秦 娜 李廣波 郭樹霞 張曉娟

(1.鄭州人民醫(yī)院血液內(nèi)科，鄭州 450003; 2.鄭州市兒童醫(yī)院腎臟風濕科，鄭州 450003)

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MicroRNA-221(miR-221)抑制p27Kip1蛋白促進慢性粒細胞白血病的發(fā)生

秦 娜1*李廣波2郭樹霞1張曉娟1

(1.鄭州人民醫(yī)院血液內(nèi)科，鄭州 450003; 2.鄭州市兒童醫(yī)院腎臟風濕科，鄭州 450003)

目的 探討microRNA-221(miR-221)與慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leuklemia， CML)的相關性及其作用機制。方法 采用熒光實時定量PCR(quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測35例CML病人與25例對照組病人骨髓中miR-221的表達情況。K562細胞轉(zhuǎn)染miR-221模擬物和miR-221抑制劑48 h，qRT-PCR法檢測miR-221的表達。分別用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后的K562細胞增生能力，利用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后K562細胞周期和凋亡。利用數(shù)據(jù)庫預測miR-221的調(diào)節(jié)基因為p27Kip1。qRT-PCR和Western blotting法檢測miR-221對p27Kip1的mRNA和蛋白的表達的影響。結(jié)果 CML病人組miR-221表達明顯高于對照組。轉(zhuǎn)染miR-221抑制劑組K562細胞凋亡比例顯著升高，細胞周期阻滯于G2SM期，細胞增生能力明顯受到抑制。而miR-221過表達則明顯促進了K562細胞的增生和細胞周期進程。抑制miR-221表達后K562細胞中p27Kip1蛋白表達顯著升高，而當miR-221過表達后p27Kip1表達也隨之明顯降低。結(jié)論 miR-221在CML病人的骨髓中高表達，并抑制下游p27Kip1蛋白的表達從而促進白血病K562細胞增生，促進細胞進入細胞周期，可能是CML發(fā)生、發(fā)展的一個潛在靶點。

慢性粒細胞白血??；miR-221；K562細胞；p27Kip1

慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia， CML)，是造血干細胞異常增生形成的疾病。約占成人白血病的20%，慢性粒細胞白血病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率為1～2/10萬人。MicroRNAs(miRNAs)是長度約20～24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶基因的3′-UTRs相互作用，導致靶 mRNA降解或抑制其翻譯，參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNAs可以表達在多種腫瘤中，調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因或癌基因[1]。先前有研究[2]顯示miR-221在急性粒細胞白血病的病人血漿中表達升高，但是miR221在CML病人中的表達及其作用尚少研究。本研究中，為了探討了miR-221在CML的發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機制，檢測了miR-221在CML病人中和骨髓非增生性對照組人群中的表達水平，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本的收集

本研究以2011年至2016年5年間鄭州人民醫(yī)院血液科及門診收治的慢性粒細胞白血病病人為研究對象，收集其骨髓樣本，其中慢性粒白血病慢性期(CML-CP)21例，慢性粒白血病急性期(CML-BP)14例，男性病人21例(14～45歲)，女性病人14例，年齡19～49歲，中位年齡39歲，所有病人的診斷均符合《血液病診斷及療效標準》第3版[3]中的診斷標準。以同期骨髓非增生性疾病作為對照，包括血小板減少癥11例，缺鐵性貧血14例，年齡22～66歲，中位年齡42歲。本研究已獲得倫理委員會批準，所有病人知情同意。

1.2 熒光實時定量PCR(quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測miR-221的表達

用人外周血淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司)分離骨髓細胞中單個核細胞，利用Trizol(Invitrogen公司，美國)法提取骨髓單個核細胞中的總RNA，通過檢測A260/A280比值來檢測RNA質(zhì)量，選取在1.8～2.0的RNA樣本，反轉(zhuǎn)錄并利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測樣本中miR-221的表達情況，Mir-XTMmiRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Mir-XTMmiRNA qRT-PCR試劑盒均購自于Takara公司，按照說明書指示操作(Takara公司，日本)，U6作為內(nèi)參進行相對定量，U6和has-miR-221由廣州銳博公司合成，miR-221上游引物為5′-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3′， 下游通用引物由試劑盒提供。U6上游引物為5′-CTCGCTT-CGGCAGCACA-3′， 下游引物為5′-AACGC-TTCACGAATTTGCGT-3′。所有的樣本做3個重復孔，Real-time PCR-iQ5 檢測儀 (Bio-Rad公司，美國)檢測，結(jié)果用基因表達的變化通過相對CT的方法進行測定。實驗結(jié)果用倍數(shù)變化(fold changes)表示，倍數(shù)變化為2-△△CT。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

白血病細胞系K562購自中科院上海藥物所細胞庫，用含10%(體積分數(shù))：胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，在37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期K562細胞以2×105/mL濃度接種到24孔板中，無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，轉(zhuǎn)染miR-221 模擬物 (50 nmol/L)， 和miR-221抑制劑 (100 nmol/L)，以及轉(zhuǎn)入無義序列作為陰性對照(negative control，NC)，加入Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司， 美國)轉(zhuǎn)染試劑，按試劑盒操作說明進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后qRT-PCR檢測各組細胞中miR-221的表達情況。miR-221 模擬物(mimics)，miR-221抑制劑(inhibitor)和無義序列均購自廣州銳博公司，序列設計如下: miR-221 模擬物: 5′-AGC UAC AUU GUC UGC UGG GUUUC-3′； miR-221 抑制劑: 5′-GAA ACC CAG TCT CAA TGT AGC TCC GGA AAC CCA GTC TCA ATG TAGCT-3′；無義序列:5′-UCU ACU CUU UCU AGG AGG UUG UGA-3′。

1.4 MTT檢測miR-221對K562細胞增生的影響

取對數(shù)生長期K562細胞，將細胞濃度調(diào)整為5×104/mL，接種到96孔板中，每個孔接種100 μL，每組5個重復孔，將接種好的細胞置于37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞濃度達到50%左右，每個組細胞分別加入miR-221 mimic，miR-221 inhibitor和無義序列轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染后24， 48， 72 和 96 h時每孔分別加入20 μL MTT(0.005 g/L公司)(上海，碧云天公司)，37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，2 000 r/min 離心5 min，去掉上清，每孔加入150 μL DMSO(二甲基亞砜，Sigma公司，美國)，輕輕震蕩使紫色的甲臢完全溶解。在570 nm 波長下測吸光度值?？瞻讓φ照{(diào)零，并用酶標儀(infinite 200，瑞士Tecan公司)測定570nm波長處吸光度值(A)。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡

細胞轉(zhuǎn)染miR-221 模擬物(mimics)，miR-221抑制劑(inhibitor)和陰性對照48 h，每組收集1×106個細胞，PBS 洗滌2次，棄凈上清。細胞周期檢測時每個樣本加70%(體積分數(shù))乙醇(-20 ℃預冷)固定，置于-20 ℃過夜，然后細胞用預冷的PBS洗2次，RNase(50 μg/mL)(上海勵瑞生物科技有限公司)孵育15 min，之后每個樣本加(propidium iodide，PI) (50 μg/mL) 孵育30 min。染色后的細胞用流式細胞儀檢測(Arial， 美國BD公司，)。細胞凋亡實驗按照凋亡檢測試劑盒說明書操作(BD公司，美國)，每組收集l×106個細胞，PBS 洗滌2次，棄凈上清，進行細胞凋亡檢測，每組加100 μL binding buffer重懸細胞，加入Annexin與PI 各5 μL，輕輕打勻，避光室溫放置15 min，加入1 mL的binding buffer洗滌1次，1 400 r/min，400 g，5 min。洗滌后加入400 μL binding buffer后流式細胞儀檢測平均熒光強度。

1.6 熒光實時定量PCR(qRT-PCR)法檢測p27Kip1的表達

兩步法RT-PCR專用試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit(RR037A)購自于Takara(Takara公司，日本)，按照說明書指示操作。p27Kip1上游引物：5′-GACTTGGAGAAGCACTGCAGAGA-3′；下游引物：5′-TGCCACTCGTACTTGCCCTC-3′。GAPDH為內(nèi)參，上游引物：5′-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3′；下游引物: 5′-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3′。所有的樣本做3個重復孔，Real-time PCR-iQ5 檢測儀 (Bio-Rad公司，美國)檢測，結(jié)果用基因表達的變化通過相對CT的方法進行測定。實驗結(jié)果用倍數(shù)變化(fold changes)表示，位數(shù)變化為2-△△CT。

1.7 Western blotting 法檢測p27Kip1蛋白的表達

細胞轉(zhuǎn)染miR-221 模擬物(mimics)，miR-221抑制劑(inhibitor)和陰性對照48 h，每組收集1×106個細胞，PBS 洗滌2次，棄上清。加入300 μL裂解液，靜置5 min后收集細胞，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮藍(上海美吉生物醫(yī)藥有限公司)測定總蛋白濃度。取40 μg蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至PVDF膜，5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉封閉非特異性抗原，1∶200稀釋的抗p27Kip1單克隆抗體，1∶200稀釋的山羊抗人β-actin作為陽性對照。4 ℃過夜，用含0.1%(體積分數(shù)) Tween 20的TBS洗膜后，加入辣根過氧物酶體標記的第二抗體，37 ℃作用1 h，洗膜后DAB顯色。條帶結(jié)果進行吸光度值分析，將p27Kip1與β-actin比值作為蛋白質(zhì)表達水平的參數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 miR-221在CML病人中的表達顯著升高

qRT-PCR法測定miR-221在對照病人和CML病人中的含量，CML病人骨髓中的miR-221的mRNA水平顯著高于對照組(4.667±1.169vs1.183±0.730，P<0.05)(圖1)。

圖1 miR-221在慢性粒細胞白血病的骨髓細胞中表達增加

*P<0.05vsControl group; miR-221 was detected by qRT-PCR in control group (n=25) and CML patients (n=35). The results were showed as mean ± SE; CML: chronic myeloid leukemia.

2.2 K562細胞轉(zhuǎn)染后miR-221的表達顯著增加

細胞轉(zhuǎn)染miR-221 模擬物(mimics)和miR-221抑制劑(inhibitor)48 h后，轉(zhuǎn)染無義序列的為陰性對照組。Trizol法提取細胞RNA，進行反轉(zhuǎn)錄并檢測熒光定量PCR，結(jié)果利用Prism 軟件進行單因素方差分析(one-way AVOVA)和Tukey多重比較法(Tukey’s Multiple Comparison Test)進行分析，結(jié)果顯示，K562細胞轉(zhuǎn)染miR-221模擬物的miR-221表達水平高于miR-221抑制劑組和陰性對照組(587.000±5.598vs0.240±0.040，P<0.05; 587.000±5.598vs1.000±0.001，P<0.05)(圖2)。

圖2 miR-221在轉(zhuǎn)染K562細胞中的表達

K562 cells were transfected with miR-221 inhibitor， mimic and negative control for 48 h， miR-221 expression was detected by QRT-PCR. Expression depicted as mean ± SE of experiments performed in triplicate.n=3，*P<0.05vsNC; NC: negative control.

2.3 miR-221表達抑制K562細胞凋亡和誘導細胞進入細胞周期

K562細胞轉(zhuǎn)染48h后，流式細胞儀檢測miR-221模擬物組，miR-221抑制劑組和陰性對照組細胞的凋亡和細胞周期，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-221抑制劑的K562細胞凋亡率顯著增加(20.570±2.103vs43.570±4.412，P<0.05)，而結(jié)果轉(zhuǎn)染miR-221模擬物的K562細胞凋亡率則明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(20.570±2.103vs9.857±1.883， P<0.05)，miR-221的過表達抑制了細胞凋亡。細胞周期結(jié)果顯示，與陰性對照組和轉(zhuǎn)染了miR-221模擬物組比較，轉(zhuǎn)染miR-221抑制劑的K562細胞G0G1期比例顯著升高(79.830±3.514vs63.870±2.503，P<0.05；79.830±3.514vs53.470±2.732，P<0.05)，G2SM期細胞顯著降低(18.570±0.908vs34.750±1.021，P<0.05；18.570±0.908vs42.870±1.007，P<0.05)，miR-221表達增加促進了細胞由G1期向G2SM期轉(zhuǎn)化，而抑制miR-221的表達則產(chǎn)生細胞周期阻滯(圖3)。

圖3 miR-221過表達抑制K562細胞凋亡和促進細胞進入細胞周期

A: a representative gating strategy for apoptosis was analyzed by flow cytometry; B: The frequency of the apoptosis cells in miR-221 mimic， miR-221 inhibitor transfected group and NC group. C: The frequency of the cells in G0G1 phase or in G2SM phase. Expression depicted as mean ± SE，n=5，*P<0.05vsNC;NC:negative control.

2.4 miR-221增加K562細胞增生力

細細胞轉(zhuǎn)染miR-221模擬物(mimics)和miR-221抑制劑(inhibitor)48 h后，轉(zhuǎn)染無義序列的為陰性對照組。在24、48、72、96 h后MTT法分別測定細胞的增生情況，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染48，72，96h后，轉(zhuǎn)染miR-221模擬物K562細胞與陰性對照相比，增生能力明顯增加(0.602±0.017vs0.720±0.007，P<0.05)，而抑制miR-221表達后，與陰性對照組相比K562細胞增生能力即受到了抑制(0.602±0.017vs0.456±0.015，P<0.05)(圖4)。

2.5 miR-221抑制K562細胞p27Kip1蛋白的表達

收集轉(zhuǎn)染后的細胞，在mRNA和蛋白水平檢測miR-221過表達或抑制后p27Kip1的表達變化。過表達miR-221和抑制miR-221的表達對p27Kip1的mRNA影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05， 圖5A)，而miR-221高表達的K562細胞，p27Kip1蛋白水平明顯降低。而抑制了miR-221表達的細胞p27Kip1蛋白水平則明顯增加。

圖4 miR-221過表達促進K562細胞增生

A: absorbance; NC:negative control； K562 cells were transfected with miR-221 inhibitor， mimic and negative control for 24， 48， 72 and 96 h， and the cell viability was measured by MTT Assay.*P<0.05vsnegative control at the same time point.

圖5 miR-221過表達對p27Kip1表達的影響

p27Kip1expression was detected by qRT-PCR (A) and Western blotting (B). Expression depicted as mean ± SE，n=3， *P<0.05vsControl group； qRT-PCR：quantificational real-time polymerase chain reaction.

3 討論

有研究[4]顯示miR-221的作用類似癌基因，在多種癌癥中表達上調(diào)，包括肝癌、前列腺腺癌、結(jié)直腸癌等，可以促進細胞的增生，增加癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力。本研究的實驗結(jié)果顯示，CML病人骨髓樣本中miR-221表達水平顯著高于對照組人群，先前的研究顯示，miR-221在多種實體腫瘤中表達增加并促進癌細胞的生長，包括膠質(zhì)母細胞瘤、肝癌、胰腺癌細胞等，提示miR-221可能是一個促癌基因，在CML發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。Rong等[5]報道m(xù)iR-221在原發(fā)性肝細胞癌組織中表達升高，并促進肝癌細胞生長和抑制細胞凋亡。本研究利用白血病細胞系K562，細胞轉(zhuǎn)染miR-221模擬物(mimic)和miR-221抑制劑(inhibitor)使miR-221在細胞系中表達增加或降低，實驗結(jié)果顯示，miR-221模擬物(mimics)組的K562細胞miR-221表達水平顯著高于miR-221抑制劑組和轉(zhuǎn)染陰性對照組，轉(zhuǎn)染miR-221抑制劑組K562細胞細胞凋亡比例顯著升高，細胞周期阻滯于G2SM期，細胞增生能力明顯受到抑制。而轉(zhuǎn)染了miR-221模擬物的K562細胞則明顯促進了K562細胞的增生，促進細胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)化。實驗結(jié)果表明miRNA-221的過表達對白血病細胞系有明顯的促進作用，提示其影響CML的病人病程發(fā)展。

p27Kip1基因是Cip/Kip 細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(cyclin-dependent kinase inhibitors，CKI)家族中的一員，它可以通過與CDK2和cyclin結(jié)合阻止細胞通過G1/S期從而抑制細胞增生。p27Kip1可以作為一個腫瘤抑制因子在慢性粒細胞白血病中也有廣泛報道。先前的研究[6]顯示，在慢性粒細胞白血病中，BCR-ABL融合蛋白通過磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase, PI3K)途徑誘導Skp2的表達，促進蛋白酶降解泛素化的p27Kip1，降低p27Kip1表達，從而促進了慢性粒細胞白血病的發(fā)生、發(fā)展。p27Kip1也是格列衛(wèi)作用于CML的一個重要靶點[7]，促進細胞周期阻滯，降低癌癥細胞存活。近年來也有研究[8]顯示BCR-ABL1也可以通過改變p27Kip1在細胞中的分布，使其從細胞核中轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中，很可能是Bcr-Ab1酪氨酸激酶抑制劑在臨床上耐藥性的一個重要機制。本研究利用生物信息學手段預測miR-221的下游靶基因，發(fā)現(xiàn)其中p27Kip1在腫瘤及CML中有廣泛研究，預測miR-221很可能是通過調(diào)節(jié)下游p27Kip1從而促進K562細胞的增生和進入細胞周期。實驗結(jié)果顯示，過表達miR-221和抑制miR-221的表達對p27Kip1的mRNA影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05， 圖5A)，說明了miR-221并不在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)p27Kip1的表達，隨后的Western blotting法分析證實，轉(zhuǎn)染了miR-221的K562細胞中p27Kip1蛋白水平顯著下調(diào)，而抑制miR-221的表達則會促進p27Kip1的表達，進一步提示p27Kip1是miR-221的一個重要的下游調(diào)節(jié)蛋白，miR-221對p27Kip1的調(diào)節(jié)是在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生。

CML疾病由復雜的網(wǎng)絡調(diào)控機制調(diào)節(jié)，研究[9]顯示，miR-221可以通過p53-puma途徑調(diào)節(jié)細胞的凋亡。miR-221還可以通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NFκB)或PTEN/Akt 信號通路促進腫瘤細胞的增生和侵襲[10]。先前的研究顯示，腫瘤中MAPK信號通路級聯(lián)反應是一個重要的機制。在慢性粒細胞白血病中，BCR-ABL融合蛋白酪氨酸177磷酸化，進一步促進RAF激酶的激活。激活Raf通過絲蘇氨酸激酶MEK1和MEK2和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MAPK)啟動信號級聯(lián)反應，最終導致基因轉(zhuǎn)錄的激活[11]。miRNA 通過結(jié)合互補的靶基因的3′非編碼區(qū)序列，從而調(diào)節(jié)蛋白的表達，有效地控制信號轉(zhuǎn)導過程。前期的研究中顯示miR-221在MAPK信號通路轉(zhuǎn)導過程起到重要作用[11]。可見miR-221調(diào)節(jié)CML的發(fā)生，還可能通過其他的機制，需要更多地探索。

在本項研究中，結(jié)果提示miR-221可能作為慢性粒細胞白血病的促癌分子，miR-221在慢性粒細胞白血病病人的骨髓中表達明顯升高，提示了miR-221對慢性粒細胞白血病具有促進作用。K562細胞中過表達miR-221，可以促進細胞增生，抑制凋亡，促進細胞進入細胞周期，而抑制了miR-221的表達后則可以抑制細胞增生，促進凋亡和誘導細胞周期阻滯，miR-221對白血病細胞的促進作用很可能是通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)下游p27Kip1的表達，從而影響慢性粒細胞白血病的發(fā)展。

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編輯 慕 萌

Expression of microRNA-221 in chronic myeloid leukemia and its mechanism

Qin Na1*， Li Guangbo2， Guo shuxia1， Zhang Xiaojuan1

(1.DepartmentofHematology，People’sHospitalofZhengzhou，Zhengzhou450003，China; 2.DepartmentofRheumatismandRenalDisease，Children’sHospitalofZhengzhou，Zhengzhou450003，China)

Objective MicroRNAs (miRNAs， miRs) have emerged as critical regulators of tumor cell proliferation. This paper is to investigate how miR-221 is involved in the process of chronic myeloid leukemia (CML) and its working mechanisms.Methods Quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT (qRT-PCR) was used to measure the expression of miR-221 in CML patients and control patients. K562 cells were transfected with miR-221 mimics， inhibitors， or negative controls. MTT assay was used to determine cell viability. Flow cytometry was used to measure the cell apoptosis and cell cycle. Bioinformatics was used to predict the target gene of miR-221， the qRT-PCR and Western blot were used to determine the expression of p27Kip1expression. Results The expression of miR-221 was increased significantly in the bone marrow cells in CML patients compared with control patients. Overexpression the miR-221 significantly increased cell vitality and promoted cell proliferation and G1-to-S phase transition of the cell cycle in K562 cells， while inhibition of miR-221 rescued the results.p27Kip1is the important target gene regulated by miR-221， the inhibition of the miR-221 promoted the p27Kip1expression， while miR-221 overexpression decreased thep27Kip1expression. Conclusion Our study suggested that miR-221 may be an oncogenic miRNA by inhibiting the protein expression of p27Kip1in CML.

chronic myeloid leukemia；miR-221；K562 cells; p27Kip1

時間：2017-07-16 17∶16 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170716.1716.012.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.04.018]

R733.7

2017-02-17)

*Corresponding author， E-mail：qinna518@163.com