白 雪，張 月，李 慧，何 平

山楂酸對肺癌95D細胞增殖、凋亡的影響

白 雪，張 月，李 慧，何 平*

目的 探討山楂酸對肺癌細胞95D增殖及凋亡產(chǎn)生的影響。方法 將山楂酸作用于人的肺癌細胞系95D，通過四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測山楂酸對細胞增殖的影響；通過流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡；通過熒光顯微鏡檢測細胞核的形態(tài)變化；采用Western blot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果 隨著山楂酸濃度增大，95D細胞的增殖率明顯降低，早期及晚期凋亡率逐漸增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；熒光電子顯微鏡觀察山楂酸作用后的細胞，可見染色體邊集、核碎裂等典型的凋亡改變，而對照組沒有相應(yīng)的變化；Western blot顯示，隨著山楂酸濃度的增加，Bcl-2蛋白表達逐漸降低，Bax蛋白表達逐漸升高。結(jié)論 山楂酸可以抑制肺癌95D細胞增殖，且具有濃度依賴性，山楂酸抑制肺癌95D細胞增殖是通過誘導(dǎo)細胞凋亡實現(xiàn)的。

山楂酸；肺癌；增殖；凋亡

0 引言

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，盡管近年來肺癌的診療技術(shù)有了一定程度的提高，肺癌的5年生存率仍較低[1-2]。近年來，中藥抗腫瘤作用及機制已成為國內(nèi)外研究的熱點[3-4]。相關(guān)研究表明，中藥抗腫瘤的作用機制包括：誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)細胞信號傳導(dǎo)、誘導(dǎo)腫瘤細胞分化、細胞毒作用、調(diào)節(jié)機體免疫功能、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥作用等[5-7]。

本研究選取的藥物—山楂酸(Maslinic acid)，是一種三萜類天然有機化合物，存在于多種天然植物，特別是山楂、紅棗、枇杷葉和油橄欖中，對人體的安全性較高，具有抗癌、抗氧化、抗艾滋病、抗菌、抗糖尿病等多種生物活性[8-10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，山楂酸對人結(jié)腸癌HT29細胞[11]、人前列腺癌 DU145細胞[12]、小鼠黑色素瘤細胞[13]等有較強的抗腫瘤活性，其中部分作用機制與誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡相關(guān)。本實驗主要研究山楂酸對非小細胞肺癌95D細胞的增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 人肺癌細胞系95D購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。山楂酸購于上海純優(yōu)生物科技有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購于Gibco公司，胎牛血清購于Hyclone公司，胰蛋白酶購于以色列Biological Industries公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)、Hoechst 33342購于美國Sigma公司，AnnexinV/PI雙染試劑盒購于BD公司，超凈工作臺(SW-CJ-1FD)購于蚌埠凈化設(shè)備廠，酶標(biāo)儀(BIOTEK-ELX808)購于美國賽默飛世爾公司，流式細胞儀(FACSCalibur)購于美國BD公司，倒置顯微鏡(Olympus CKX31)購于日本奧林巴斯公司，熒光電子顯微鏡(Nikon C1)購于日本尼康公司，離心機購于德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺癌95D細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞呈單層貼壁生長，接種細胞過夜進入對數(shù)生長期后，將細胞濃度調(diào)整為5×105/mL，開始進行藥物干預(yù)。

1.2.2 MTT實驗 山楂酸對95D細胞增殖的抑制作用：消化收集對數(shù)增殖期細胞，將細胞懸液濃度調(diào)整為1×105/mL后接種于96孔板，每孔100 μL，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)立含RPMI-1640全培養(yǎng)基的空白對照和未予藥物作用的陰性對照。實驗組加入終濃度依次為0、2、4、6、8、10 μg/mL的山楂酸溶液，將96孔板置于37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后吸去上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩混勻10 min。酶標(biāo)儀檢測波長570 nm的每孔光密度值(OD值)。增殖抑制率按如下公式計算：抑制率=(1-加藥組OD值/對照組OD值)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 流式細胞儀(FCM)AnnexinV/PI雙染法檢測山楂酸誘導(dǎo)95D細胞凋亡 95D細胞以5×105/mL接種于6孔板中，分別加入終濃度為0、2、4、6、8、10 μg/mL的山楂酸溶液，并設(shè)空白對照組(加等量RPMI-1640培養(yǎng)基)，于37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后胰酶消化收獲細胞。4 ℃、1 500 r/min離心5 min后收集細胞，棄去培養(yǎng)基，冷PBS洗滌、離心細胞2次。用500 μL Binding Buffer懸浮細胞，濃度約為1×106/mL，依次加入5 μL AnnexinV-FITC、5 μL PI混勻，2～8 ℃避光條件下孵育15 min，流式細胞儀檢測，分析凋亡的百分比。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察凋亡 將預(yù)處理過的蓋玻片置于六孔板內(nèi)，95D細胞以5×105/mL接種于蓋玻片中培養(yǎng)過夜，加入終濃度為8 μg/mL的山楂酸溶液，設(shè)空白對照組(加等量RPMI-1640培養(yǎng)基)，于37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。PBS洗2次，吹干，固定15 min，加入Hoechst 33342熒光染料(5 mg/L) 1 mL，37℃避光孵育15 min，含10%甘油的PBS封片，PBS洗2次，于熒光顯微鏡下觀察、照相。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot檢測Bcl-2、Bax的表達 95D細胞培養(yǎng)過夜，加入終濃度為4、6、8 μg/mL的山楂酸溶液，并設(shè)空白對照組(加等量RPMI-1640培養(yǎng)基)，于37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后胰酶消化，收獲細胞。裂解，低溫離心10 min (12 000 r/min，4 ℃)取上清液，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，冷卻。加樣，Marker，行SDS-PAGE電泳，濃縮膠80 V電泳約30 min，分離膠100 V、90 min電泳至底部。轉(zhuǎn)移、封閉后，加入一抗，本實驗所用一抗為Bcl-2、Bax、GAPDH (1∶200；Santa Cruz；USA)，4 ℃過夜孵育。應(yīng)用羊抗鼠IgG-HRP(1∶3 000)標(biāo)記二抗，孵育2 h。PVDF膜上均勻滴加適量發(fā)光液，行ECL底物發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 山楂酸對95D細胞生長抑制作用 MTT法檢測細胞增殖表明，隨著山楂酸作用濃度的增加，對95D細胞的增殖有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 山楂酸對95D細胞凋亡的誘導(dǎo)作用 流式細胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測表明，山楂酸作用24 h，隨山楂酸濃度的增高，早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例均逐漸增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 山楂酸(MA)對肺癌95D細胞增殖的抑制作用注：*與MA 0 μg/mL比較，P<0.05

圖2 流式細胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測MA作用于肺癌 95D細胞的凋亡率注：*與MA 0 μg/mL比較，P<0.05

2.3 Hoechst33342染色熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài) 8 μg/mL山楂酸作用于95D細胞24 h后，細胞形態(tài)出現(xiàn)顯著變化，呈現(xiàn)染色質(zhì)邊集、核碎裂等改變。隨著藥物濃度增加，細胞數(shù)量明顯減少，凋亡的細胞明顯增加，凋亡改變明顯。見圖3。

圖3 山楂酸作用于95D細胞后引起細胞核形態(tài)改變(400×)

2.4 山楂酸對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達的影響 Western blot方法檢測結(jié)果顯示，隨著山楂酸作用濃度的增加，Bcl-2蛋白表達逐漸降低，Bax蛋白表達逐漸增高。見圖4。

圖4 MA作用于肺癌95D細胞后對Bcl-2、Bax表達的影響

3 討論

目前，許多抗腫瘤藥物通過促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡來實現(xiàn)抗腫瘤作用[14-17]。Bcl-2家族是細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在線粒體凋亡途徑的調(diào)控中起重要作用，其中，Bcl-2、Bax在目前研究最為廣泛。當(dāng)細胞接受死亡信號刺激，Bax被激活，從細胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，進而形成同源二聚體，促進細胞凋亡，而Bcl-2則在Bax誘發(fā)凋亡過程中對其功能進行限制。當(dāng)細胞內(nèi)Bcl-2表達增多時，細胞凋亡受到抑制，Bax表達增多時，細胞凋亡受到促進，Bcl-2/Bax比例對細胞凋亡的發(fā)生意義重大[18]。

近年來，中藥及其有效成分因其抗腫瘤作用確切，在腫瘤治療中的地位日趨受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，從中藥中提取的一些萜類化合物，尤其是三萜類化合物，具有潛在的抗腫瘤作用，其抗腫瘤機制與促進腫瘤細胞凋亡有關(guān)[19-24]。

本研究表明，山楂酸具有較強的抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種活性作用，研究顯示，山楂酸對肝癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌細胞有很強的抑制作用[25-29]。Fernando等[30]通過山楂酸對人結(jié)腸癌癌細胞HT29的實驗證明，山楂酸通過直接激活線粒體凋亡通路導(dǎo)致人結(jié)腸癌癌HT29細胞死亡。

本實驗MTT結(jié)果顯示，山楂酸對95D細胞具有明顯的增殖抑制作用，并且存在劑量依賴關(guān)系。AnnexinV/PI雙染法結(jié)果顯示，山楂酸對95D細胞的增殖抑制作用是由誘導(dǎo)細胞凋亡來實現(xiàn)的，且凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高，呈劑量依賴性。通過熒光顯微鏡，從形態(tài)學(xué)上證實，山楂酸可以誘導(dǎo)95D細胞凋亡。Western blot檢測結(jié)果顯示，隨著山楂酸作用濃度的增加，Bcl-2蛋白表達逐漸降低，Bax蛋白表達逐漸增高。

綜上所述，山楂酸可以有效地抑制人肺癌95D細胞的增殖，且呈濃度依賴性，山楂酸抑制肺癌95D細胞的增殖是通過誘導(dǎo)其凋亡來實現(xiàn)的，凋亡通路之一可能是線粒體凋亡通路。

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Effect of maslinic acid on the proliferation and apoptosis of lung cancer 95D cells

BAI Xue,ZHANG Yue,LI Hui,HE Ping*

(Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To research the effect of maslinic acid on the proliferation and apoptosis of lung cancer 95D cells.Methods The effects of maslinic acid on proliferation of 95D cells was determined by MTT assay,and the apoptosis was analyzed by Annexin V/PI flow cytometric analysis.The morphology of apoptotic cell was detected by fluorescent microscopy.The effect of apoptosis-related proteins was detected by Western blot.Results Maslinic acid inhibited the proliferation of 95D cells in a dose-dependent manner significantly,and the proportion of Annexin V positive cells in drug-treated cells were increased in a dose-dependent manner,there were significant differences compared with control group (P<0.05).The observation of fluorescent microscopy showed that treatment with maslinic acid for 24 h could significantly induce the apoptotic cell death with chromatin condensation and nuclear fragmentation,while no corresponding change was found in control group.Western blot showed that the expression of Bcl-2 protein decreased gradually and the expression of Bax protein increased gradually with the increase of maslinic acid′s concentration.Conclusion Maslinic acid could inhibit the proliferation of 95D cell lines in a dose-dependent manner,which is achieved by induction of apoptosis.

Maslinic acid;Lung cancer;Proliferation;Apoptosis

2017-02-11

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽 110004

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201707002