馬丹鳳，譚金桃，何周康

變換波長HPLC法同時(shí)測定藿香鼻炎合劑中五種成分的含量

馬丹鳳，譚金桃，何周康*

目的 建立HPLC波長切換聯(lián)合梯度洗脫法同時(shí)測定藿香鼻炎合劑中的廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量的方法。方法 采用Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相A：乙腈，流動相B：0.4%磷酸溶液，進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長分別規(guī)定為310 nm(廣藿香酮)、280 nm(黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素)。結(jié)果 廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的線性范圍分別為4.300～86.00 μg/mL (r=0.999 6)、15.87～317.4 μg/mL (r=0.999 8)、6.920～138.4 μg/mL (r=0.999 9)、6.340～126.8 μg/mL (r=0.999 4)、5.250～105.0 μg/mL (r=0.999 8)，平均加樣回收率和RSD均符合中國藥典規(guī)定。結(jié)論 本文建立的HPLC波長切換聯(lián)合梯度洗脫法同時(shí)測定廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素5個(gè)成分，方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可作為藿香鼻炎合劑全面可靠的質(zhì)量控制方法。

HPLC；波長切換法；梯度洗脫法；藿香鼻炎合劑；廣藿香酮；黃芩苷；漢黃芩苷；黃芩素；漢黃芩素

0 引言

藿香鼻炎合劑為本院的醫(yī)院制劑，是由9味中藥材(廣藿香、黃芩、生石膏、辛夷、薄荷、石菖蒲、白芷、桑白皮、蒼耳子)加工而成，具有祛風(fēng)清熱、宣肺解毒的作用，對各類急、慢性鼻炎及鼻竇炎的治療效果顯著，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅規(guī)定了該制劑的性狀、鑒別及合劑的常規(guī)檢查項(xiàng)，沒有對藿香鼻炎合劑處方中的成分進(jìn)行定量測定[1]。為確保該產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定和療效的一致性，筆者以方中黃芩中所含黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和廣藿香所含廣藿香酮為指標(biāo)成分，采用HPLC波長切換聯(lián)合梯度洗脫法同時(shí)測定廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量，為藿香鼻炎合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀(SPD-M20A檢測器、自動進(jìn)樣器、CTO-10AVP柱溫箱)(島津公司)；BS124S 型電子天平(德國賽多利斯)。

1.2 試藥 乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純；廣藿香酮對照品(111822-201102，干燥密閉冷處保存)、黃芩苷對照品(110715-201318，常溫干燥、密閉遮光保存)、漢黃芩苷對照品(112002-20150，2～10 ℃冷處保存)、黃芩素對照品(111595-201306，常溫干燥密閉保存)、漢黃芩素對照品(111514-201304，干燥密閉保存，中國食品藥品檢定研究院)；藿香鼻炎合劑(醫(yī)院制劑，自制，每瓶裝100 mL，批號：20160517、20160519、20160623、20160621、20160510、20160329、20160327、20160325、20160318、20160316)。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備 取對照品廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素各適量，精密稱定，加70%乙醇制成質(zhì)量濃度分別為廣藿香酮0.430 mg/mL、黃芩苷1.587 mg/mL、漢黃芩苷0.692 mg/mL、黃芩素0.634 mg/mL和漢黃芩素0.525 mg/mL的單一成分對照品儲備液。再分別依次吸取配制好的以上對照品儲備液1.0、5.0、5.0、2.5、1.0 mL，置50 mL量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，即得混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液和陰性樣品溶液的制備 精密量取藿香鼻炎合劑2.0 mL，置于50 mL容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，充分振搖均勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按照藿香鼻炎合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下載明的處方，分別稱取除廣藿香和黃芩的其余藥材各1份，再嚴(yán)格按照藿香鼻炎合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下生產(chǎn)工藝和上述方法，制備廣藿香空白對照溶液和黃芩空白對照溶液。

2.3 色譜條件 采用Kromasil C18色譜柱；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動相A：乙腈，流動相B：0.4%磷酸溶液，梯度洗脫(0～7 min，24.0%A；7～12 min，24.0%A→32.0%A；12～26 min，32.0%A→50.0%A；26～30 min，50.0%A→24.0%A)；0～12 min時(shí)在310 nm[2]波長下檢測廣藿香酮，12～30 min在280 nm[3]波長下檢測黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素。理論塔板數(shù)按廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素計(jì)算，均不得低于3 500，廣藿香空白對照溶液、黃芩空白對照溶液、混合對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1，陰性樣品對被測定成分無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述制備的廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對照品儲備液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，將其分別置于10 mL的容量瓶中并用 70%乙醇稀釋成系列濃度的混合對照品溶液，進(jìn)樣進(jìn)行測定，采用測得的峰面積Y作為縱坐標(biāo)，采用對照品質(zhì)量濃度X作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，如表1所示。

圖1 4種溶液的色譜圖

注：A.對照品，B.樣品，C.廣藿香空白，D.黃芩空白；1.廣藿香酮，2.黃芩苷，3.漢黃芩苷，4.黃芩素，5.漢黃芩素

表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號的藿香鼻炎合劑樣品6份，按“2.2”下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)樣檢測，分別計(jì)算廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量，并計(jì)算各組分含量的RSD，結(jié)果各組分含量的RSD分別為1.56%、0.79%、1.08%、1.25%、1.37%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號藿香鼻炎合劑的同一供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12 h來評價(jià)供試品溶液的穩(wěn)定性，分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量為10 μL，測定廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的峰面積值，求得廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD分別為0.98%、0.66%、0.81%、0.94%、1.03%。供試品溶液從配制開始起，在室溫下12 h內(nèi)很穩(wěn)定。

2.7 儀器精密度試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)混合對照品溶液，按“2.3”項(xiàng)的色譜條件和測定方法重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的峰面積，分別計(jì)算廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD值，結(jié)果所測各組分峰面積的RSD分別為1.02%、0.83%、0.59%、0.94%、1.01%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取9份已知含量的同一批號的藿香鼻炎合劑(批號：20160517)適量，精密量取1.0 mL，置于不同的50 mL容量瓶中，參考《中國藥典》2015年版四部藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則要求，分別按所測定組分樣品含有量的50%、100%、150%左右，精密加入各對照品溶液(廣藿香酮0.106 mg/mL、黃芩苷2.261 mg/mL、漢黃芩苷0.827 mg/mL、黃芩素0.383 mg/mL、漢黃芩素0.126 mg/mL)1.0、2.0、3.0 mL各3份，用70%乙醇稀釋至刻度，充分振搖均勻，過濾，取續(xù)濾液，作為加樣供試品試液，進(jìn)樣檢測，計(jì)算廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的回收率，結(jié)果見表2。

表2 廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素回收率

2.9 樣品含量測定 取10個(gè)批號的藿香鼻炎合劑，按“2.2”項(xiàng)供試品溶液的制備方法，按“2.3”項(xiàng)色譜條件，進(jìn)樣測定，依法測定藿香鼻炎合劑中廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量，結(jié)果見表3。

表3 含量測定結(jié)果(n=3，mg/mL)

3 討論

3.1 流動相的選擇 筆者在實(shí)驗(yàn)中同時(shí)考察了多個(gè)流動相體系，甲醇-0.2%冰醋酸溶液體系[4]、乙腈-0.2%磷酸溶液體系[5]、乙腈-0.4%磷酸溶液體系[6]，以所測定成分廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的峰形、分離效果等為指標(biāo)，優(yōu)選出最佳的流動相體系，最終采用乙腈-0.4%磷酸溶液，按照文中的梯度洗脫程序?yàn)榱鲃酉囿w系時(shí)，所測各色譜峰的分離度和峰形達(dá)到最佳。

3.2 暫定含量限度的確定 根據(jù)所測定10個(gè)批次廣藿香酮、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量平均值的80%，暫定本品每1 mL含廣藿香以廣藿香酮計(jì)不得低于0.16 mg；含黃芩以黃芩苷計(jì)不得低于3.6 mg，以漢黃芩苷計(jì)不得低于1.3 mg，以黃芩素計(jì)不得低于0.61 mg，以漢黃芩素計(jì)不得低于0.21 mg。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:45,301.

[2] 張穎梅,陳海明,吳曉麗,等.HPLC 同時(shí)測定廣藿香中雷杜辛黃酮醇及廣藿香酮的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19,(16):160-163.

[3] 黃凱雁,秦民堅(jiān),周銅水.高效液相色譜法同時(shí)測定黃芩及其制劑中4種黃酮的含量[J].安徽醫(yī)藥,2008,12(9):799-801.

[4] 楊立新,劉岱,馮學(xué)鋒,等.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地黃芩中黃酮化合物的含量[J].中國中藥雜志,2002,27(3):166-170.

[5] 易宇陽,陳海明,秦臻,等.HPLC法測定廣藿香油中廣藿香酮的含量[J].中藥新藥與臨床藥理,2011,22(5):560-562.

[6] 陳海明,易宇陽,彭紹忠,等.高效液相色譜法測定廣藿香中廣藿香酮的含量[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,28(6):645-647.

Simultaneous determination of five ingredients in Huoxiang Biyan Mixture by wavelength switching HPLC

MA Dan-feng,TAN Jin-tao,HE Zhou-kang*

(Department of Pharmacy,Hu′nan Children′s Hospital,Changsha 410007,China)

Objective To develop a method of wavelength switching HPLC combined with gradient elution for determination of the content of pogostone,baicalin,wogonoside,baicalein and wogonin in Huoxiang Biyan Mixture.Methods A kromasil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)column was used as the chromatographic column,the mobile phase was acetonitrile (A) and 0.4% phosphoric acid solution (B),and gradient elution was performed;the flow rate was 1.0 mL/min,and the column temperature was set at 30 ℃.Pogostone was detected at 310 nm;the baicalin,wogonoside,baicalein and wogonin were detected at 280 nm.Results Pogostone,baicalin,wogonoside,baicalein and wogonin had good linearities in 4.300～86.00 μg/mL (r=0.999 6),15.87～317.4 μg/mL (r=0.999 8),6.920～138.4 μg/mL (r=0.999 9),6.340～126.8 μg/mL (r=0.999 4) and 5.250～105.0 μg/mL (r=0.999 8),respectively.The average recovery andRSDall met the requirements of Pharmacopoeia of The People′s Republic of China.Conclusion The method of wavelength switching HPLC combined with gradient elution has been successfully established for simultaneous determination of 5 components in Huoxiang Biyan Mixture.The method is safe and reproducible,and is helpful for the quality control of Huoxiang Biyan Mixture.

HPLC;Wavelength switching method;Gradient elution method;Huoxiang Biyan Mixture;Pogostone;Baicalin;Wogonoside;Baicalein;Wogonin

2016-11-11

湖南省兒童醫(yī)院藥學(xué)部，長沙 410007

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201707025