王羨一，李瑞海，賈天柱

雙超法提取中藥黃芩有效成分的研究

王羨一，李瑞海*，賈天柱

目的 利用高能超聲破碎法和超濾膜獲得黃芩中較高純度的總黃酮成分。方法 以黃芩中黃芩苷化合物為對(duì)照品，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定。對(duì)比超聲、微波、回流和高能超聲破碎提取法，并利用正交試驗(yàn)，以時(shí)間、乙醇濃度、料液比和次數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行考察，采用Biomax-5膜進(jìn)行超濾膜分離。結(jié)果 單因素試驗(yàn)中以高能超聲破碎提取法提取含量較高。正交試驗(yàn)結(jié)果：時(shí)間5 min，乙醇濃度為50%，料液比1∶10，提取3次。超濾膜分離條件:以流量為1.5 L/min、壓力為0.8 kg進(jìn)行膜分離。結(jié)論 高能超聲破碎法和超濾膜的結(jié)合，用于黃芩中黃酮類化合物的純化，方法可行，產(chǎn)品純度高，方法具有良好的應(yīng)用前景。

黃芩；黃酮；正交試驗(yàn)；高能超聲破碎法；超濾膜

0 引言

目前,中藥有效成分提取純化的方法包括有機(jī)溶劑提取，有機(jī)溶劑反復(fù)萃取，利用柱層析分離等，但這些方法操作相對(duì)復(fù)雜，有效成分在整個(gè)操作中經(jīng)常發(fā)生變化。高能超聲破碎法是利用高能超聲波將植物藥的細(xì)胞破碎，進(jìn)而獲得更多有效成分的方法。中藥的有效成分一般認(rèn)為是存在于細(xì)胞內(nèi)部或細(xì)胞間質(zhì)當(dāng)中，由于高能超聲破碎法的細(xì)胞破碎作用，提取藥物的有效成分相對(duì)完全，同時(shí)提取的過(guò)程不用加熱，不破壞有效成分，具有良好的應(yīng)用前景。超濾膜技術(shù)是利用物質(zhì)分子的大小進(jìn)行篩分分離，在生產(chǎn)中可以進(jìn)行純化、濃縮等過(guò)程，具有不耗能、產(chǎn)品收率高等特點(diǎn)。

雖然高能超聲破碎法具有提取成分比較多的優(yōu)點(diǎn)，但雜質(zhì)相對(duì)也較多，而超濾法具有純化成分的良好作用，因此，本實(shí)驗(yàn)擬將兩個(gè)方法的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來(lái)，對(duì)黃芩中黃酮類化合物進(jìn)行純化方法具有實(shí)際意義。

黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，主要生物活性成分是以黃芩苷為主的黃酮類化合物。本實(shí)驗(yàn)采用紫外-可見(jiàn)分光光度法，采用正交試驗(yàn)法對(duì)黃芩高能超聲破碎法提取的最優(yōu)工藝進(jìn)行研究，并將最優(yōu)工藝提取的黃芩粗總黃酮，利用超濾膜進(jìn)行進(jìn)一步的純化，以此獲得高純度黃芩總黃酮類化合物，為黃芩成分的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、試劑與試藥

P230II UV230II紫外檢測(cè)器，EC2006-色譜數(shù)據(jù)處理工作站(大連依利特)；M1-211A美的微波爐，微波功率：700 W；ESB-500高剪切均質(zhì)乳化機(jī)(上海易勒機(jī)電實(shí)驗(yàn)室)；BIOQ-UNR-D3-2010小型膜分離系統(tǒng)，膜名稱Biomax-5，分子量5 000(上海匯合堂生物工程設(shè)備有限公司)；0.000 01 g電子天平(SARTORIUS CP225D)；JD050T超聲波提取器(奧特賽恩斯儀器有限公司)。黃芩苷(批號(hào):20150726，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，大連美侖生物技術(shù)有限公司提供，純度>99%)；黃芩產(chǎn)地河北，購(gòu)買日期20150628，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)尹海波教授鑒定均為為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根；實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水，甲醇、乙醇等試劑為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 黃芩中黃芩苷類成分含量測(cè)定方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定對(duì)照品加甲醇，制成黃芩苷0.007 mg/mL的對(duì)照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取黃芩樣品，粉碎，過(guò)100目篩，精密稱取0.01 g，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，稱定，補(bǔ)足重量，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定[1]取黃芩苷對(duì)照品溶液，于紫外檢測(cè)器上，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描并測(cè)定吸收曲線，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)是278 nm。因此，將278 nm作為總黃酮的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 黃芩苷對(duì)照品

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取干燥至恒重的黃芩苷1.0 mg，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解稀釋并定容至刻度，搖勻，得到儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，以60%乙醇為空白溶液，在278 nm處分別測(cè)定吸收度。以黃芩苷濃度(X)(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸收度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程及線性范圍為，黃芩苷Y=50.607 X-0.000 9，r=0.999 6，說(shuō)明樣品在0.002～0.016 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2 常見(jiàn)提取方法的比較[2-4]將黃芩粉碎，精密稱取0.06 g置于錐形瓶中，加60%乙醇溶液20 mL，4份，分別按表1方法處理得干浸膏，按“2.1.3”項(xiàng)條件測(cè)定法，按“2.3.4”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 常見(jiàn)提取方法的比較

2.2.1 超聲提取 于超聲波清洗儀中常溫超聲提取30 min，超聲頻率100 Hz，過(guò)濾，濾餅再重復(fù)提取2次，合并3次提取液，減壓濃縮至干[3]。

2.2.2 微波提取 于微波爐高火下加熱至剛沸騰時(shí)即停止加熱,約1 min后再加熱，反復(fù)多次，直至累積加熱10 min，過(guò)濾，濾餅再重復(fù)提取2次，合并濾液，合并3次提取液，減壓濃縮至干。

2.2.3 回流提取 于水浴中80 ℃左右回流提取，2 h后過(guò)濾，濾餅再重復(fù)提取2次，合并濾液，合并3次提取液，減壓濃縮至干。

2.2.4 高能超聲破碎提取 于高能超聲破碎機(jī)中提取10 min，過(guò)濾，濾餅再重復(fù)提取2次，合并3次提取液，減壓濃縮至干。由表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，提取的含量相對(duì)較高，因此對(duì)高能超聲破碎的提取條件采用正交實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 正交試驗(yàn)研究

2.3.1 正交試驗(yàn)優(yōu)選高能超聲破碎提取條件 通過(guò)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，高能超聲破碎提取的主要影響因素為時(shí)間、溶劑濃度、料液比和次數(shù)等，因此,以時(shí)間等4個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素3個(gè)水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝。因素水平見(jiàn)表2。以黃芩苷成分為對(duì)照品，對(duì)黃芩總量進(jìn)行對(duì)比，優(yōu)選提取工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4，因素水平相關(guān)圖見(jiàn)圖2。

由R值可知，各因素對(duì)總黃酮類成分提取的影響大小順序?yàn)镈>B>C>A；方差分析結(jié)果D、B、C乙醇濃度、料液比、次數(shù)具有顯著影響。最后確定提取工藝為A1B2C1D3，即時(shí)間5 min，乙醇濃度為50%，料液比1∶10，提取3次。

表2 黃芩黃芩苷類成分提取工藝優(yōu)選正交試驗(yàn)因素水平

表3 黃芩總黃酮類成分提取工藝優(yōu)選正交試驗(yàn)表及 含測(cè)結(jié)果

圖2 因素指標(biāo)相關(guān)圖

2.3.2 正交優(yōu)化工藝條件重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按優(yōu)選的提取工藝提取3批黃芩總黃酮量，測(cè)定其含量，結(jié)果含量為501.01 mg/g(n=3，每g干膏)。

2.4 超濾膜分離條件的確定 取黃芩50 g，按上述正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取工藝進(jìn)行提取，提取液過(guò)濾，備用。

2.4.1 流量和壓力的確定 在膜分離中，流量和壓力是影響分離的主要因素，流量大，分離效率高，但相應(yīng)壓力也變大，會(huì)影響膜分離的效果和膜的使用壽命，取得一個(gè)適當(dāng)?shù)牧髁亢蛪毫ζ胶恻c(diǎn)，是膜分離操作的關(guān)鍵。取黃芩提取液于膜分離中，變換不同的流量，記錄對(duì)應(yīng)的壓力，結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果隨著流量的提高，壓力隨之升高，但達(dá)到1.5 L/min時(shí)，壓力急劇上升，最后選用1.5 L/min作為流量。

圖3 流量和壓力的關(guān)系

2.4.2 超濾膜分離時(shí)間的確定 分別于0.5、1、1.5、2、4 h測(cè)定膜分離濃縮液(主要為黃芩當(dāng)中的雜質(zhì)成分)中黃芩的含量，結(jié)果見(jiàn)圖4，結(jié)果表明，在上述流量下進(jìn)行的膜分離，在達(dá)到2 h后濃縮液當(dāng)中黃芩苷總量已很少，因此最后確定膜分離時(shí)間為2 h。

圖4 流量和總黃酮量的關(guān)系

表4 方差分析結(jié)果F 0.05(2.2)=19.00

2.4.3 超濾膜分離條件結(jié)果[5]超濾膜，原裝美國(guó)進(jìn)口，Biomax-5(0.1平方米盒式平板膜的盒式平板膜)，以蠕動(dòng)泵，流量為1.5 L/min，壓力為0.8 kg左右進(jìn)行分離，約2 h完成。

2.5 純化黃芩黃酮成分的含量測(cè)定結(jié)果 將黃芩50 g，加50%乙醇10倍，時(shí)間5 min，濾過(guò)，同法再提取2次，合并藥液，按“2.4.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行膜分離。得濾液，濃縮，減壓干燥，得干浸膏。精密稱取0.5 mg，按“2.1.2”項(xiàng)下從“置具塞錐形瓶中”后方法處理，按“2.1.3”項(xiàng)條件測(cè)定法，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描并測(cè)定吸收曲線，見(jiàn)圖5，按“2.3.4”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品含量，其含量結(jié)果為812.73 mg/g(n=3，每g干膏)。

圖5 高能超聲破碎法結(jié)合超濾法樣品

3 討論

3.1 預(yù)試驗(yàn)中首先對(duì)提取溶劑選擇 經(jīng)查閱文獻(xiàn)[6-10]，發(fā)現(xiàn)黃芩苷類成分一般采用甲醇和乙醇提取，經(jīng)比較甲醇和乙醇的提取中兩者并無(wú)著差異，與甲醇相比，乙醇的毒性較低，最后確定乙醇為提取溶劑，在對(duì)比不同濃度的乙醇提取發(fā)現(xiàn)，40%乙醇和乙醇(即低濃度乙醇和高濃度乙醇)提取，含量均低，最后確定50%、60%和70%甲醇作為提取濃度水平。預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高能超聲破碎提取時(shí)間長(zhǎng)，提取完全，但超過(guò)15 min后，沒(méi)有太大的變化。料液比對(duì)于提取有很大影響，預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，料液比1∶30時(shí)，含量不再增加。預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)于高能超聲破碎提取并沒(méi)有太大影響，因此本次實(shí)驗(yàn)不作考察。最后確定高能超聲破碎時(shí)間、乙醇濃度、料液比和次數(shù)4個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行考察。

3.2 由表2 R值可知，各因素對(duì)黃芩苷總量類成分提取的影響大小順序?yàn)镈>B>C>A；以R值最小的A時(shí)間為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果乙醇濃度、料液比、次數(shù)等因素對(duì)黃酮提取具有顯著影響，因此，選擇其相應(yīng)的最高水平。方差分析結(jié)果表明，時(shí)間不是影響實(shí)驗(yàn)的主要因素，因此，可選擇利于生產(chǎn)的相關(guān)水平，即5 min。故確定提取工藝為A1B2C1D3，即時(shí)間5 min，乙醇濃度為50%，料液比1∶10，提取3次。

3.3 由表1常見(jiàn)提取方法的比較結(jié)果可知，微波提取、回流提取和均質(zhì)提取法其含量都較高，超聲提取法提取成分的含量較低。由于回流提取較為傳統(tǒng)，可靠，但操作繁瑣也是其主要的問(wèn)題。與微波提取法相比，高能超聲破碎提取法更具有優(yōu)勢(shì)，它減少了粉碎的環(huán)節(jié)，提取率相對(duì)較高，因此，本研究主要針對(duì)高能超聲破碎提取法對(duì)黃芩進(jìn)行研究，以利其在實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。

3.4 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，高能超聲破碎提取法可以更有效地將藥物的有效成分提取出來(lái)，而且提取的過(guò)程不用加熱，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，所以有效成分不會(huì)像傳統(tǒng)的回流等提取法那樣受到溫度的影響，這是高能超聲破碎提取法的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)將高能超聲破碎所得的提取液，利用超濾膜分離方法純化，膜分離過(guò)程具有無(wú)相變發(fā)生，能耗低，無(wú)需外加物質(zhì)，對(duì)環(huán)境無(wú)二次污染等特點(diǎn)，雜質(zhì)去除較完全，獲得了純度較高的黃芩黃酮類化合物，兩者結(jié)合應(yīng)用，具有創(chuàng)新性，值得推廣。

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Ultrasonic emulsification combined with membrane for extraction of flavonoids ingredients inScutellariabaicalensis

WANG Xian-yi,LI Rui-hai*,JIA Tian-zhu

(School of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)

Objective To obtain high purity flavonoids ingredients ofScutellariabaicalensisGeorgi using the method of ultrasonic emulsification and membrane separation.Methods The content of Baicalin inScutellariabaicalensiswas determined by UV visible spectrophotometry.Compare ultrasound,microwave,reflux and ultrasonic emulsification method;and orthogonal experiment was used to investigate the 4 factors:ultrasonic emulsification time,ethanol concentration,solid-liquid ratio and times.Biomax-5 membrane was used to make ultrafiltration membrane separation.Results In the single factor experiment,the extraction rate of ultrasonic emulsification extraction was higher.Orthogonal test results showed the ultrasonic emulsification time was 5 min,ethanol concentration was 50%,the solid liquid ratio:1∶20,extraction:3 times.Membrane separation conditions:the membrane separation was done at a flow rate of 1.5 L/min and ultrafiltration membrane pressure of 0.8 kg.Conclusion The combination of ultrasonic emulsification and membrane can be used for the purification of flavonoids in Scutellaria baicalensis.The method is feasible,the purity of the product is high,and the method has a good application prospect.

Scutellariabaicalensis;Flavonoids;Orthogonal test;Ultrasonic emulsification;Ultrafiltration embrane

2016-11-17

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連 116600

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201707024