陳佳松， 陳峰， 彭銳， 耿福能， 鄒方東*

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610064； 2. 四川省藥用動物工程技術(shù)研究中心，成都610064；3. 藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，成都610064)

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基于轉(zhuǎn)錄組測序分析美洲大蠊提取物促進小鼠創(chuàng)面愈合的分子機制

陳佳松1， 2， 3， 陳峰1， 2， 3， 彭銳1， 2， 3， 耿福能3*， 鄒方東1， 2， 3*

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610064； 2. 四川省藥用動物工程技術(shù)研究中心，成都610064；3. 藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，成都610064)

美洲大蠊Periplanetaamericana是傳統(tǒng)的中藥材，其提取物已在臨床上廣泛用于創(chuàng)面治療，但對其中的分子機制知之甚少。本文通過構(gòu)建小鼠皮膚創(chuàng)傷模型，并基于轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)深入分析美洲大蠊提取物促進小鼠創(chuàng)面愈合的分子機制。首先構(gòu)建C57小鼠皮膚全層切除模型，并將其分為3組，其中實驗組分別以2種美洲大蠊提取物(康復(fù)新液、精粉)為敷料，而對照組以75%乙醇為敷料。用藥處理3 d后取傷口皮膚組織送樣進行RNA-seq，然后分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)找出與傷口愈合相關(guān)的差異性表達基因，并利用熒光定量PCR(Q-PCR)對傷口組織中相關(guān)基因的表達量進一步驗證。實驗結(jié)果顯示，實驗組小鼠傷口的結(jié)痂速度比對照組快，這表明了小鼠創(chuàng)面模型中，美洲大蠊提取物能促進傷口愈合。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析，得到顯著性差異表達基因數(shù)：對照組vs.精粉組為545，對照組vs.康復(fù)新液組為938。結(jié)合生物信息分析結(jié)果和已發(fā)表的文獻，發(fā)現(xiàn)3個可能參與調(diào)節(jié)傷口愈合的關(guān)鍵基因：表皮調(diào)節(jié)素(Ereg)、Gli-kruppel家族成員(Gli2)和表皮型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3(Tgm3)。Q-PCR實驗表明，這3個基因在美洲大蠊提取物加藥組中均高表達。本文研究結(jié)果表明，2種美洲大蠊提取物：康復(fù)新液、精粉可能通過誘導(dǎo)Ereg、Tgm3和Gli2的高表達來促進皮膚創(chuàng)面的愈合。

美洲大蠊；傷口修復(fù)；轉(zhuǎn)錄組分析；關(guān)鍵基因

美洲大蠊Periplanetaamericana是蜚蠊目Blattaria蜚蠊科Blattidae昆蟲，主要分布于熱帶和亞熱帶，是世界性衛(wèi)生害蟲，除傳播多種人類疾病外，其分泌物還引起人類過敏性反應(yīng)。此外，美洲大蠊還是傳統(tǒng)的中藥材，常以干燥或鮮成蟲入藥，具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化、增強免疫、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。例如，在子宮內(nèi)膜癌細胞株JEC中，美洲大蠊提取物能夠通過阻滯G2/M期抑制腫瘤增殖(張曉巍，朱艷，2015)。美洲大蠊70%乙醇提取物：異香豆素類化合物，對肝癌細胞(HepG2)和人乳腺癌細胞(MCF-7)也有顯著的細胞毒性(Luoetal.，2014)。此外，美洲大蠊精粉對金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、大腸埃希菌Escherichiacoli、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa均有抑菌作用(李遠輝等，2014)。

康復(fù)新液由美洲大蠊醇提物配制而成，臨床上廣泛用于創(chuàng)面治療。在對肛管難愈合的79例臨床觀察中，發(fā)現(xiàn)以康復(fù)新液進行局部換藥時，與對照組利凡諾溶液局部換藥相比治愈率高、傷口愈合時間明顯較短(伍偉明等，2015)。另外，在大鼠皮下切割傷實驗中，康復(fù)新液處理組傷口愈合率也高于對照組(張俊等，2014)。有實驗表明美洲大蠊提取物可以加速全身放射損傷的愈合。作者使用美洲大蠊多元醇提取物W11-a12作為治療藥物發(fā)現(xiàn)，其能通過增加細胞外基質(zhì)表達量、調(diào)控傷口細胞增值、使肉芽組織的形成速度加快，從而提高傷口愈合速度和質(zhì)量(舒崇湘等，2001)。

臨床及實驗證據(jù)都表明美洲大蠊提取物有明顯的促創(chuàng)面愈合能力，且能通過多種途徑促進創(chuàng)面愈合。但是，目前對其中涉及的分子機制不甚明確?；诖?，本文利用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)這一成熟的基因組學(xué)研究技術(shù)手段，分析美洲大蠊提取物促進創(chuàng)傷修復(fù)過程中基因表達變化，從中篩選出與創(chuàng)面愈合相關(guān)的差異性表達基因，并進一步從細胞和個體水平進行驗證，從而初步揭示美洲大蠊提取物促進創(chuàng)傷修復(fù)的分子機制，為美洲大蠊的深入開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

SPF級C57小鼠(四川大學(xué)實驗動物中心)，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCSK(川)2013-026，實驗動物使用許可證：SYSK(川)2013-185；康復(fù)新液、精粉(四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限公司)；RNAiso Plus(TaKaRa，Code No. 9108)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，RR047A)；EvaGreen 2X qPCR Master Mix(abm，Master Mix-S)；Tissue Protein Extraction Kit(康為，CW0891S)。

1.2方法

1.2.1動物模型實驗5～7周齡的C57實驗小鼠稱量后選取體質(zhì)量在平均值±3 g內(nèi)的小鼠，隨機分為3組：對照組(Control)、康復(fù)新液實驗組(KFX)、精粉實驗組(JF)(用75%乙醇配制為0.05 g·mL-1)。每組3只。飼養(yǎng)1 d后，將小鼠背部脫毛備用。首先用無水乙醚麻醉小鼠，然后參照《現(xiàn)代創(chuàng)傷修復(fù)學(xué)》所述(付小兵，王德文，1997)在背部用消毒手術(shù)剪，剪下邊長為1 cm的正方形創(chuàng)口。用75%乙醇擦拭傷口消毒后，每天早晚擦藥各1次，每次1 mL溶液，對照組抹75%乙醇。拍照記錄，利用Photoshop計算傷口面積變化。

1.2.2轉(zhuǎn)錄組分析造模3 d后，取傷口周圍約2 mm區(qū)域的皮膚送公司進行RNA-seq。原始reads經(jīng)過濾后用tophat2和cufflink對reads進行組裝拼接。用R語言包：EdgeR分析得到顯著性差異基因，然后用blast2go對差異基因進行Gene Ontology(GO)和kyoto encyclo pedia of genes and genomes(KEGG)分析。

1.2.3熒光定量PCR實驗使用試劑盒RNAiso Plus提取皮膚組織總RNA，步驟按照試劑所提供的說明書；反轉(zhuǎn)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA；從NCBI上查找Ereg、Gli2、Tgm3、GAPDH序列，用Primer 5設(shè)計引物如表1；熒光定量PCR(Q-PCR)步驟和參數(shù)設(shè)置按照EvaGreen 2X qPCR Master Mix說明書所示。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primer used in this study

2 結(jié)果

2.1動物模型實驗

構(gòu)建C57小鼠創(chuàng)傷模型，實驗組每天涂康復(fù)新液或精粉液，對照組每天涂75%乙醇，隔一天拍照記錄。統(tǒng)計實驗組和對照組傷口面積變化，結(jié)果表明美洲大蠊提取物：康復(fù)新液和精粉能加速傷口面積收縮(圖1)。

圖1 傷口面積變化Fig. 1 Wound area in mice

2.2轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1傷口組織測序結(jié)果由前期的觀察實驗發(fā)現(xiàn)，用藥3 d左右加藥組已有結(jié)痂現(xiàn)象。因此，藥物處理3 d后分別選擇了3組(對照組、精粉組和康復(fù)新液組)傷口組織進行RNA-seq。RNA提取、文庫構(gòu)建后，通過Illumina 高通量測序平臺得到的原始數(shù)據(jù)用raw reads表示。各組樣品得到的原始reads如表2所示。

表2 測序原始readsTable 2 Raw data of RNA-seq

2.2.2顯著性差異表達基因分析完成原始reads過濾、拼接和組裝后用R語言的軟件包：edgeR，可以得到實驗組和對照組基因差異表達情況，F(xiàn)DR與log2FC為篩選差異基因參數(shù)，篩選條件為FDR<0.05且|log2FC|>1，滿足條件即為顯著性差異表達基因，結(jié)果見表3。

表3 差異基因數(shù)目統(tǒng)計Table 3 Number of differentially expressed genes

2.2.3差異基因注釋在得到差異基因后，對其進行GO富集分析。GO是通用的基因功能分類體系，用來全面描述基因和基因產(chǎn)物的屬性。GO共有3個本體(ontology)，分別描述基因的分子功能、細胞組分、參與的生物過程(Ashburneretal.，2000)。通過GO富集分析可以得到的差異基因富集情況如圖2。

富集結(jié)果表明：康復(fù)新液、精粉2個實驗組，差異基因主要富集于生物學(xué)過程中的胞間信號、發(fā)育過程；細胞成分中的細胞外組分；分子功能中的結(jié)構(gòu)分子激活。暗示這2種藥物可能共同作用于上面4個GO term中的基因。結(jié)合已發(fā)表的文獻，篩選出3個與創(chuàng)面愈合相關(guān)的關(guān)鍵基因：表皮調(diào)節(jié)素(Ereg)、Gli-Kruppel家族成員Gli2(Gli2)、表皮型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3(Tgm3)。

2.2.4差異基因KEGGpathway富集為了進一步了解藥物作用的信號通路，將差異基因進行KEGG pathway富集。KEGG是一個綜合數(shù)據(jù)庫，通過它可以將基因和細胞生化過程聯(lián)系起來(Kanehisa & Goto，2000)。實驗組差異基因富集顯著性最高的10個通路詳見表4。

結(jié)果表明，康復(fù)新液影響最顯著的通路為細胞因子受體相互作用。已有實驗表明這條通路上基因在皮膚創(chuàng)傷早期表達量變化明顯(Royetal.，2008)。

第二條通路為趨化因子信號途徑，該通路可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和傷口愈合(Martin & Leibovich，2005)。PPAR信號通路中基因缺失會導(dǎo)致傷口愈合延遲(Michalik & Wahli，2006)。在精粉實驗組中，變化最明顯的通路是花生四烯酸代謝?；ㄉ南┧崾荘GE2的前體，而PGE2能刺激傷口愈合(Lietal.，2010)。精粉也能調(diào)控細胞因子受體相互作用通路從而影響傷口的愈合。其他通路與傷口愈合的聯(lián)系有待進一步研究。

2.3Q-PCR驗證實驗

加藥3 d后提取傷口皮膚組織RNA，利用Q-PCR技術(shù)檢測對照組和實驗組中3個關(guān)鍵基因的表達情況。

Q-PCR結(jié)果如圖3，這3個基因在實驗組中均高表達。已有研究表明，這幾個基因高表達能促進傷口的愈合。Ereg在精粉實驗組中表達量最高，這和前期觀察到精粉組創(chuàng)面愈合最快的結(jié)果相符。

圖2 差異基因GO富集Fig. 2 GO enrichment analysis for DEGs

3 討論

轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的必要紐帶，轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)成為揭示生物生長發(fā)育調(diào)控和逆境脅迫適應(yīng)機制、生物進化規(guī)律、疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制以及發(fā)現(xiàn)致病基因調(diào)控關(guān)鍵靶點等方面的最佳研究手段。通過轉(zhuǎn)錄組分析，找出在加藥組中顯著性差異(FDR≤0.05)表達的基因。精粉組和對照組相比：有545個基因差異表達，其中在精粉組中表達量升高的有421個，表達量降低的有124個；康復(fù)新液組和對照組相比：差異基因總數(shù)為938個，高表達739個，低表達199個。

結(jié)合已發(fā)表的文獻，從2組共同的差異性表達基因中篩選出了3個與創(chuàng)面愈合相關(guān)的關(guān)鍵基因：Ereg、Tgm3和Gli2。Ereg是表皮調(diào)節(jié)素家族中的一員，而表皮調(diào)節(jié)素在皮膚損傷愈合中是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)基因。Ereg可以通過增加細胞增殖和遷移來加快體外傷口的愈合，而且Ereg加速傷口愈合的效率比2種公認(rèn)的促進傷口愈合因子：表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子a更高(Draperetal.，2003)。這表明Ereg可能在美洲大蠊提取物促進傷口愈合中發(fā)揮著重要作用。此外，有實驗顯示Ereg還與炎癥反應(yīng)、肝祖細胞生長和結(jié)腸炎相關(guān)的腫瘤細胞生長等方面相關(guān)(Zhangetal.，2012；Neufertetal.，2013；Tomitaetal.，2014)。因此，Ereg的作用值得深入研究。Tgm3對皮膚功能的完整有重要貢獻，在表皮角質(zhì)化包膜形成過程中參與結(jié)構(gòu)蛋白的交聯(lián)。Tgm3缺陷小鼠中，皮膚炎癥會增加(Bognaretal.，2014)。Gli2是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與Hn信號通路的調(diào)節(jié)，已有實驗表明Gli2能促進細胞增殖(Panetal.，2009)。

表4 差異基因KEGG pathway富集Table 4 KEGG pathway enrichment results

圖3 Q-PCR檢測關(guān)鍵基因表達量Fig. 3 Key genes expression in wound tissues

Q-PCR結(jié)果進一步證實在創(chuàng)傷組織中Gli2、Ereg、Tgm3這3個基因在實驗組中均高表達，其中Ereg在精粉組中表達量最高，而Ereg高表達可以促進細胞增殖，暗示前期觀察中精粉組結(jié)痂速度快，可能與Ereg表達量高有關(guān)。這表明了2種美洲大蠊提取物：康復(fù)新液、精粉都能提高傷口組織中Ereg、Gli2、Tgm3這3個參與傷口愈合分子通路的基因的表達量，從而加速皮膚傷口的愈合。此外，精粉為美洲大蠊干燥后磨成的粉末，擦藥后會覆蓋在傷口表面，還可以阻止外來細菌等有害微生物的侵襲，提供了傷口修復(fù)過程中細胞遷移的路徑等。

近年來，對美洲大蠊的藥物作用機制已有一些相關(guān)研究。譚巧云等(2016)的研究表明，美洲大蠊提取物可以降低機體的炎癥因子(CD3+、CD4+和CD8+)水平和通過IL-2調(diào)節(jié)免疫功能，加快大鼠口腔黏膜愈合。楊勝群等(2016)認(rèn)為美洲大蠊水提取物可能調(diào)控TGF-β1的釋放促進傷口愈合又避免形成瘢痕。曾娟妮等(2016)實驗表明美洲大蠊提取液能提高傷口VEGF表達量來促進創(chuàng)面愈合。目前，對美洲大蠊促進創(chuàng)面愈合的分子機制了解仍然很少，而本文基于小鼠創(chuàng)面愈合模型，初步探討了其中的分子機制?；赗NA-seq分析技術(shù)，篩選了3個與美洲大蠊促進創(chuàng)面愈合相關(guān)的關(guān)鍵基因。本文結(jié)果表明，美洲大蠊提取物——康復(fù)新液、精粉能通過刺激傷口組織中3個關(guān)鍵基因：Gli2、Ereg、Tgm3加速傷口愈合。本研究結(jié)果可為美洲大蠊臨床研究及深入開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

致謝：本實驗得到四川好醫(yī)生藥業(yè)集團的大力支持，在此致以最誠摯的謝意！

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RegulatoryMolecularMechanismofPeriplanetaamericanaExtractsonWoundHealingUsingRNA-seq

CHEN Jiasong1，2，3， CHEN Feng1，2，3， PENG Rui1，2，3， GENG Funeng3*， ZOU Fangdong1，2，3*

(1. College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610064， China；2. Sichuan Engineering Research Center for Medicinal Animals， Chengdu 610064， China；3. Sichuan Key Laboratory for Medicinal American Cockroach， Chengdu 610064， China)

Periplanetaamericanais a traditional Chinese medicine， and its extracts have been widely used in the treatment of wound in clinic. However， the molecular mechanism is poorly understood. In this study， to investigate the regulatory mechanism ofP.americanaextracts on wound healing， a mouse model with excision wound was constructed to assess the efficacy ofP.americanaextracts on wound therapy. A total of 9 mice were randomly divided into 3 groups： control group (treated with 75% ethanol solution) and 2P.americanaextracts treated groups (Kangfuxin and Jingfen)， respectively. RNA-seq was used to screen the key genes in wound skin tissues on day 3. Furthermore， real-time quantitative PCR was performed to confirm the expression of key genes. The results showed that bothP.americanaextracts could accelerate wound healing. RNA-seq analyses showed that， comparison to the control group， a total of 545 differentially expressed genes (DEGs) were identified in Jingfen treated group and 938 DEGs in Kangfuxin treated group. Bioinformatics analysis revealed that 3 key genes， includingEreg，Gli2 andTgm3， may play important roles in wound healing during the treatment ofP.americanaextracts. Q-PCR experiments further confirmed thatEreg，Gli2 andTgm3 were up-regulated after the treatment of bothP.americanaextracts. Collectively， our results indicated that the extracts ofP.americanamay accelerate wound healing by regulatingEreg，Gli2 andTgm3 expression.

Periplanetaamericana； wound healing； RNA-seq； key genes

2017-03-31接受日期：2017-05-09

陳佳松(1991—)， 男， 碩士研究生， 研究方向為細胞生物學(xué)， E-mail：chenjiasong91@qq.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：haoyishenggfn@126.com； fundzou@scu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20170106

Q95-33； Q786

： A

： 1000-7083(2017)04-0398-06