陳柳霓，李笑寒，田平芳(北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100029)

大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌的共培養(yǎng)研究

陳柳霓，李笑寒，田平芳
(北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100029)

為研究大腸桿菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)混菌體系，構(gòu)建了基于抗生素篩選的2株重組菌。將攜帶卡那霉素抗性基因的載體pET-28a轉(zhuǎn)化到肺炎克雷伯氏菌中，獲得重組菌K．pneumoniae(pET-28a);將攜帶氯霉素抗性基因cm的重組載體pET-cm(卡那霉素和氯霉素雙抗性載體)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，獲得重組菌E．coli(pET-cm)，在卡那霉素抗性培養(yǎng)基中單獨培養(yǎng)及混合培養(yǎng)上述兩株重組菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn):單獨培養(yǎng)條件下，E．coli與K．pneumoniae的相對菌體密度為57.87%;混合培養(yǎng)條件下，E．coli與K．pneumoniae的相對菌體密度為1.94%;E．coli和K．pneumoniae相對于各自單獨培養(yǎng)的存活率分別為2.57%和76.60%。上述結(jié)果表明，K.pneumoniae為混菌體系的優(yōu)勢菌，可強烈抑制E．coli的生長。

大腸桿菌;肺炎克雷伯氏菌;混合培養(yǎng);相對密度;氯霉素;卡那霉素

微生物合成目標(biāo)產(chǎn)物通常涉及多酶催化反應(yīng)。一般多在單菌中超表達多個酶基因，其載體構(gòu)建難度大且菌體代謝負荷重。相比之下，混菌體系可將代謝途徑分?jǐn)偨o不同的菌，即一種菌的產(chǎn)物為另一種菌的底物，避免了單菌承載太長的代謝途徑［1－2］。近年來，混菌體系已用于化工原料生產(chǎn)等方面［1－2］。例如，在酵母和梭狀芽孢桿菌混菌體系中，梭狀芽孢桿菌將纖維素轉(zhuǎn)化為單糖，酵母將單糖轉(zhuǎn)化為乙醇［3］。將達到相對穩(wěn)態(tài)的混菌體系稱為頂級群落(climax community)，其種間的代謝流分配趨于穩(wěn)定［4］。

通過遺傳改造實現(xiàn)菌間互利共生是構(gòu)建人工混菌體系的目標(biāo)。E．coli遺傳背景清晰，作為宿主菌已廣泛用于化學(xué)品生產(chǎn)［5－6］。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)雖非模式生物，但能天然合成一系列大宗重要化學(xué)品，包括3-羥基丙酸［7］、1，3-丙二醇［8］及2，3-丁二醇［9］，因此成為當(dāng)前工業(yè)微生物的研究熱點。

本文中，筆者首先構(gòu)建攜帶不同抗性的重組大腸桿菌(E．coli)和肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)，然后在碳源充足情況下進行單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，考察兩種菌之間的關(guān)系，以期為建立混菌體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

E．coli BL21和K．pneumoniae DSM 2026保存于筆者所在實驗室。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取和PCR產(chǎn)物回收試劑盒，博邁德生物技術(shù)有限公司。DNA測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

LB液體培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5，NaCl 10，蛋白胨10;pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基:向LB液體培養(yǎng)基中加入1.5 g/L瓊脂。

卡那霉素抗性培養(yǎng)基:向LB液體培養(yǎng)基中加入50μg/mL卡那霉素。

氯霉素抗性培養(yǎng)基:向LB液體培養(yǎng)基中加入170μg/mL氯霉素。

1.2 方法

總體思路如圖1所示。首先構(gòu)建兩株重組菌，在試管中單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)大腸桿菌與肺炎克雷伯氏菌，按相等菌量(以O(shè)D600計算)涂布于氯霉素抗性和卡那霉素抗性LB平板，統(tǒng)計菌落數(shù)。在液體培養(yǎng)基中進行單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)24 h，每3 h用紫外分光光度計測定菌體量，繪制生長曲線。

1.2.1 重組菌的構(gòu)建

1)氯霉素抗性基因cm的克隆。根據(jù)GenBank公布的氯霉素抗性基因cm的序列設(shè)計引物，以實驗室保藏cm質(zhì)粒為模板，將帶有氯霉素啟動子等元件的cm表達框完整地克隆出來。上游引物引入酶切位點SacⅠ，下游引物引入SalⅠ。上游引物: 5'-TCCGAGCTCCAATAAACCGGTAAACCAG-3';下游引物:5'-GACGTCGACAGCTGATAGAAACAGAAGC-3'(下劃線序列為酶切位點)。PCR反應(yīng)體系: ddH2O 8.8μL，模板0.4μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，2×PCR mix 10μL;總體積20μL。PCR反應(yīng)參數(shù):94℃變性3 min;94℃1 min，55℃40 s，72℃1 min，共30個循環(huán);72℃10 min;即得到cm基因表達框，16℃保存。

圖1 實驗流程示意Fig.1 Schematic diagram of this study

2)載體pET-cm的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化。基因cm和載體pET-28a經(jīng)過雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化E.coli BL21，用菌落PCR及質(zhì)粒雙酶切鑒定。將空質(zhì)粒pET-28a電擊轉(zhuǎn)化K.pneumoniae DSM 2026感受態(tài)細胞，獲得攜帶卡那霉素抗性的肺炎克雷伯氏菌K. pneumoniae(pET-28a)。由此獲得同時攜帶氯霉素和卡那霉素抗性的重組菌E.coli(pET-cm)和單獨攜帶卡那霉素抗性的肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae (pET-28a)。

1.2.2 重組菌的培養(yǎng)

菌種復(fù)蘇培養(yǎng)于15 mm×150 mm試管，內(nèi)裝4 mL LB培養(yǎng)基，接種量1%(體積分?jǐn)?shù))，在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。將兩種重組菌按1%接種量單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，每隔3 h測OD600。

將重組大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌進行單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，按1%的接種量接種于4 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)11 h，測OD600。根據(jù)計算結(jié)果，用相等菌量菌涂布平板，過夜倒置培養(yǎng)于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，統(tǒng)計菌落數(shù)。1.2.3菌體生物量及菌落數(shù)分析測定

采用比濁法測定菌體生物量。將過夜培養(yǎng)的原菌液稀釋10倍，用分光光度計測OD600。據(jù)此計算單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)涂布時所需的菌體量。

涂布時，將原菌液分別稀釋106、107、108倍，培養(yǎng)15 h后統(tǒng)計菌落數(shù)。單獨培養(yǎng)中，大腸桿菌涂于卡那霉素抗性平板，計數(shù);肺炎克雷伯氏菌涂于卡那霉素抗性平板，計數(shù)?；旌暇缘染w量分別涂于氯霉素抗性平板和卡那霉素抗性平板，計數(shù)。

圖2 重組質(zhì)粒示意圖與基因克隆電泳圖Fig.2 Schematic diagram of vector construction and validation by PCR and electrophoresis

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌E．coli(pET-cm)和K．pneumoniae

(pET-28a)的構(gòu)建

載體構(gòu)建及cm基因的PCR擴增驗證結(jié)果見圖2。由圖2可知:PCR擴增能夠得到cm基因條帶，為1 100 bp(圖2(c))，說明測序表明其序列正確。將重組質(zhì)粒pET-cm轉(zhuǎn)化E.coli BL21，挑取單菌落進行PCR，得到約1 400 bp的條帶(圖2(d))(引物為cm基因的上游引物和pET-28a的通用下游引物)，提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證(圖2(e)泳道3)，表明重組質(zhì)粒pET-cm已轉(zhuǎn)化至E．coli BL21。將空質(zhì)粒pET-28a電擊轉(zhuǎn)化K．pneumoniae，復(fù)蘇后涂布于卡那霉素抗性平板，培養(yǎng)24 h后挑取單菌落，利用pET-28a質(zhì)粒的通用引物進行菌落PCR鑒定，表明pET-28a已轉(zhuǎn)化至K．pneumoniae。

2.2 生物量測定

將重組菌單獨及混合培養(yǎng)于含抗生素的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)，24 h后測定生物量，結(jié)果見圖3。由圖3可知，K．p (kana)和E．coli(kana)分別為重組肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌在卡那霉素抗性培養(yǎng)基生長良好。在相同培養(yǎng)條件下，肺炎克雷伯氏菌的生長明顯快于大腸桿菌。但在混合培養(yǎng)條件下，這兩種的生物量均低于單獨培養(yǎng)K．pneumoniae的生物量，但都高于單獨培養(yǎng)E．coli的生物量，表明兩菌存在生長競爭。

2.3 單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的菌落數(shù)

將兩株重組菌分別單獨培養(yǎng)與混合培養(yǎng)于4 mL卡那霉素抗性培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)11 h后測OD600，據(jù)此計算涂布所需的菌量，結(jié)果見表1。由表1可知:由于重組大腸桿菌中的質(zhì)粒負擔(dān)要大于肺炎克雷伯氏菌，因此大腸桿菌的生長慢于肺炎克雷伯氏菌。即使排除質(zhì)粒干擾，大腸桿菌自身的生長也慢于肺炎克雷伯氏菌。

圖3 重組菌的生物量Fig.3 Shake flask cultivation of the recombinant strains

表1 涂布過程參數(shù)Table 1 Parameters for bacterial inoculation

因此，考察單獨培養(yǎng)與混合培養(yǎng)的生長菌活數(shù)，以確定不同抗生素對單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的抑菌效果。按不同稀釋倍數(shù)涂布后，于37℃恒溫倒置培養(yǎng)15 h，統(tǒng)計菌落數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 單獨培養(yǎng)與混合培養(yǎng)的菌落數(shù)Table 2 The colony number in separate culture and mixed culture

由表1與表2可知:在單獨培養(yǎng)的條件下，K．pneumoniae(pET-28a)的單菌落數(shù)明顯多于E．coli (pET-cm)，在一定程度上說明，K．pneumoniae的生長速度快于E.coli，兩種菌雖然具有一定同源性，推測其代謝途徑與代謝能力各不相同，導(dǎo)致其自身生長中存在較大差異。

之后計算兩種菌混合培養(yǎng)相對于單獨培養(yǎng)的存活率，結(jié)果見表3。

由表3可知:在梯度稀釋106倍時，E．coli(pET-cm)的存活率明顯低于K．pneumoniae(pET-28a)。同源性較高的兩種菌在混合培養(yǎng)中存活率表現(xiàn)出了明顯的差異性，由此可以推測，大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌在培養(yǎng)中存在相互抑制或者相互競爭的關(guān)系。在現(xiàn)實工業(yè)生產(chǎn)中，若想實現(xiàn)這兩種微生物的混合培養(yǎng)，勢必還要進行相應(yīng)研究。后續(xù)將探究重組菌的相對菌體密度。

表3 混合培養(yǎng)中重組菌存活率Table 3 Survival rate of recombinant strains in mixed culture

以肺炎克雷伯氏菌為100%，考察大腸桿菌單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)對于肺炎克雷伯氏菌的相對菌體密度的影響，結(jié)果見表4。

表4 重組菌的相對菌體密度Table 4 Relative density of recombinant strains

由表4可知:在單獨培養(yǎng)條件下，大腸桿菌的生長速度慢于肺炎克雷伯氏菌，推測是由于不同菌之間代謝的差異性導(dǎo)致;在混合培養(yǎng)時，大腸桿菌的生長情況證明了兩種菌在生長中存在相互抑制關(guān)系，其中抑制關(guān)系使得大腸桿菌生長速度變慢，使肺炎克雷伯氏菌為混菌體系中的優(yōu)勢菌。在之后的研究中可利用這種天然的生長優(yōu)勢來達到混合培養(yǎng)過程中對于兩種菌生物量的調(diào)控，也可對兩種菌進行代謝流的探究與改造，以期實現(xiàn)兩種菌的互利共生。

重復(fù)進行試驗，測定不同抗性條件下的單獨培養(yǎng)及混合培養(yǎng)條件下的菌落數(shù)量，結(jié)果見圖4。

圖4 重組菌的菌落數(shù)Fig.4 Colony numbers of the recombinant strains

由圖4可知:就單獨培養(yǎng)而言，肺炎克雷伯氏菌具有生長優(yōu)勢，生物量明顯要大于大腸桿菌，生長速度快，說明肺炎克雷伯氏菌具有工業(yè)應(yīng)用的潛力。但由于對其研究有限，要想成為工業(yè)化生產(chǎn)的宿主菌，還需要經(jīng)過后續(xù)一系列研究。在混合培養(yǎng)中，這兩種菌的生長均低于單獨培養(yǎng)，證明兩種菌的生長均受到抑制，表明存在競爭關(guān)系，如何改造或者利用這種關(guān)系有待進一步研究。

雖然肺炎克雷伯氏菌具有莢膜毒性，但其代謝甘油能力很強［10］，生長速度快，從生物量來看非常適合用作表達宿主。實驗表明，肺炎克雷伯氏菌的生長明顯快于大腸桿菌。由于肺炎克雷伯氏菌能自身產(chǎn)生輔酶B12［11］，無需在培養(yǎng)基中額外添加B12，因此，它比大腸桿菌具有明顯成本優(yōu)勢。

后期研究可致力混菌培養(yǎng)?；炀囵B(yǎng)可發(fā)揮不同菌的優(yōu)勢，但需進行相對密度控制策略:①針對混菌體系代謝途徑的特點，借助動態(tài)控制的代謝模擬手段，如(COBRA工具箱)［12］，模擬菌種代謝流平衡體系，實現(xiàn)菌體相對密度的動態(tài)優(yōu)化;②重構(gòu)兩菌的群體感應(yīng)(quorum sensing)，實現(xiàn)兩菌生長速度的相互制約［13－14］;③構(gòu)建兩菌內(nèi)部的基因回路，包括雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)［15］和基于共有代謝物的生物量控制裝置［16］，從而動態(tài)調(diào)控兩菌的代謝流量分配。因為合成生物學(xué)不僅能實現(xiàn)單菌基因表達的自動化和智能化，而且有望改變不同菌的種間關(guān)系(interspecific relationship)。因此，有望將大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌之間的抑制關(guān)系改為互利共生，從而發(fā)揮各自優(yōu)勢，拓寬發(fā)酵底物和產(chǎn)物的范圍。

3 結(jié)論

1)克隆了E.coli的cm抗性基因，構(gòu)建了攜帶不同抗性的重組大腸桿菌E.coli(pET-cm)和肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae(pET-28a);

2)研究了兩種菌的存活率和相對菌落數(shù)，結(jié)果表明，混菌體系中大腸桿菌比肺炎克雷伯氏菌受抑制程度更大，肺炎克雷伯氏菌為混菌體系的優(yōu)勢菌。該研究也為食品微生物防控提供了依據(jù)。

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(責(zé)任編輯荀志金)

Co-culture of Escherichiacoli and Klebsiella pneumoniae

CHEN Liuni，LI Xiaohan，TIAN Pingfang
(College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China)

To study the co-culture of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae，we constructed distinguishable recombinant strains by recruiting distinct resistance genes.Briefly，the vector pET-28a harboring kanamycin resistance gene(Kanr)was transformed into K．pneumoniae，leading to recombinant strain K．pneumoniae(pET-28a)．The vector pET-cm harboring both Kanrand chloramphenicol resistance gene(cm)was transformed into E．coli，resulting in recombinant strain E．coli(pET-cm)．The two recombinant strains were subjected to monoculture and co-culture．Under monoculture conditions，the relative density between E．coli(pET-cm)and K．pneumoniae(pET-28a)was 57.87%，whereas it was only 1.94%under co-culture conditions．More interestingly，the relative survival rates of E．coli and K．pneumoniae under co-culture conditions were 2.57%and 76.60%，respectively，compared with that of monoculture conditions．Overallthese results indicate that K．pneumoniae(pET-28a)was the predominant species and strongly inhibited the growth of E．coli(pET-cm)．

Escherichia coli;Klebsiella pneumoniae;co-culture;relative density;choramphenicol;kanamycin

Q81

A

1672－3678(2017)04－0034－06

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.006

2017－06－09

國家自然科學(xué)基金(21276014、21476011);國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2015AA021003)

陳柳霓(1992—)，女，重慶涪陵人，研究方向:微生物代謝工程;田平芳(聯(lián)系人)，教授，E-mail:tianpf@mail．buct．edu．cn