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        TNF—α誘導人肺鱗癌細胞發(fā)生EMT促進轉移的機制研究

        2017-08-01 14:59:57洪瓊川唐綺玲邁進
        中國當代醫(yī)藥 2017年16期
        關鍵詞:轉移

        洪瓊川 唐綺玲 邁進

        [摘要]目的 明確TNF-α引起人肺鱗癌細胞發(fā)生EMT改變并促進腫瘤細胞侵襲、轉移的潛在相關機制。方法 采用TNF-α處理后的人肺鱗癌SK-MES-1細胞,通過劃痕-愈合實驗、Transwell實驗方法檢測腫瘤細胞運動、遷移及侵襲能力,采用Western blot方法檢測細胞是否發(fā)生EMT(標志物Vimentin和E-cadherin)改變。結果 TNF-α能促進人肺鱗癌SK-MES-1細胞的運動、遷移、侵襲能力,且能使細胞發(fā)生EMT改變,上皮標志物E-cadherin降低,間充質標志物Vimentin表達升高。結論 TNF-α能夠誘導人肺鱗癌SK-MES-1細胞發(fā)生EMT改變從而具有更強的轉移能力。

        [關鍵詞]肺鱗癌;TNF-α;EMT;轉移

        [中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721(2017)06(a)-0013-04

        [Abstract]Objective To clarify the potential mechanism of TNF-α inducing human squamous cell carcinoma of lung to produce EMT changing and promoting the invasion and metastasis of carcinoma cells.Methods SK-MES-1 cells of Human lung squamous cell carcinoma treated with TNF-α,and the motion,migration and invasion ability of lung cancer cells were detected by Scratch-wound assay and Transwell chamber assay,and Western blot was performed to examine whether the cell producing EMT change or not (markers Vimentin and E-cadherin).Results TNF-α could promote the motion,migration and invasion ability of SK-MES-1 cells of Human lung squamous cell carcinoma,and could make the cell produce EMT change,the epithelial marker (E-cadherin) decreased and the expression of the mesenchymal marker (Vimentin) increased.Conclusion TNF-α can induce EMT change in squamous cell carcinoma of lung and promote metastasis.

        [Key words]Squamous cell carcinoma of lung;TNF-α;EMT;Metastasis

        肺癌是全球范圍內較為常見的惡性腫瘤類型,在我國其發(fā)生率及死亡率均位居惡性腫瘤首位。肺癌中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占80%以上,包括腺癌、鱗癌和大細胞癌等[1]。雖然現代醫(yī)療技術飛速發(fā)展,但是大多數患者在確診時已為中晚期,失去手術切除治愈的機會[2],且術后患者復發(fā)及遠處轉移率高[3],導致肺癌的治療效果差,5年生存率較低[4]。

        上皮細胞間充質轉化(EMT)的發(fā)生在腫瘤轉移中發(fā)揮重要作用,TNF-α能促進多種腫瘤的侵襲和轉移[5-6],其機制可能與EMT的發(fā)生有關,本實驗研究意在探討TNF-α對人肺鱗癌SK-MES-1細胞發(fā)生EMT及侵襲轉移能力的影響,并了解其內在可能的機制。

        1 材料與方法

        1.1 細胞的培養(yǎng)

        人肺鱗癌SK-MES-1細胞株在37℃條件下在濃度為5%的 CO2培養(yǎng)箱中放入含有胎牛血清的培養(yǎng)基中,進行傳代培養(yǎng),每周2~3次。以人肺鱗癌SK-MES-1細胞為實驗材料,TNF-α(10 ng/ml)處理組為實驗組,TNF-α(-)未處理組為對照組。

        1.2 細胞劃痕-愈合實驗觀察TNF-α(10 ng/ml)對人肺鱗癌SK-MES-1細胞的運動能力的影響

        ①實驗組:TNF-α(10 ng/ml)處理組;對照組:TNF-α(-)未處理組。

        ②常規(guī)細胞培養(yǎng),取對數生長期的細胞,接種于平板中,分別在兩組細胞的平板中利用槍頭尖(2.5 μl)輕輕劃出痕跡,然后采用標記筆將劃痕處進行標記。待使用PBS緩沖液將細胞進行沖洗后,繼續(xù)進行培養(yǎng),時間為24 h,利用倒置相差顯微鏡對劃痕處的間細胞距離進行觀察,并對細胞的運動能力進行判斷。

        1.3 Transwell實驗檢測TNF-α(10 ng/ml)干預后對人肺鱗癌SK-MES-1細胞遷徙及侵襲能力的影響

        1.3.1實驗組 TNF-α(10 ng/ml)處理組;對照組:TNF-α(-)未處理組。

        1.3.2遷移實驗 ①取對數生長期細胞,制備無血清細胞懸液,并計數為2×105/ml。每組均分別加入100 μl細胞懸液于上室,并在下室中加入500 μl濃度為10%的FBS開始培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱,時間為24 h。②將下室中的培養(yǎng)基吸去,然后采用棉簽對上室的內膠,采用PBS緩沖液進行清洗,并利用濃度為4%的多聚甲醇將其進行固定處理,結晶紫染色,倒置顯微鏡下(×100),每張膜取上、下、左、右、中 5 個視野計數連續(xù)5次進行拍照,求取平均值。

        1.3.3侵襲實驗 ①取無血清培養(yǎng)基,總量為200 μl,向其中加入50 μl Matrigel膠模仿基底膜,構建侵襲性檢測系統,混勻,4℃操作,向上室各加入60 μl;放入37℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)時間為4~5 h。②同遷移實驗步驟。

        1.4 EMT相關標志物(E-cadherin,Vimentin)的檢測

        為了明確TNF-α(10 ng/ml)對人肺鱗癌SK-MES-1細胞的標志物E-cadherin、Vimentin的影響,采用Western blot檢測TNF-α(10 ng/ml)處理人肺鱗癌SK-MES-1細胞不同時間(0、1、3、5 h)時E-cadherin,Vimentin的表達情況。

        1.4.1實驗組 TNF-α(10 ng/ml)處理組;對照組:TNF-α(-)未處理組。

        1.4.2細胞總蛋白的提取 ①將培養(yǎng)瓶中陳舊的培養(yǎng)基棄除后采用PBS緩沖液對細胞洗滌3次,并采用掛勺將細胞輕輕刮掉;②向其中加入PBS緩沖液吹打,劑量為1 ml,然后將細胞轉移至1.5 ml預冷的Ep管中,離心分離,轉速為12 000 r/min,時間為2 min;③將上清液撇去后采用細胞裂解液處理,混合均勻后放置于冰中,時間為30 min,并且需要每間隔4 min進行混合操作;④4℃ 12 000 r/min離心5 min;⑤取上清液并將其置于全新的Ep管中,并且在-80℃的恒溫冰箱中保存。

        1.4.3 BCA法蛋白定量 ①首先需要根據樣品的數量,向其中加入適量的工作液,并且將其混合均勻;②在完全溶解蛋白標準品中加入10 ml濃度為0.9%的氯化鈉溶液并將其按照100∶1比例進行稀釋,終濃度需要調整為0.5 mg/ml;③將標準品依次介入培養(yǎng)辦中,并且需要向其中加入稀釋液;④在96孔培養(yǎng)辦中添加標準品,并且需要將其進行稀釋處理,然后向其中加入BCA工作液,在37℃的條件下放置30 min;⑤在波長570 nm的條件下對各個小孔的OD值進行測定,繪制標準曲線后對各組的蛋白濃度進行準確檢測。

        1.4.4 Westen blot檢測各蛋白表達 采用Westen blot的標準檢測方法測定兩組細胞中E-cadherin、Vimentin的表達情況。(抗體:美國Cell signal公司的Vinment抗體,美國Santan Cruz公司的E-cadherin抗體,及相關的二抗IG/FITC,二抗IG/TRITC ),利用Image J軟件對各種蛋白的相對含量進行定量分析。

        1.5 統計學分析

        利用SPSS 15.0軟件,計量資料以均數±標準差(x±s)表示,兩樣本和多樣本比較分別采用t檢驗和方差分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

        2 結果

        2.1 人肺鱗癌SK-MES-1細胞劃痕試驗

        TNF-α作用細胞24 h后,TNF-α處理組中,細胞的遷移速度比對照組明顯加快(圖1)。

        2.2 Transwell實驗

        遷移實驗中,處理組和對照組細胞數分別是(257±29)、(118±14)個,組間差異有統計學意義(P<0.05);侵襲實驗中,TNF-α處理后兩組的細胞數分別為(98±5)、(61±6)個,組間差異有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

        2.3 Western blot檢測EMT相關蛋白

        Western blot檢測發(fā)現TNF-α(10 ng/ml)處理組中,上皮標志物E-cadherin降低,間充質標志物Vimentin表達升高,表明TNF-α誘導人肺鱗癌SK-MES-1細胞發(fā)生EMT變化(圖3)。

        3 討論

        肺鱗癌是最常見的惡性腫瘤之一, 在疾病晚期發(fā)生腫瘤細胞血管及淋巴結轉移的風險較高并且危險性也較為嚴重[7],在該病發(fā)展及轉移過程中存在有多種基因和多種物質因子的改變[8-9]。TNF-α是一種單核因子,分子質量為26kD的跨膜小分子蛋白,主要由單核細胞和巨噬細胞產生,屬于炎癥調節(jié)因子之一,是腫瘤微環(huán)境中重要的組成部分,多項研究表明TNF-α在炎癥、免疫、細胞穩(wěn)態(tài)及腫瘤增殖,血管形成,侵襲和轉移等進展過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。

        EMT即上皮細胞間充質轉化,上皮細胞是高度有序均一的單層細胞,其主要特點為彼此之間緊密附著,當上皮細胞轉化為間充質細胞時,則形態(tài)各異,表現出更多的遷移和侵襲能力[12]。EMT作為肺鱗癌轉移過程中的重要階段,尤其是在發(fā)生轉移現象的運動細胞的前緣的出現頻率最高[13-14],并且上皮細胞標志物丟失,故此間質細胞標志物水平升高,是惡性腫瘤患者發(fā)生遠處轉移的過程中向血管侵襲的根本條件[15-16]。

        本研究中觀察TNF-α對人肺鱗癌SK-MES-1細胞遷移及侵襲能力的影響,以期對其相關機制進行進一步了解。首先,通過細胞劃痕-愈合實驗觀察到經TNF-α作用后的人肺鱗癌SK-MES-1細胞的運動速度比對照組(未用TNF-α處理組)明顯加快;其次,通過Transwell的遷移和侵襲實驗發(fā)現,TNF-α作用細胞組的遷移和侵襲能力較對照組明顯增強(P<0.05);最后,檢測實驗組細胞EMT相關蛋白的表達量,經TNF-α作用后細胞發(fā)生EMT改變,上皮標志物E-cadherin降低,間充質標志物Vimentin表達升高,提示TNF-α可能通過誘導人肺鱗癌SK-MES-1細胞發(fā)生EMT改變而增強腫瘤細胞的運動、遷移及侵襲能力。本實驗可以從以下方面進行更進一步的研究:TWIST是調控EMT的重要轉錄因子,在乳腺癌及其他腫瘤中,也發(fā)現該因子能夠增強細胞的轉移和侵襲能力[17],且很可能與誘導細胞發(fā)生EMT有關;而TNF-α能夠上調TWIST的表達水平,借此誘導EMT發(fā)生改變,還可增強細胞的運動、轉移和侵襲能力;在該病理變化過程中,NF-κB作為關鍵性的誘導因子,能夠增強腫瘤細胞的增殖和生存能力,在其中起至關重要的作用,因而抑制NF-κB表達能夠對TNF-α的作用產生抑制效應,進而能夠減輕該因子對腫瘤細胞增殖能力的提升作用,因此,可以通過檢測NF-κB信號通路的活性、利用免疫熒光、Western blot、細胞轉染等多種實驗技術,進一步證實TNF-α可能通過激活經典的NF-κB信號通路,從而導致TWIST表達升高,進而誘導細胞發(fā)生EMT及增強細胞的轉移能力。

        肺鱗癌的發(fā)生、發(fā)展是多種因素、多種基因參與和作用的結果[18-19]。TNF-α可能通過誘導人肺鱗癌SK-MES-1細胞發(fā)生EMT改變而增強腫瘤細胞的運動、遷移及侵襲能力只是其中一種可能的機制,仍需要更多的臨床及實驗進一步證實。

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        (收稿日期:2017-04-18 本文編輯:許俊琴)

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