吳麗紅+侯佳+王玨+羅曼+王麗敏+王建新+李永吉+秦晶

[摘要] 測(cè)定天麻素及鉤藤堿體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，研究天麻鉤藤藥對(duì)配伍后對(duì)天麻素和鉤藤堿體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為的影響。結(jié)果天麻鉤藤以9∶12配伍后，與二者單味藥對(duì)照組相比，天麻素和鉤藤堿C_max及AUC均顯著增加，鉤藤t_max后移1.5 h，天麻t_max后移0.25 h，二者由原來相同的達(dá)峰時(shí)間改變?yōu)榍昂笙嗖?.25 h，說明配伍可顯著改變藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為。從整體組方分析，天麻藥性緩和滋補(bǔ)，鉤藤寒涼苦降，配伍后天麻達(dá)峰較快且C_max及AUC增加，先發(fā)揮滋陰潛陽作用同時(shí)彌補(bǔ)鉤藤達(dá)峰延后損失的藥效；之后，在滋陰的前提下鉤藤堿繼續(xù)達(dá)峰且C_max及AUC增加，可彌補(bǔ)天麻半衰期較短的缺點(diǎn)，有利于更好地維持降壓作用。二者配伍各自發(fā)揮優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，避免了單用鉤藤苦寒過重累及傷陰，或單用天麻滋補(bǔ)有余，苦寒不足，充分說明鉤藤、天麻二者共為君藥、標(biāo)本兼顧的治療原則具有可靠的藥動(dòng)學(xué)依據(jù)。該研究通過對(duì)天麻鉤藤藥對(duì)配伍后的藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)通過天麻、鉤藤配伍實(shí)現(xiàn)對(duì)“肝陽上亢”整體施治目的是具有其藥動(dòng)學(xué)基礎(chǔ)的，進(jìn)一步為中醫(yī)組方用藥的科學(xué)性、合理性提供藥動(dòng)學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 天麻；鉤藤；天麻素；鉤藤堿；藥動(dòng)學(xué)；配伍

[Abstract] To investigate the effect of the combination of gastrodia and uncaria on the pharmacokinetics of gastrodin and rhynchophylline， and determine their pharmacokinetic parameters after administration of the combination of gastrodia and uncaria at the ratio of 12∶9. Compared with uncaria group or gastrodia group， C_max and AUC of both gastrodin and rhynchophylline were significantly increased， and t_max was retroceded by 1.5 h for rhynchophylline and 0.25 h for gastrodin. The change of t_max resulted in a 1.25 h difference in the peak time between gastrodin and rhynchophylline ， which was the same between them. Uncaria shows a more effect in suppressing hyperactive Yang， while gastrodia has a balancing effect by nourishing Yin and suppressing hyperactive Yang. As a result， gastrodia could exert the effect in nourishing Yin and suppressing effect of uncaria， which could avoid the deficiency of Yang affecting Yin due to mono-treatment of uncaria. On one hand， the enhanced AUC and C_max of gastrodin could increase the average plasma drug concentration of gastrodin， and remedy the losing effect of uncaria at the early stage；On the other hand， the increased AUC and C_max of rhynchophylline could make up the quick elimination of gastrodia in vivo at the late stage. Their combination could lead to an increased anti-hypertensive effect with the balance of Yin and Yang. They showed unique advantages compared with simple dosage increase of western medicines. The results were consistent with the principle of TCM treatment for the hypertension due to hyperactivity of the liver Yang. In short， this study gives a good pharmacokinetic explanation of the balance of Yin and Yang and TCM treatment for both symptoms and root cause.

[Key words] gastrodin；uncaria；gastrodin；rhynchophylline；pharmacokinetics；combination

天麻-鉤藤是中醫(yī)治療高血壓的常用藥對(duì)[1]，具有平肝熄風(fēng)之效?，F(xiàn)代藥理研究表明，天麻中的天麻素、鉤藤中的鉤藤堿是主要活性成分[2]。有研究報(bào)道鉤藤堿、天麻素單獨(dú)用藥對(duì)血管的舒張作用遠(yuǎn)不及天麻鉤藤飲[3]，二者聯(lián)合用藥后，對(duì)血管的舒張作用與天麻鉤藤飲類似，說明天麻鉤藤在天麻鉤藤飲復(fù)方中共為君藥以及該藥對(duì)廣泛用于治療高血壓的合理性[4]。盡管天麻鉤藤藥對(duì)在高血壓治療中作為方劑配伍的基礎(chǔ)應(yīng)用十分廣泛[5-6]，但針對(duì)該藥對(duì)配伍前后的藥動(dòng)學(xué)改變研究報(bào)道較少。因此本文采用HPLC-MS/MS及HPLC為技術(shù)手段，對(duì)天麻鉤藤配伍前后的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了研究，旨在探究配伍后的藥動(dòng)學(xué)變化的規(guī)律，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑 天麻素對(duì)照品、鉤藤堿對(duì)照品（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；卡馬西平對(duì)照品、阿昔洛韋對(duì)照品（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；鉤藤飲片、天麻飲片（上海德華國藥制品有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA公司），其他試劑為分析純。

1.2 儀器 AB4000Q TRAP 串聯(lián)四級(jí)桿-線性離子阱質(zhì)譜儀（Applied Biosystems，美國）；Agilent 1200型高效液相色譜儀（G1312A四元泵，G1316A柱溫箱，G1379A在線脫氣）；XW-80A型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；BS224S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Elix/Rios高純水凈化器（上海迪發(fā)儀器儀表有限公司）；H-1650型離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)有限公司）；MD200型氮?dú)獯祾邇x（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，體重（220±20） g，許可證號(hào)SYXK（滬）2010-0099，由復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)溶液配制 精密稱取鉤藤堿對(duì)照品適量溶于70%甲醇中，配成質(zhì)量濃度1.0 g·L^-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。用70%甲醇梯度稀釋得0.1，0.5，2.5，12.5，25.0 mg·L^-1的對(duì)照品溶液。精密稱取一定量卡馬西平（內(nèi)標(biāo)）溶于70%甲醇配制成100 mg·L^-1的儲(chǔ)備液并稀釋為20 mg·L^-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

精密稱取天麻素對(duì)照品溶于0.05%甲酸水溶液，配成質(zhì)量濃度150 mg·L^-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。0.05%甲酸水溶液梯度稀釋得質(zhì)量濃度為0.15，0.30，1.5，3.0，15 mg·L^-1的對(duì)照品溶液。精密稱取阿昔洛韋（內(nèi)標(biāo)）溶于0.05%甲酸水溶液配制成100 mg·L^-1的儲(chǔ)備液并稀釋為50.0 mg·L^-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件 鉤藤堿測(cè)定色譜條件[7]：色譜柱為Agilent Eclipse Plus C₁₈柱 （4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相A（含1 mmol·L^-1三乙胺的冰醋酸水溶液，pH 7.0）-B（甲醇）30∶70；流速0.8 mL·min^-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL，記錄色譜圖，見圖1。鉤藤堿和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為5.33，2.23 min，該色譜條件可較好地將鉤藤堿與內(nèi)源性雜質(zhì)分離，不影響鉤藤堿的測(cè)定。

天麻素質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源（ESI）；檢測(cè)方式為負(fù)離子檢測(cè)；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；噴射電壓 4 500 V；離子源溫度500 ℃；氣簾氣流速為10 L·min^-1，碰撞氣流速為medium。天麻素及內(nèi)標(biāo)阿昔洛韋選擇性檢測(cè)離子分別為m/z 285.1→122.8，224→149.8。

天麻素色譜條件：色譜柱為 Agilent Eorbax SB C₁₈柱 （3.0 mm×100 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相A（0.05%甲酸水溶液）-B（乙腈）98∶2；流速 0.2 mL·min^-1；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 20 μL，記錄色譜圖，見圖2。結(jié)果天麻素和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為5.7，3.9 min，該色譜條件可較好地將天麻素與內(nèi)源性雜質(zhì)分離，不影響天麻素的測(cè)定。

2.3 血漿樣品處理 鉤藤血漿樣品處理：取血漿90 μL，加入20 mg·L^-1的內(nèi)標(biāo)卡馬西平溶液10 μL，混勻，渦旋振蕩1 min，加入400 μL乙腈沉淀蛋白混勻，渦旋振蕩3 min，放置冰箱中4 ℃沉淀1 h，取出后12 000 r·min^-1離心15 min，取上清液400 μL，在40 ℃氮?dú)獯蹈?，殘余物用流?dòng)相溶解，12 000 r·min^-1離心15 min，HPLC進(jìn)樣分析。

天麻素血漿樣品處理：取血漿90 μL，加入50 mg·L^-1的內(nèi)標(biāo)阿昔洛韋10 μL，混勻，渦旋振蕩1 min，加入400 μL甲醇乙腈（1∶4）沉淀蛋白混勻，渦旋振蕩3 min，取出后12 000 r·min^-1離心15 min取上清液400 μL，在40 ℃氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔镉昧鲃?dòng)相溶解，12 000 r·min^-1離心15 min，HPLC進(jìn)樣分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取血漿80 μL，加入鉤藤堿/天麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，加入內(nèi)標(biāo)卡馬西平或內(nèi)阿昔洛韋溶液10 μL，按2.3項(xiàng)操作，配制成質(zhì)量濃度為0.005，0.01，0.05，0.25，1.25，2.50 mg·L^-1的鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)溶液或配制質(zhì)量濃度為0.015，0.03，0.150，0.30，1.50 mg·L^-1的天麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC測(cè)定峰面積，以血漿樣品中鉤藤堿/天麻素濃度為橫坐標(biāo)，鉤藤堿/天麻素與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，求得線性回歸方程。鉤藤堿在0.005～2.5 mg·L^-1線性關(guān)系良好，r=0.999 9，回歸方程為y=0.331 08x-0.012 69；天麻素在0.015～1.5 mg·L^-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，回歸方程為y=0.720 4x-0.046 3。

2.5 方法學(xué)考察 取鉤藤堿質(zhì)量濃度為0.005，0.05，1.25 mg·L^-1的低、中、高濃度的血漿樣品各6份，進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果日內(nèi)精密度RSD均小于7.4%；日間精密度RSD均小于6.8%；回收率為97.57%～97.68%。表明鉤藤堿體內(nèi)測(cè)定方法符合方法學(xué)要求，可用于鉤藤堿體內(nèi)定量檢測(cè)。

取質(zhì)量濃度為0.015，0.15，1.50 mg·L^-1的低、中、高濃度的天麻素血漿樣品各6份，進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果天麻素日內(nèi)精密度小于11%，日間精密度均小于13%，回收率為94.02%～101.1%?；|(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果本方法測(cè)定條件下血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的離子抑制或增強(qiáng)作用可忽略不計(jì)，對(duì)天麻素的質(zhì)譜響應(yīng)沒有影響。提示本方法符合方法學(xué)要求，可用于天麻素體內(nèi)定量檢測(cè)。

2.6 不同配伍比例鉤藤天麻水煎液的制備 稱取天麻飲片9 g，加入450 mL蒸餾水浸泡1 h后煎煮，沸騰30 min后，加入鉤藤飲片12 g，合煎15 min，濃縮至生藥濃度為6 g·mL^-1的濃縮液。對(duì)照組分別為鉤藤或天麻單煎濃縮液。

2.7 實(shí)驗(yàn)分組及血漿樣品采集 18只SD大鼠體重200～250 g，隨機(jī)分成3組，每組6只。給藥前禁食12 h，自由飲水。分組灌胃給予鉤藤天麻水煎液、天麻對(duì)照水煎液、鉤藤對(duì)照水煎液。于給藥前取空白血漿，給藥后0.08，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，10，12 h眼眶靜脈叢取血約200 μL，分離血漿備用。

2.8 藥時(shí)曲線擬合及藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 各給藥組鉤藤堿、天麻素血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)用 DAS 2.0 藥動(dòng)學(xué)程序擬合，組間藥動(dòng)學(xué)參數(shù)用SPSS 17.0軟件分析。各組平均血藥濃度-時(shí)間擬合曲線見圖3，4，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1。

鉤藤天麻配伍后，鉤藤堿與對(duì)照組比較，C_max及AUC均顯著增加，t_max明顯后移；天麻素與對(duì)照組比較，C_max及AUC均顯著增加，t_max略有后移。因此，配伍后天麻素及鉤藤堿藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均由不同程度的改變，說明天麻鉤藤藥對(duì)配伍應(yīng)用于高血壓的疾病治療具有其藥動(dòng)學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 討論

高血壓是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的病癥名，中醫(yī)古籍文獻(xiàn)中并沒有提及該病，但不乏對(duì)高血壓癥狀的描述，如眩暈、頭痛、中風(fēng)等。有研究者綜合陰陽辯證、虛實(shí)辨證及臟腑辨證，歸納總結(jié)上千病例認(rèn)為肝陽上亢、陰虛陽亢、肝腎陰虛及肝風(fēng)上擾是高血壓病的主要證候[8-9]，衛(wèi)生部于2002年頒布的《中藥新藥治療高血壓病的臨床研究指導(dǎo)原則》也采納了這一辨證標(biāo)準(zhǔn)[10]。

中醫(yī)認(rèn)為肝陽上亢多見于高血壓初期，治則平肝潛陽；隨著病情進(jìn)展，陽損及陰，形成肝腎陰虛之證，治則養(yǎng)陰益腎；平肝潛陽屬治標(biāo)，滋陰柔肝屬治本。高血壓早期多表現(xiàn)為肝腎陰陽失調(diào)，故應(yīng)綜合考慮滋腎平肝，育陰潛陽，標(biāo)本兼治，盡快恢復(fù)陰陽動(dòng)態(tài)平衡 [11-12]。

“天麻鉤藤飲”出自《雜病證治新義》，天麻、鉤藤共為君藥，該方平肝熄風(fēng)、清熱活血，常用于肝陽偏亢，肝風(fēng)上擾證?！陡哐獕褐嗅t(yī)診療指南的推薦意見》（草案）將天麻鉤藤飲作為“肝陽上亢”證的首選方劑。天麻、鉤藤藥對(duì)也是現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)報(bào)道中應(yīng)用于“肝陽上亢”治療出現(xiàn)頻次最多的藥對(duì)之一[13]。鉤藤，其味甘、微苦，性微寒，歸肝、心包經(jīng)，屬寒涼苦降為主的藥物，既能清肝熱，又能平肝陽，《本草新編》則謂“去風(fēng)甚速，有風(fēng)癥者必宜用之”；天麻其味甘、辛，性平，歸肝經(jīng)，氣性和緩，補(bǔ)肝養(yǎng)膽。因此，鉤藤寒涼，藥力迅速；天麻滋補(bǔ)，藥力和緩。

根據(jù)本研究藥動(dòng)學(xué)結(jié)果分析：天麻、鉤藤對(duì)照組t_max相同，說明若二者單獨(dú)應(yīng)用應(yīng)同時(shí)發(fā)揮藥效，有助于藥效疊加。但我們發(fā)現(xiàn)配伍之后，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)不是二者簡單加和。首先，鉤藤t_max顯著后移1.5 h，天麻t_max僅后移0.25 h且同時(shí)C_max增加1.6倍AUC增加1.3倍。由此可以看出，給藥前期，天麻素通過C_max顯著提高來彌補(bǔ)鉤藤t_max延后損失的“平肝陽”作用；然后天麻t_max的略微后移提高了其前期整體的血藥濃度。由此，具滋補(bǔ)作用的天麻在前期替代鉤藤，充分地發(fā)揮其“滋陰”、“潛陽”的作用；給藥后期，在鞏固“滋陰”的前提下，鉤藤堿達(dá)峰且C_max及AUC顯著增加，可彌補(bǔ)天麻半衰期較短的缺點(diǎn)[14]，有助于其更多地發(fā)揮苦寒之性“平抑肝陽”。二者的配伍避免了單用鉤藤苦寒過重累及傷陰，或單用天麻滋補(bǔ)有余，苦寒不足。

有研究報(bào)道了“天麻鉤藤飲”的臨床藥效動(dòng)力學(xué)，結(jié)果表明該方效量消退半衰期為1.16 h，效應(yīng)維持時(shí)間為4.82 h，屬于起效快，有輕度降壓作用的復(fù)方[15-16]。這與中醫(yī)認(rèn)為該方適用于病情較輕的“肝陽上亢”相吻合。通過本研究從藥動(dòng)學(xué)角度分析二者作用時(shí)間以及藥性的配合，天麻鉤藤藥對(duì)先補(bǔ)后瀉、補(bǔ)中有瀉，作用有急有緩。中醫(yī)認(rèn)為抑陽為治標(biāo)，滋陰為治本，因此二者共為君藥，滋腎柔肝，育陰潛陽，標(biāo)本兼治，有利于在疾病早期盡快恢復(fù)陰陽平衡，說明中醫(yī)整體施治的思想具有充分的藥動(dòng)學(xué)基礎(chǔ)。

此外，值得指出的是也有大量的臨床研究報(bào)道通過調(diào)節(jié)天麻鉤藤的比例、用量或與其他方劑加減配伍來治療“陰虛陽亢”等證[17-19]。綜合本研究結(jié)果，不同藥物配伍之后可顯著改變其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為甚至作用強(qiáng)度，可見中醫(yī)通過對(duì)藥性的認(rèn)識(shí)總結(jié)出的配伍規(guī)律具有其科學(xué)合理性，在此基礎(chǔ)上結(jié)合對(duì)疾病內(nèi)在規(guī)律的獨(dú)特認(rèn)識(shí)進(jìn)行靈活組方、整體施治也是中醫(yī)的精髓所在。

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[責(zé)任編輯 張燕]