，各組灌胃給藥，空白組及模型組給予等量生理鹽水，1天1次，共21天。

2.2 慢性不可預(yù)知性應(yīng)激抑郁模型的建立參照文獻(xiàn)[3]，除了空白組外，其他各組每天給藥后接受一種刺激，共21天，每種刺激方式不可超過2次且無規(guī)律，應(yīng)激包括：禁食24h﹑禁水24h﹑晝夜顛倒﹑潮濕墊料﹑懸吊15min﹑10℃冷刺激5min﹑45℃熱刺激5min﹑夾尾1min﹑漩渦震蕩1min等。

2.3 測定小鼠體質(zhì)量變化及糖水消耗[4]分別于造模第1、15、22天測定小鼠體質(zhì)量，以造模第1天體質(zhì)量為基礎(chǔ)體質(zhì)量，計算小鼠體質(zhì)量變化。第14、21天禁水，禁水后第2天，給予1%蔗糖水溶液，測定1h內(nèi)飲用量。

2.4 小鼠自主活動測定[5]第21天末次給藥后1h，將小鼠置于木箱（40cm×40cm×40cm）中，底部等分為25方格，記錄5min內(nèi)小鼠自發(fā)活動，觀察指標(biāo)：（1）水平活動次數(shù)：三爪以上跨入鄰格次數(shù)；（2）垂直運(yùn)動次數(shù)：兩前肢離地1cm以上次數(shù)。

2.5 小鼠強(qiáng)迫游泳實驗[5]第21天末次給藥后1h，將各組小鼠分別放入水深10cm的容器中，水溫25℃，觀察6min，觀察并記錄后4min內(nèi)不動時間。

2.6 慢性應(yīng)激抑郁模型小鼠腦內(nèi)DA含量的測定[6]將小鼠斷頭取腦，在冰上剝離全腦，稱重后加入4.5mL酸化正丁醇，制備腦組織勻漿，混勻，離心，取上清液2.5mL，加入正庚烷5mL和0.1mol/L鹽酸1.2mL，混勻，離心，分離到水相。取水相0.5mL，加入磷酸緩沖鹽溶液1.7mL，EDTANa20.4mL，加碘試劑0.lmL，加堿性亞硫酸鈉溶液0.5mL，加入6mol/L HAc液0.5mL，沸水浴加熱20min后，冷卻至室溫，用熒光分光光度法測定DA含量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示。兩個樣品比較用t檢驗，多個樣品均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANONA）。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.8 ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)分析三生合歡飲抑郁小鼠腸道菌群的影響采集造模第22天空白組、模型組及三生合歡飲低、中、高劑量組小鼠新鮮糞便樣品，放置于滅菌離心管中，保存于-20℃。將0.2g新鮮樣品置于2mL離心管中，參照文獻(xiàn)[7]提取糞便總DNA，進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增。參照文獻(xiàn)[8-9]選擇引物序列：ERIC1（5’-ATGAAGCTCCTGGGGAATCCA-3’），ERIC2（5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGATGCG-3’）。擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，包括2μL DNA模板，10×PCR buffer 2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）混合液2μL，正反引物（5pmol/μL）各2μL，1U Taq酶（0.5U/μL）2μL，滅菌水12.5μL。用手指輕彈PCR小管以混合反應(yīng)物，再將離心管放入PCR擴(kuò)增儀按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性5min，40個循環(huán)（95℃變性50s，48℃退火1min，72℃延伸3min），最后72℃延伸9min。PCR產(chǎn)物在1×T AE配制的1%瓊脂糖凝膠（含EB 015mg/L）中電泳檢測，電泳緩沖液為1×T AE，電壓5V/cm，50min，電泳后在凝膠成像儀上檢測并記錄分析結(jié)果。DNA分子標(biāo)準(zhǔn)為1kbp遞增分子標(biāo)準(zhǔn)（1kp plus ladder）。

3 結(jié)果

3.1 三生合歡飲對抑郁模型小鼠體質(zhì)量增加的影響

與空白組比較，模型組小鼠實驗第14天、21天體質(zhì)量增加有顯著降低趨勢（P＜0.01），說明慢性應(yīng)激抑郁模型可使小鼠體質(zhì)量增加明顯下降。與模型組相比，三生合歡飲高劑量組、百憂解組小鼠體質(zhì)量增加明顯高于模型組（P＜0.01），中﹑低劑量組小鼠有增高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 三生合歡飲對抑郁模型小鼠體質(zhì)量增加的影響（g，）

表1 三生合歡飲對抑郁模型小鼠體質(zhì)量增加的影響（g，）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別空白組模型組三生合歡飲高劑量組三生合歡飲中劑量組三生合歡飲低劑量組百憂解組動物數(shù)（只）10 10 10 10 10 10劑量（g/k g）--2.96 1.48 0.74 0.003 14天后20.34±1.06 16.22±0.80△△17.93±0.94** 16.89±1.28 16.86±1.13 17.16±0.93** 21天后22.71±1.35 20.04±1.62△△22.58±2.15** 20.58±1.80 20.58±1.79 20.97±2.89

3.2 三生合歡飲對抑郁模型小鼠糖水消耗的影響與空白組比較，模型組小鼠在第14天后的糖水消耗有顯著降低趨勢（P＜0.01），第21天后也有明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，三生合歡飲高﹑中﹑低劑量組小鼠糖水消耗量顯著增加（P＜0.01）,百憂解組小鼠糖水消耗亦明顯增加（P＜0.01），見表2。

表2 三生合歡飲對抑郁模型小鼠糖水消耗的影響（mL，）

表2 三生合歡飲對抑郁模型小鼠糖水消耗的影響（mL，）

注：與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組比較，**P＜0.01

組別空白組模型組三生合歡飲高劑量組三生合歡飲中劑量組三生合歡飲低劑量組百憂解組動物數(shù)（只）10 10 10 10 10 10劑量（g/k g）--2.96 1.48 0.74 0.003 14天后3.94±0.80 2.75±1.01△△1.84±1.03 3.17±0.57 2.60±1.07 2.13±0.51 21天后2.62±0.56 2.05±0.76△3.66±1.05** 3.10±0.70** 3.10±0.70** 3.34±1.84**

3.3 三生合歡飲對抑郁模型小鼠行為學(xué)的影響與空白組比較，模型組小鼠水平活動和垂直活動次數(shù)明顯減少（P＜0.05），游泳不動時間明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，三生合歡飲低、中劑量組小鼠自主活動次數(shù)顯著增加（P＜0.01），低劑量組小鼠游泳不動時間明顯減少（P＜0.05），見表3。

3.4 三生合歡飲對抑郁模型小鼠腦內(nèi)多巴胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響模型組DA遞質(zhì)含量顯著少于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，三生合歡飲低劑量組DA含量有明顯提高（P＜0.05）。見表4。

表3 三生合歡飲對抑郁模型小鼠游泳不動及自主活動時間的影響（s，）

表3 三生合歡飲對抑郁模型小鼠游泳不動及自主活動時間的影響（s，）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白組模型組三生合歡飲高劑量組三生合歡飲中劑量組三生合歡飲低劑量組百憂解組動物數(shù)（只）10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）--2.96 1.48 0.74 0.003游泳不動時間35.67±20.66 77.44±64.79△46.20±21.68 49.72±37.40 44.70±40.48* 25.30±17.34*自主活動248.67±43.64 207.55±46.07△235.00±59.06 251.90±45.39** 253.10±40.72** 251.30±77.56*

表4 三生合歡飲對抑郁模型小鼠腦內(nèi)多巴胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響（）

表4 三生合歡飲對抑郁模型小鼠腦內(nèi)多巴胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響（）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別空白組模型組三生合歡飲高劑量組三生合歡飲中劑量組三生合歡飲低劑量組百憂解組動物數(shù)（只）10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）--2.96 1.48 0.74 0.003 DA含量（μg/mL）1.21±0.34 1.12±0.17△0.99±0.35 1.16±0.29 1.31±0.25* 1.19±0.29

3.5 ERIC-PCR結(jié)果從圖1（封二）可見模型組小鼠ERIC-PCR指紋圖譜條帶位置、數(shù)量及豐度與空白組小鼠相比均發(fā)生變化，模型組和空白組在500bp以上處的條帶位置、數(shù)量及豐度都有較大差異，說明抑郁癥與腸道菌群相關(guān)。三生合歡飲低、中劑量組腸道菌群的構(gòu)成與空白組接近，趨于恢復(fù)正常，而高劑量組無此趨勢。研究結(jié)果表明，抑郁癥與腸道菌群存在相關(guān)性，三生合歡飲在改善小鼠抑郁癥狀的同時，能調(diào)整腸道菌群使之恢復(fù)正常，并與服用劑量有相關(guān)性。

4 討論

慢性不可預(yù)知性應(yīng)激抑郁模型的特異性高，能顯著造成抑郁，可以廣泛用于抗抑郁藥物的藥效學(xué)研究。目前，“單胺學(xué)說”依然是抑郁癥機(jī)制研究的主流觀點(diǎn)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠在經(jīng)過3周慢性不可預(yù)知性應(yīng)激之后糖水?dāng)z入量減少，強(qiáng)迫游泳水中漂浮不動時間明顯延長（P＜0.05，P＜0.01）。這些行為學(xué)結(jié)果顯示抑郁小鼠造模成功，同時模型組腦內(nèi)多巴胺含量少于空白組（P＜0.05）。給予氟西汀治療后，抑郁小鼠行為學(xué)變化得到改善。給予三生合歡飲濃縮液灌胃21天后，小鼠抑郁行為變化明顯改善，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

過去對腸道菌群結(jié)構(gòu)的認(rèn)識常采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)，但由于腸道中約占總數(shù)90%的微生物不能在體外培養(yǎng)[11]，因此不能客觀評價腸道中微生物群落的變化規(guī)律。腸道細(xì)菌基因間保守重復(fù)序列（ERIC）-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是近年來被廣泛用于菌群結(jié)構(gòu)及種群變化的一種分子生物學(xué)方法，該方法快速、簡潔、不依賴于純培養(yǎng)，可直接根據(jù)樣品ERIC條帶的分布、數(shù)量和亮度等信息去分析，靈敏度、可重復(fù)性和可靠性較好[12-13]。本研究結(jié)果從一定程度上揭示了三生合歡在改善小鼠抑郁癥狀的同時，能調(diào)整腸道菌群，為進(jìn)一步揭示三生合歡飲治療抑郁癥的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。

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（收稿：2016-06-10修回：2017-03-06）

Antidepressant Effect of Sansheng Hehuan Decoction and Its Effect on Intestinal Microflora

YANG Xu1, TANG Lan2,SHAN Weiguang2.1Phamarcy,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China；2 College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou(310014),China

Objective To investigate the Antidepressant effect of Sansheng Hehuan decoction and its effect on intestinal microflora.Methods Sixty healthy male mice were randomly divided into 6 groups:control group,model group,fluoxetine group,Sansheng Hehuan decoction groups（high,medium and low dose）.Chronic depression rat model was induced by chronic stress and isolated breeding.Weight gain,the autonomous activity,and monoamine neurotransmitter were determination on Day 21.Fecal samples wee collected in each experimental group of mice to obtain ERIC-PCR fingerprinting by ERIC-PCR techniques for analyzing intestinal microbial community structure. Results Compared with control group,model group rats'gained weight was significantly reduced after 14 days（16.22±0.80g vs 20.34±1.06g,P＜0.01）and 21 days（20.04±1.62g vs 22.71±1.35g,P＜0.01）.Compared with model group,rats'gained weight in high dose Sansheng Hehuan decoction group was significantly higher on Day 14 and 21（Day 14:17.93±0.94g;Day 21:22.58±2.15g,P＜0.01）,as well as in fluoxetine group（Day 14:17.16±0.93g;Day21:20.97±2.89g,P＜0.01）.Compared with control group,model group mice had significantly lower sugar water consumption on Day 14 and 21（Day 14:2.75±1.01mL vs 3.94±0.08mL,P＜0.01;Day 21:2.05±0.76mL vs 2.62± 0.56mL,P＜0.01）;compared with model group,sugar water consumption of mice in high dose,middle dose,low dose Sansheng Hehuan decoction group mice increased significantly on Day 21（3.66±1.05mL,3.10±0.70mL,3.10± 0.70mL,P＜0.01）and that in fluoxertine hydrochloride group also increased significantly（3.34±1.84,P＜0.05）.Compared with control group,the number of horizontal and vertical activities of model group mice decreased significantly（207.55±46.07/s vs 248.67±43.64/s,P＜0.05）,but the motionless time in forced-swimming test of model group increased（77.44±64.79/s vs 35.67±20.66/s）;compared with model group,the number of autonomic activities of mice in low,medium dose Sansheng Hehuan decoction group increased significantly（253.10±40.72/s and 251.90±45.39, P＜0.01).Compared with control group（1.21±0.34μg/mL）,DA transmitters of model group was significantly lower（1.12±0.17μg/mL,P＜0.05）;compared with model group,DA transmitters of low dose Sansheng Hehuan decoction group was increased（1.31±0.25μg/mL,P＜0.05）.ERIC-PCR fingerprinting showed significant differences in the location and quantity of ERIC fragments with sizes above 500 bp between control and model groups and no difference between control and low and medium dose Sansheng Hehuan decoction groups.Conclusion Sansheng Heuan decoction exerts some ntidepressant effect by improving the intestinal microflora.

Mice;Depression;Animal Model;Sansheng Hehuan decoction;Antidepressant;Behavior;Intestinal microflora

浙江省重大科技專項重點(diǎn)社會發(fā)展項目（No.2010C13015）

1浙江省立同德醫(yī)院藥劑科（杭州3100122）；2浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院（杭州310014）

單偉光，Tel：0571-88320554；E-mail：swg@zjut.edu.cn